蘇　文, 劉艷環(huán), 王漫卓, 馬國棟

(山東理工大學 體育學院，山東 淄博 255049)

預耐力訓練預防急性酒精性肝損傷

——肝臟抗氧化能力與線粒體解偶聯關系的研究

蘇文, 劉艷環(huán), 王漫卓, 馬國棟

(山東理工大學 體育學院，山東 淄博 255049)

摘要：為了研究預耐力訓練對急性酒精性肝損傷肝臟抗氧化能力與解偶聯關系的影響，以SD大鼠建立急性酒精性肝損傷模型，以12周無負重游泳為運動手段，測定肝臟線粒體錳過氧化物歧化酶(Manganese superoxide dismutase，MnSOD)活性及線粒體三磷酸腺苷(Adenosine Triphosphate，ATP)合成活力，肝臟線粒體磷氧比(Phosphorus oxygen ratio，P/O)的變化和肝臟組織MnSOD、解偶聯蛋白2(Uncoupling protein 2,UCP2)和肝細胞癌下調的線粒體轉運蛋白(HCC-down-regulated mitochondrial carrier protein，HDMCP)mRNA表達.結果發(fā)現：未訓練大鼠急性酒精攝入導致肝臟MnSOD酶活性、MnSOD、UCP2和HDMCP mRNA表達著升高，而ATP合成活力和P/O顯著降低；預耐力訓練后再給予急性酒精攝入使肝臟UCP2和HDMCPmRNA表達均顯著低于直接急性酒精攝入大鼠，而肝臟線粒體P/O和MnSODmRNA表達均顯著高于直接酒精攝入大鼠.結論：耐力訓練可以有效提高肝臟抗氧化能力，降低解偶聯蛋白表達，從而提高肝臟線粒體能量合成能力，達到預防急性酒精性肝損傷的目的.

關鍵詞：預耐力訓練；急性酒精性肝損傷；抗氧化能力；解偶聯作用

酒精性肝病是世界范圍內倍受關注的公共衛(wèi)生問題.酒精性肝病包括從酒精性脂肪肝、酒精性肝炎到酒精性肝纖維化，而且部分會發(fā)展成為肝癌[1].據估計，全球死亡人數的3.2%與酒精有關[2].在美國死于肝病的人50%與酒精有關，在可預防的引起死亡的因素中，過量酒精攝入列第三位[3].我國尚缺乏全國性大規(guī)模酒精性肝病的流行病學調查資料，但各地一些相關的流行病學調查提示酒精性肝病發(fā)病率呈逐年上升趨勢，有些地區(qū)在20年內甚至上升了70倍[4].我國作為酒的消費大國，酒精所致的肝臟損害已經成為一個不容忽視的嚴重的公共衛(wèi)生問題.在日常飲酒的過程中，常常會出現急性大量飲酒的現象，而這常常會導致急性酒精性肝損傷，其中肝臟線粒體的氧化損傷是最為常見的損傷.線粒體平衡氧化損傷的方式主要存在兩種方式：一是通過抗氧化酶或非酶類物質消除活性氧；二是通過溫和解耦聯的方式降低活性氧的產生[5].急性酒精性肝損傷發(fā)病過程中，這兩種機制如何發(fā)揮作用？兩者的關系如何？都是值得深入研究的問題.研究證實，耐力訓練提高肝臟抗氧化能力[6]，改善肝臟線粒體結構[7]，逆轉肝臟線粒體功能異常[8].運動訓練可顯著逆轉酒精引起的抗氧化能力降低[9]，我們研究也發(fā)現，預運動訓練可以顯著降低急性酒精攝入導致的肝臟損傷[10]，但其機理尚不完全清楚.那么預訓練后，急性酒精性肝損傷過程中，這兩種機制的關系如何？這方面的研究罕見報道.本研究擬在此方面進行探討，以期為進一步了解急性酒精性肝損傷以及耐力訓練對急性酒精性肝損傷的影響提供實驗依據.

1材料與方法

1.1實驗設計

隨機將SD大鼠(6周齡，48只)分為4組：(1)對照組(C，N=12)；(2)12周運動組(E，N=12)；(3)12周運動+5天酒精攝入組(EA，N=12)；(4)對照組+5天酒精灌胃組(CA，N=12).在實驗結束時，大鼠禁食12h，然后麻醉處死，取肝臟以備用于測試各種所需指標.

1.2耐力訓練模型

采用無負重游泳訓練,水溫(29 ±2) ℃，第1周運動0.5 h /次，第2周1h/次，從第3周開始1.5 h/次 ,每周運動5次，共運動12周.

