何謙　熊驥　曹鈺　龐路人

(四川大學(xué)華西醫(yī)院急診科， 四川 成都 610041)

·論著·

EGCG通過減少線粒體DNA水平減輕百草枯導(dǎo)致急性肺損傷的實(shí)驗(yàn)研究*

何謙熊驥曹鈺龐路人

(四川大學(xué)華西醫(yī)院急診科， 四川 成都 610041)

【摘要】目的研究沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)對(duì)百草枯導(dǎo)致急性肺損傷保護(hù)作用的機(jī)制。方法選用60只清潔級(jí)Ⅱ級(jí)健康SD雄性大鼠分別建立對(duì)照組、百草枯組(PQ組)和PQ+EGCG干預(yù)組(PQ+EGCG組)，每組各20只。24小時(shí)后分別取各組大鼠的肺泡灌洗液、肺組織進(jìn)行肺組織干濕重比、肺泡灌洗液中mtDNA、TNF-α和IL-6測(cè)定以及肺組織HE染色。結(jié)果百草枯組肺泡灌洗液中mtDNA、TNF-α和IL-6明顯升高，而經(jīng)過EGCG預(yù)處理后，3項(xiàng)指標(biāo)均明顯下降(均P<0.05)。肺組織干濕重比和病理評(píng)分在百草枯組明顯升高，說明肺組織出現(xiàn)明顯炎性浸潤；而在PQ+EGCG組中均明顯降低(均P<0.05)。結(jié)論本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，EGCG可以通過保護(hù)線粒體、減少mtDNA釋放，降低百草枯導(dǎo)致的肺組織炎癥反應(yīng)水平，同時(shí)為百草枯導(dǎo)致急性肺損傷的機(jī)制研究和治療提出了一個(gè)新的理論基礎(chǔ)。

【關(guān)鍵詞】沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)；急性肺損傷；線粒體DNA；炎癥反應(yīng)

百草枯是一種廣泛應(yīng)用的有機(jī)雜環(huán)類除草劑，具有效果好、價(jià)格低的特點(diǎn)。目前市面上流通的主要是濃度20%的百草枯，由于其極高的毒性，許多人由于誤服百草枯或服用百草枯自殺，病死率可達(dá)到50%～90%，并且伴有極其嚴(yán)重的肺、腎、胰臟并發(fā)癥[1-3]。目前對(duì)百草枯中毒的機(jī)制尚不明確，也沒有特效解毒藥物。有關(guān)百草枯引起的急性肺損傷機(jī)制也尚不清楚。但很多研究顯示，嚴(yán)重的局部炎癥反應(yīng)在百草枯引起的急性肺損傷中發(fā)揮了重要作用[4]。

線粒體DNA(mtDNA)是一種特殊的損傷相關(guān)分子模式(damage associatedmolecularpatterns，DAMP[5,6]。最近有大量文獻(xiàn)報(bào)道，在各種組織損傷過程中有mtDNA的釋放，并且循環(huán)mtDNA的含量與組織損傷程度呈正相關(guān)[7,8]。同時(shí)mtDNA作為古細(xì)菌在真核生物中的內(nèi)共生產(chǎn)物，具有未甲基化的CpG片段，可以引起機(jī)體的炎癥反應(yīng)[9]。沒食子兒茶素沒食子酸酯(Epigallocatechin-3-gallate, EGCG)是綠茶的提取物，具有抗氧化、抗炎活性[10, 11]。本研究旨在揭示mtDNA在百草枯導(dǎo)致急性肺損傷中的作用，以及研究EGCG是否可以通過減少mtDNA而保護(hù)百草枯急性中毒導(dǎo)致的急性肺損傷。

1材料及方法

1.1動(dòng)物分組及模型建立將清潔級(jí)Ⅱ級(jí)健康雄性SD大鼠60只(體重250～300g，購自四川大學(xué)華西實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)，分別建立對(duì)照組、百草枯組(PQ組)和PQ+EGCG干預(yù)組(CPQ+EGCG組)各20只。百草枯組大鼠經(jīng)腹腔注射20%PQ液30mg/kg(英國捷利康有限公司)，建立PQ急性中毒模型；為了保證EGCG達(dá)到最低血藥濃度，EGCG+PQ組大鼠在腹腔注射PQ前2小時(shí)通過腹腔注射EGCG 4.0mg/kg進(jìn)行預(yù)處理；對(duì)照組注射等量無菌生理鹽水。