1.3急性酒精性肝損傷模型

參照文獻，按0.8ml/ 100g體重給予大鼠灌胃(紅星二鍋頭酒，56度)，每天上午灌胃兩次,間隔1h；對照組給予相同體積的生理鹽水灌胃，連續(xù)5d.

1.4肝臟樣本制備與線粒體提取

大鼠處死后，迅速取肝臟，剪取2g，用冰浴的生理鹽水沖洗，然后剪碎，加入10mL冰浴的生理鹽水，電動勻漿器勻漿，低溫離心機下離心10min(600g)，取上清液，然后10000g離心10min，將沉淀用約2mL冰浴生理鹽水懸浮，懸浮液為線粒體.

1.5指標測定

1.5.1測定肝臟線粒體TBARS水平和MnSOD活性

參照文獻[5]，測定提取肝臟線粒體TBARS的水平；

MnSOD酶活性測定，采用南京建成生物工程研究所的試劑盒進行測定，測定過程中嚴格按照試劑盒操作說明進行操作.

1.5.2線粒體ATP合成活力的測定

利用熒光素-熒光素酶發(fā)光法[4]，測定線粒體ATP合成活力.

1.5.3測定線粒體P/O比

根據參考文獻[12]，用Clark氧電極測定密閉反應系統(tǒng)中線粒體氧耗的速率，用以確定線粒體的P/O.

1.5.4RT-PCR半定量法測定肝臟組織MnSOD、UCP2和HDMCP mRNA表達

以上述的肝臟組織， 用Trizol Reagent試劑盒(Mrcgene產品)與逆轉錄試劑盒(Ferment產品)參照說明書進行逆轉錄反應，以備用于MnSOD、UCP2和HDMCP mRNA的擴增.引物為：

MnSOD上游5’-GCGACCTACGTGAACAATCTGAACG-3,下游5’ -TCAATCCCCAGCAGTGGAATAAGGC-3’

HDMCP:上游 5’ -GCCACTCCTTTGCCACCTAC -3’,下游：5’- CACAGCCTCATAAGCCACGA -3’;

UCP2:上游5‘CCTTCTGCACTCCTGTGTTC -3’, 下游5’- GTGGCCTTGAAACCAACCAT -3’;

GAPDH：上游： 5’-CCTTCATTGACCTCAACTACAT-3’，下游：5’-CCAAAGTTGTCATGGATGACC-3’

1.6統(tǒng)計學分析

2結果

2.1肝臟線粒體MnSOD活性與TBARS含量

如表1 所示：肝臟線粒體MnSOD活性E、CA和EA組均顯著高于C組，CA組顯著低于E組，EA組顯著高于E組和CA組；肝臟線粒體TBARS含量E組顯著低于C組，而CA組和EA組顯著高于C組，CA組和EA組顯著高于E組，EA組顯著低于CA組.

組別C組E組CA組EA組MnSOD活性/(U/mg)8.12±2.1318.43±4.25**13.24±3.87*$26.14±5.67**$#TBARS含量/nmol/(mg·pro)2.61±0.411.49±0.25*4.17±0.68**$$3.56±0.74*$$#

注：與C組比較：*p<0.05,**<0.01,***<0.001；與E組比較：$p<0.01,$$p<0.001；與CA組比較：#p<0.01

組別C組E組CA組EA組ATP合成活力/nmol/(min·mg·pro)9.68±2.1415.03±3.22**6.37±1.86*$10.01±2.06$#P/O2.14±0.142.52±0.29*1.610±0.16*$1.92±0.17*$#

組別C組E組CA組EA組MnSOD1.31±0.222.38±0.55**1.84±0.33*$3.16±0.61**$##UCP20.39±0.040.21±0.01*0.77±0.06**$$0.41±0.04$$#HDMCP1.01±0.120.54±0.08**1.61±0.27**$$0.89±0.09$#

注：與C組比較：*p<0.05,**<0.01；與E組比較：$p<0.05,$$p<0.01；與CA組比較：#p<0.05,##p<0.01.

2.2肝臟線粒體ATP合成活力與P/O

線粒體ATP合成活力E組顯著高于C組，CA組顯著低于C組，EA組與C組未見顯著性差異，CA組和EA組顯著低于E組，EA組顯著高于CA組；肝臟線粒體P/O，E組顯著高于C組，而CA組和EA組均顯著低于C組，CA組和EA組均顯著低于E組，EA組顯著高于CA組.

2.3肝臟組織MnSOD、UCP2和HDMCP mRNA表達

如表3所示：肝臟MnSODmRNA表達，E組、CA組和EA組均顯著高于C組，CA組顯著低于E組，EA組顯著高于E組和CA組；UCP2和HDMCPmRNA表達表現出相同的變化規(guī)律，E組顯著低于C組，CA組顯著高于C組，EA組與C組未見顯著性差異，CA組和EA組均顯著高于E組，EA組顯著低于CA組.

3討論

線粒體是細胞內主要活性氧的來源，線粒體產生的活性氧一方面起到信號分子的作用，另一方面也會因大量的產生而導致線粒體的氧化損傷.在生物進化的過程中，線粒體形成了一套精密的抗氧化體系.目前，多數研究者認為，線粒體通過兩種方式達到保護線粒體免受氧化損傷的目的.一方面通抗氧化系統(tǒng)(包括非酶類和抗氧化酶，非酶類如維生素E、輔酶Q等，抗氧化酶如MnSOD酶、CAT酶等)清除產生的過多的活性氧，而另一方面通過“溫和”解偶聯的方式抑制活性氧的大量產生[13]. SkulaChev V P[14]最早提出了“溫和”解偶聯抗氧化的機制：通過“溫和”地解偶聯，降低線粒體膜電位，從而降低線粒體活性氧的生成，我們之前的研究也證實了這一點[15].近些年，多數研究證實，解偶聯蛋白發(fā)揮著“溫和”解偶聯作用，解偶聯蛋白在不同的組織中其類型不同，骨骼肌中主要是解偶聯蛋白3(UCP3)，心肌和肝臟中主要是解偶聯蛋白2(UCP2)[16].Tan 等[17]2004年在肝細胞癌中克隆出一個新的基因，他們命名為肝細胞癌下調的線粒體轉運蛋白(HCC-down-regulated mitochondrial carrier protein，HDMCP).此蛋白在小鼠、大鼠和人類的肝臟中表達較高，并且具有高度的同源性.Jin X等[18]進一步研究發(fā)現，在肝臟細胞中，HDMCP過表達能夠顯著降低線粒體膜電位，線粒體ATP合成能力顯著降低，因此該作者認為，HDMCP具有“質子漏”的功能，HDMCP可能是肝臟線粒體中除解偶聯蛋白2之外的又一個重要的起解偶聯作用的蛋白質.

急性酒精性肝損傷過程中，肝臟細胞的氧化損傷是其重要的表現之一.許多研究均證實，急性酒精性肝損傷過程中MDA和活性氧含量顯著增加[10, 19].本研究也發(fā)現，大鼠給予5d酒精攝入后，肝臟線粒體TBARS含量顯著升高，說明肝臟線粒體受到顯著的氧化損傷.有趣的是，在急性酒精攝入過程中，肝臟線粒體MnSOD酶的活性以及肝臟細胞MnSODmRNA表達顯著升高，說明肝臟細胞在受到活性氧刺激的過程中，細胞產生了適應性反應，從而提高了抗氧化的能力.另外，本研究還發(fā)現，急性酒精攝入引起肝臟細胞UCP2和HDMCPmRNA表達顯著升高，線粒體P/O顯著降低，說明引起了線粒體“質子漏”的加強，而這一解偶聯作用可能會引起線粒體活性氧生成的降低.盡管急性酒精性肝損傷過程中應激性地引起線粒體MnSOD酶活性和表達增強，線粒體“質子漏”增加，但結果卻顯示肝臟細胞出現了明顯的氧化損傷，這一結果似乎相互矛盾.其實，這一結果并不矛盾，線粒體是否發(fā)生氧化損傷并不完全決定于抗氧化能力的高低，而決定于活性氧的產生與抗氧化能力的平衡能力.當活性氧產生明顯超過抗氧化系統(tǒng)所承受能力時，也會造成線粒體的氧化損傷.急性酒精性攝入過程中導致的線粒體氧化損傷即是這一矛盾的表現.