1.2肺泡灌洗液(BALF)獲取和肺組織病理學(xué)檢查建立動(dòng)物模型24小時(shí)后，通過腹腔注射1%戊巴比妥鈉麻醉實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，開胸，暴露氣管及肺，用套管針插入左支氣管并固定，拔出針芯后用2ml生理鹽水灌洗左肺，然后緩慢回抽，如此反復(fù)3次，收集3次的灌洗液，回收率約75%。同時(shí)取出右上肺，于福爾馬林中固定24小時(shí)后常規(guī)石蠟包埋、切片，行HE染色，觀察肺組織病理改變情況。

1.3實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)測(cè)定肺泡灌洗液中mtDNA濃度使用DNA提取試劑盒(美國Qiagen公司)提取BALF中全部DNA。嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，最終將DNA溶解于200μl DNA溶解液中[11]。BALF中mtDNA測(cè)定基于SYBR-Green染色的熒光定量PCR技術(shù)，步驟為：初始階段50 ℃，2 分鐘；第一步變性溫度為95 ℃，3 分鐘；進(jìn)行95℃ 10秒、55 ℃ 15秒和72 ℃ 10秒，共39個(gè)循環(huán)。標(biāo)準(zhǔn)曲線為攜帶有人類mtDNA的質(zhì)粒(美國ORIGENE公司) 10 倍梯度稀釋獲得。mtDNA濃度使用標(biāo)準(zhǔn)的轉(zhuǎn)換系統(tǒng)轉(zhuǎn)換成拷貝數(shù)(copies)。BALFmtDNA濃度的計(jì)算公式為：c=Q*VDNA/VPCR*1/VEXT。其中c 為BALF中mtDNA 的濃度，Q 為熒光定量PCR 檢測(cè)的樣本中mtDNA 的拷貝數(shù)，VDNA為每個(gè)BALF樣本中提取DNA 的總體積，本研究中為200μl；VPCR代表熒光定量PCR 時(shí)加入DNA 的體積，本研究中為1 μl；VEXT代表提取DNA 時(shí)使用的BALF的量，本實(shí)驗(yàn)中為50 μl。

1.4TNF-α、IL-6測(cè)定肺泡灌洗液中TNF-α、IL-6分別采用相應(yīng)的試劑盒(索萊寶，北京)進(jìn)行測(cè)定，所有步驟均嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。

1.5肺干濕重比(DWR)檢測(cè)開胸取右下肺組織，稱重后置80℃烤箱烘烤48小時(shí)，干燥至恒重。肺干濕比=濕重/干重。

1.6肺組織損傷評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)在處死動(dòng)物后取得的肺病理切片中，對(duì)鏡下肺組織的以下5種病理改變進(jìn)行綜合評(píng)估：肺泡腔壁水腫增厚、肺泡內(nèi)出血、中性粒細(xì)胞浸潤肺泡腔或浸潤肺泡壁及肺泡壁透明膜形成。根據(jù)每項(xiàng)有無指標(biāo)病變，進(jìn)行評(píng)分(0=無病變，1=有病變)，累加各項(xiàng)評(píng)分的總分作為肺病理損傷評(píng)分， 0分為正常肺組織，5分為損傷最嚴(yán)重的肺組織。

2結(jié)果

2.1各組大鼠BALF中mtDNA及炎癥因子水平PQ組BALF中mtDNA顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，PQ+EGCG組BALF中mtDNA水平較PQ組顯著降低(均P<0.05)。PQ組BALF中TNF-α、IL-6顯著高于對(duì)照組(均P<0.05)，PQ+EGCG組BALF中mtDNA水平較PQ組顯著降低(P<0.05)，見表1。

表1　各組大鼠BALF中mtDNA及炎癥因子水平比較

注：與對(duì)照組比較，①P<0.05;與PQ組比較，②P<0.05

2.2各組大鼠肺干濕重比情況PQ組肺干濕重比顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，PQ+EGCG組肺干濕重比較PQ組顯著降低(P<0.05)，見表2。