在急性酒精性肝損傷過程中，盡管抗氧化酶與解偶聯作用增強均以降低線粒體氧化損傷為目的，但其結果卻并不想同.UCP2和HDMCP以“溫和”解偶聯方式減少活性氧的產生是以損失一部分能量作代價的(“質子漏”增強).本研究發(fā)現線粒體ATP合成能力與UCP2和HDMCP表達水平相反，說明“溫和”解偶聯確實降低了線粒體ATP的合成.由此我們認為：線粒體的氧化損傷對線粒體更為致命，因此，線粒體不得不以損失一部分能量作代價，避免或減少活性氧的產生.但這一部分能量的損失對肝臟細胞有時也可能是致命的，ATP合成減少時，使肝臟細胞壞死的敏感性提高，如在缺血、能量需求劇增、應激等情況下，肝細胞得不到足夠的ATP供應，從而引起肝細胞壞死[20].所以，在急性酒精性肝損傷過程中線粒體“溫和”解偶作用是一把“雙刃劍”，如何平衡線粒體能量供應與活性氧產生之間的平衡是問題的關鍵.

研究證實，耐力訓練提高肝臟抗氧化能力[6]，改善肝臟線粒體結構[7]，逆轉肝臟線粒體功能異常[8].運動訓練可顯著逆轉酒精引起的抗氧化能力降低[9].本研究發(fā)現，經過12周無負重游泳訓練后可以顯著提高肝臟MnSOD酶的活性和mRNA的表達，與之相對應，P/O顯著升高.我們之前的研究表明，耐力訓練顯著降低骨骼肌UCP3和心肌UCP2的表達[5, 15].本研究發(fā)現，經過12周的耐力訓練后，肝臟UCP2和HDMCP表達顯著降低，而再給予急性酒精攝入后，UCP2和HDMCP表達又顯著升高，但與對照組相比無顯著性差異，說明不管是在訓練大鼠還是未訓練大鼠中，急性酒精攝入均能引起UCP2和HDMCP表達的升高，而耐力訓練后線粒體ATP合成能力顯著提高，說明耐力訓練引起了“溫和”解偶聯降低，減少線粒體質子漏(P/O升高)，從而提高了線粒體ATP合成能力.結合上述結果我們認為：在急性酒精性肝損傷過程中，線粒體活性氧產生增加，進而刺激抗氧化酶(如MnSOD)活性與表達升高，但其升高依然不能足以全部清除線粒體產生的活性氧，為避免更嚴重的氧化損傷，肝臟線粒體通過 “溫和”解偶聯的方式減少活性氧的產生，但這一過程是以損失一部分能量作為代價，從而也給肝臟細胞正常狀態(tài)的維持留下了隱患；耐力訓練可以有效提高抗氧化酶的活性和含量，大大增強了肝臟細胞的抗氧化能力，因此，肝臟無需或部分通過“溫和”解偶聯的方式減少線粒體活性氧的生成，從而降低了這一抗氧化方式的能量損耗，增強了肝臟細胞ATP供給能力，也說明肝臟細胞中抗氧化酶是抗氧化的主體，而“溫和”解偶聯僅可能是一種輔助的、應急抗氧化手段.

4結論

耐力訓練可以有效提高肝臟抗氧化能力，降低解偶聯蛋白表達，從而提高肝臟線粒體能量合成能力，達到預防急性酒精性肝損傷的目的.

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(編輯：姚佳良)

The effect of pr-endurance training on relationship between mitochondrial antioxidant ability and uncoupling function in alcohol-induced acute hepatic injury rats

SU Wen, LIU Yan-huan, WANG Man-zhuo, MA Guo-dong

(School of Physical Education, Shandong University of Technology, Zibo 255049, China)

Abstract:To investigate the effect of pre-endurance training on the relationship between mitochondrial antioxidant ability and uncoupling function in alcohol-induced acute hepatic injury rats. We analysised the expressions of UCP2,HDMCP and MnSOD mRNA, mitochondrial P/O, activities of MnSOD and ATP synthase in liver tissue in alcohol-induced acute hepatic injury rats after 12 week unload swimming training.Acute alcohol treatment resulted in increased mRNA expression of MnSOD,UCP2 and HDMCP but decreased P/O and ATP synthase activity.Compared with acute alcohol treatment of untrained rats, acute alcohol treatment of trained rats have lower expressions of UCP2 and HDMCP but higher P/O and mRNA expression of MnSOD. Pre-endurance training can increase liver antioxidant ability, decrease expression of uncoupling proteins, which increases liver mitochondrial ATP synthesis, and it achieves a prevention of acute alcohol-induced hepatic injury.

Key words:pr-endurance training; acute alcohol-induced hepatic injury; antioxidant ability; uncoupling function

收稿日期：2015-05-07

基金項目：山東理工大學青年學者支持計劃(110026)

作者簡介：蘇文，女，940486722@qq.com；通信作者：馬國棟，男，mgdtj@sina.com

文章編號：1672-6197(2016)05-0056-05

中圖分類號：G804.2

文獻標志碼：A