2.3各組大鼠肺組織病理改變情況PQ組較對(duì)照組肺組織出現(xiàn)肺泡壁組織水腫、肺間質(zhì)出血以及中性粒細(xì)胞浸潤等典型肺損傷的病理結(jié)構(gòu)改變，PQ+EGCG組出現(xiàn)肺組織病理損傷程度較PQ組顯著改善；PQ組肺病理評(píng)分顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，PQ+EGCG組肺病理評(píng)分較PQ組顯著降低(P<0.05)，見圖1。

表2　各組大鼠肺干濕重比較±s)

注：與對(duì)照組比較，①P<0.05；與PQ組比較，②P<0.05

圖1各組肺病理改變情況

Figure 1Pathological changes of lung tissue

注：PQ組(B)肺損傷程度明顯較對(duì)照組(A)嚴(yán)重，EGCG+PQ組(C)肺病理損傷程度較PQ組(B)減輕

2.4各組大鼠肺組織損傷程度按損傷肺組織病理評(píng)分評(píng)定肺損傷程度，結(jié)果見表3。

表3　各組大鼠肺損傷程度比較±s)

注：與對(duì)照組比較，①P<0.05；與PQ組比較，P<0.05

3討論

在本研究中我們發(fā)現(xiàn)，百草枯引起大鼠急性肺損傷主要以彌漫性肺泡損傷為特征性表現(xiàn)，肺組織HE染色可見肺泡壁增厚、破損，同時(shí)大量炎性細(xì)胞浸潤，肺組織干濕重比明顯升高。進(jìn)一步肺泡灌洗液檢查發(fā)現(xiàn)，炎癥因子TNF-α、IL-6和mtDNA的表達(dá)明顯增加。本研究還首次發(fā)現(xiàn)，在百草枯導(dǎo)致大鼠急性肺損傷之肺泡灌洗液中mtDNA含量明顯升高。在預(yù)先給予EGCG處理后，大鼠急性肺損傷程度明顯減輕，肺泡灌洗液中mtDNA和炎癥因子水平明顯下降。

EGCG是綠茶中的主要活性成分，具有強(qiáng)大的抗氧化、消除活性氧集團(tuán)和抗炎性作用，大量研究顯示，其抗炎性作用主要是通過抑制細(xì)胞內(nèi)NF-κB介導(dǎo)的炎性信號(hào)通路[12-15]。本研究結(jié)果顯示，在EGCG預(yù)處理情況下，肺泡灌洗液中的3種炎癥因子表達(dá)水平出現(xiàn)明顯下降，同時(shí)肺組織HE染色顯示肺組織水腫程度降低，炎性細(xì)胞浸潤減少，肺組織干濕重比水平下降。說明EGCG確實(shí)可以降低百草枯導(dǎo)致的急性肺組織炎性反應(yīng)，改善急性肺損傷程度。但是對(duì)于EGCG保護(hù)作用的機(jī)制仍不清楚，需要進(jìn)一步研究。

目前有文獻(xiàn)報(bào)道EGCG的抗氧化作用[16]，線粒體作為細(xì)胞內(nèi)能量供應(yīng)的細(xì)胞器，其功能損傷和異常極易導(dǎo)致電子傳遞鏈的中斷，引起活性氧集團(tuán)的大量產(chǎn)生而進(jìn)一步損傷細(xì)胞。mtDNA的釋放被認(rèn)為是發(fā)生在線粒體氧化應(yīng)激損傷之后，表現(xiàn)為線粒體的嚴(yán)重水腫，部分mtDNA發(fā)生水解，通過線粒體膜上的通透性孔道釋放[17]。本研究百草枯所致急性肺損傷中肺泡灌洗液的mtDNA水平明顯升高，說明肺泡上皮細(xì)胞出現(xiàn)嚴(yán)重的線粒體損傷，mtDNA從線粒體中逐漸被釋放到肺間質(zhì)中。而EGCG預(yù)處理后，mtDNA水平明顯下降，表明EGCG可能作用于線粒體，減輕線粒體的氧化應(yīng)激損傷并穩(wěn)定線粒體膜，減少mtDNA釋放到細(xì)胞外。

目前有大量研究表明，循環(huán)mtDNA可以激發(fā)炎癥介質(zhì)的大量釋放并導(dǎo)致全身炎癥反應(yīng)，它可在體外引起神經(jīng)元細(xì)胞和膠質(zhì)細(xì)胞炎癥因子的釋放[18, 19]，刺激人外周血單核細(xì)胞系THP-1釋放大量IL-6和TNF-α[20]。此外，mtDNA的釋放也可以刺激體內(nèi)白細(xì)胞的活化，觸發(fā)一系列炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)[21]。結(jié)合我們的研究結(jié)果，我們認(rèn)為釋放到細(xì)胞外的mtDNA在百草枯導(dǎo)致的急性肺損傷中發(fā)揮了重要作用。在EGCG預(yù)處理后，肺泡灌洗液中mtDNA水平和炎性因子表達(dá)水平均明顯下降，說明在減少mtDNA的釋放后，炎癥反應(yīng)水平也相應(yīng)下降，EGCG同時(shí)具有抗炎和抗氧化的作用。因此，我們有理由相信，EGCG可以部分通過穩(wěn)定線粒體，減少mtDNA的釋放來發(fā)揮其抗炎作用。

4結(jié)論

我們的研究發(fā)現(xiàn)，EGCG可以通過保護(hù)線粒體，減少mtDNA的釋放，從而降低肺組織炎癥反應(yīng)水平。結(jié)合肺組織病理切片和肺組織干濕重比分析，我們認(rèn)為，EGCG對(duì)于百草枯導(dǎo)致的急性肺損傷可以發(fā)揮有效地保護(hù)作用。因此，我們的研究為EGCG抗氧化、抗炎作用的機(jī)制提供了新的思路，也為百草枯導(dǎo)致急性肺損傷的機(jī)制研究和治療提出了一個(gè)新的理論基礎(chǔ)。

【參考文獻(xiàn)】

[1]呂利雄, 陳怡, 歸茜, 等.急性百草枯中毒：挑戰(zhàn)與對(duì)策[J]. 中華勞動(dòng)衛(wèi)生職業(yè)病雜志， 2009, 27(4):247-248.

[2]史晶, 高渝峰, 黃澎, 等.急性百草枯中毒致多器官功能障礙綜合征的臨床分析[J]. 中華勞動(dòng)衛(wèi)生職業(yè)病雜志, 2011, 29(7):519-521.

[3]Cheng-Hao W, Ching-Chih H, Ja-Liang L,etal. Sequential Organ Failure Assessment Score Can Predict Mortality in Patients with Paraquat Intoxication[J]. Plos One 2012, 7(12):1411-1411.

[4]Khalighi Z, Rahmani A, Cheraghi J,etal. Perfluorocarbon attenuates inflammatory cytokines, oxidative stress and histopathologic changes in paraquat-induced acute lung injury in rats.[J]. Environmental Toxicology & Pharmacology, 2016, 42:9-15.

[15Simmons JD, Lee YL, Mulekar S,etal. Elevated levels of plasma mitochondrial DNA DAMPs are linked to clinical outcome in severely injured human subjects[J]. Annals of surgery 2013, 258(Issue):591-596, discussion 96-98.

[6]Sun S, Sursal T, Adibnia Y,etal. Mitochondrial DAMPs increase endothelial permeability through neutrophil dependent and independent pathways[J]. PloS one， 2013, 8(3):e59989. doi:10.1371/journal.pone.0059989.

[7]Mittra I, Nair NK, Mishra PK. Nucleic acids in circulation: are they harmful to the host[J]. Journal of biosciences, 2012, 37(2):301-312.

[8]Ding Z, Liu S, Wang X,etal. Oxidant stress in mitochondrial DNA damage, autophagy and inflammation in atherosclerosis[J]. Scientific reports, 2013, 3(1):1077.

[9]Zhang Q, Raoof M, Chen Y,etal. Circulating mitochondrial DAMPs cause inflammatory responses to injury[J]. Nature, 2010, 464(7285):104-107. doi:10.1038/nature08780.

[10] Singh R, Akhtar N, Haqqi TM. Green tea polyphenol epigallocatechin-3-gallate: inflammation and arthritis[J]. Life Sciences, 2010, 86(25-26):907-918.

[11] 秦超毅, 古君, 錢宏, 等.體外循環(huán)圍手術(shù)期血液中線粒體DNA濃度變化[J]. 中國胸心血管外科臨床雜志, 2015,(3):241-244.

[12] Xiao J, Chi TH, Liong EC,etal. Epigallocatechin gallate attenuates fibrosis, oxidative stress, and inflammation in non-alcoholic fatty liver disease rat model through TGF/SMAD, PI3 K/Akt/FoxO1, and NF-kappa B pathways[J]. European Journal of Nutrition, 2013, 53(1):187-199.

[13] Al-Maghrebi M, Renno WM, Al-Ajmi N. Epigallocatechin-3-gallate inhibits apoptosis and protects testicular seminiferous tubules from ischemia/reperfusion-induced inflammation[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2012, 420(2):434-439.

[14] Esther M, Miguel Angel M, Francisca SJ,etal. Targeting of histamine producing cells by EGCG: a green dart against inflammation[J]. Journal of Physiology & Biochemistry, 2010, 66(3):265-270.

[15] Giakoustidis DE, Giakoustidis AE, Iliadis S,etal. Attenuation of liver ischemia/reperfusion induced apoptosis by epigallocatechin-3-gallate via down-regulation of NF-kappaB and c-Jun expression[J]. J Surg Res, 2010, 159(2):720-728.

[16] Chen WC, Hsieh SR, Chiu CH,etal. Molecular identification for epigallocatechin-3-gallate-mediated antioxidant intervention on the H2O2-induced oxidative stress in H9c2 rat cardiomyoblasts[J]. Journal of Biomedical Science, 2014, 21(1):793-807.

[17] Noemí G, García JJ, Francisco C,etal. The permeability transition pore as a pathway for the release of mitochondrial DNA[J]. Life Sciences, 2005, 76(24):2873-2880.

[18] Wilkins HM, Carl SM, Weber SG,etal. Mitochondrial lysates induce inflammation and Alzheimer′s disease-relevant changes in microglial and neuronal cells[J]. Journal of Alzheimers Disease Jad, 2015, 45(1):305-318..

[19] Cao H, Ye H, Sun Z,etal. Circulatory mitochondrial DNA is a pro-inflammatory agent in maintenance hemodialysis patients[J]. PloS one, 2014, 9(12):e113179. doi:10.1371/journal.pone.0113179.

[20] Hongdi C, Hong Y, Zhiping S,etal. Circulatory Mitochondrial DNA Is a Pro-Inflammatory Agent in Maintenance Hemodialysis Patients[J]. Plos One, 2014, 9(12):e113179.

[21] Boudreau LH, Anne-Claire D, Nathalie C,etal. Platelets release mitochondria serving as substrate for bactericidal group IIA-secreted phospholipase A(2) to promote inflammation[J]. Blood, 2014, 124(14):2173-2183.

Epigallocatechin-3-gallate protects paraquat-induced acute lung injury through inhibiting the release of mitochondrial

DNAHE Qian,XIONG Ji，CAO Yu,et al

(DepartmentofEmergency，WestChinaHospital，SichuanUniversity，Chengdu610041,China)

【Abstract】ObjectiveTo study the mechanism of the protective effects of epigallocatechin-3-gallate (EGCG) on paraquat-induced acute lung injury. Methods60 SD rats were divided into the control group, paraquat(PQ) group and PQ+EGCG group. After 24 h, broncho-alveolar lavage fluid (BALF) and lung tissue were collected to measure levels of mtDNA, TNF-α and IL-6, and wet/dry ratio and HE staining, respectively. ResultsOur data showed that levels of mtDNA, TNF-α and IL-6 elevated in PQ group, which could be inhibited by EGCG(P<0.05). Wet/dry ratio and pathological score of PQ group were higher than that of the control group, which could be also inhibited by EGCG(P<0.05). ConclusionWe find that EGCG can protect paraquat-induced acute lung injury through inhibiting the release of mtDNA. Meanwhile, we also provide a novel theory for understanding and treating paraquat-induced acute lung injury.

【Key words】Epigallocatechin-3-gallate; Acute lung injury; Mitochondrial DNA; Inflammatory responses

基金項(xiàng)目:國家自然科學(xué)基金(0040205401B83)

通訊作者：曹鈺，教授，本刊常務(wù)編委，E-mail：yuyuer@126.com

【中圖分類號(hào)】R-33

【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A

doi：10.3969/j.issn.1672-3511.2016.06.005

(收稿日期：2016-03-29； 編輯： 母存培)