劉暢 羅著 張夢如 楊玉梅 劉嫻 龔明 鄒竹榮

（云南師范大學生命科學學院 云南省生物質(zhì)能源和環(huán)境生物技術重點實驗室 教育部生物質(zhì)能源持續(xù)發(fā)展和應用工程研究中心，昆明 650500）

藍藻橙色類胡蘿卜素蛋白的基因克隆及在大腸桿菌中的異源表達和功能分析

劉暢 羅著 張夢如 楊玉梅 劉嫻 龔明 鄒竹榮

（云南師范大學生命科學學院 云南省生物質(zhì)能源和環(huán)境生物技術重點實驗室 教育部生物質(zhì)能源持續(xù)發(fā)展和應用工程研究中心，昆明 650500）

旨在體內(nèi)證明藍藻橙色類胡蘿卜素蛋白（OCP）具備不依賴類胡蘿卜素的單線態(tài)氧（1O2）清除功能。通過PCR擴增藍藻OCP基因，對其進行原核誘導表達，并通過細菌點板和生長曲線測定法檢驗它在大腸桿菌中的抗1O2活性。結果表明，直接從藍藻水體提取的宏基因組中成功擴增得到OCP基因SyOCP，其編碼區(qū)大小為954 bp。生物信息學分析表明，SyOCP來源于主要藍藻種類——集胞藻（Synechocystis sp. PCC 6803）。經(jīng)IPTG誘導，SyOCP基因在大腸桿菌中獲得了高水平的可溶性表達。另外，異源表達SyOCP的重組大腸桿菌對常見的1O2光敏誘發(fā)劑染料——亞甲基藍的耐受性得到了顯著增強。藍藻OCP（不結合類胡蘿卜素）內(nèi)在的抗1O2功能在大腸桿菌中得到了體內(nèi)驗證。

藍藻；橙色胡蘿卜素蛋白；宏基因組；單線態(tài)氧；亞甲基藍

在強光下，產(chǎn)氧光合生物如植物（包括藻類）以及藍細菌（藍藻）很容易遭受光氧化脅迫。單線態(tài)氧（1O2）是光氧化脅迫中主要的活性氧形式，具有很高反應性，攻擊和氧化蛋白質(zhì)、脂類和核酸，特別是能激發(fā)光合反應中心PSII中D1蛋白的降解，產(chǎn)生光氧化損傷及光抑制現(xiàn)象［1-6］。另外，1O2能作為信號分子在植物應對光氧化脅迫中起著重要作用，而這個過程可能涉及到類胡蘿卜素分子的參與［7-9］。

1O2可通過多種方式產(chǎn)生，但一個共同的途徑是從光敏劑（色素或染料）分子的三線態(tài)形式通過電子能量轉(zhuǎn)移形成。在產(chǎn)氧光合作用中，葉綠素（藍藻中為膽色素）分子是很好的光敏劑，受光能激發(fā)形成三線態(tài)葉綠素（或膽色素），然后與分子氧反應很容易形成1O2。特別是強光條件下，光合電子傳遞鏈大量減少以及電子傳遞速率飽和，過剩光能會激發(fā)大量的三線態(tài)葉綠素（或膽色素）和1O2產(chǎn)生，從而形成氧化脅迫［1，3，5，9］。

植物和藍藻都已形成一套光保護機制，減少強光下到達光合反應中心的能量和1O2的產(chǎn)生［1，5，7-9］。在植物中，與類囊體膜上葉綠素共存的類胡蘿卜素除了能輔助捕獲光能外，還能將強光下的過剩光能耗散為熱，并能直接作為1O2的底物進行非酶氧化，從而減少光合反應中心1O2的濃度，舒緩光氧化脅迫。因此，植物中的類胡蘿卜素是能量和單線態(tài)氧的雙重淬滅劑［5，7］。另外，類胡蘿卜素由1O2非酶氧化形成的醛類或酮類、含有一個活性羰基的裂解產(chǎn)物能夠起到信號分子作用，誘導1O2應答基因的表達，從而增強植物對光氧化脅迫的抗性［8］。

相比較，這種能量和1O2雙重淬滅的光保護作用在藍藻中則主要由橙色類胡蘿卜素蛋白（Orange Carotenoid Protein，OCP）來完成［1］。OCP是一種結合酮式類胡蘿卜素（如3'-羥基玉米黃素）的可溶性藍藻蛋白，在絕大多數(shù)含有藻膽體的藍藻中都有存在［10］。藍藻OCP在光感應和能量猝滅方面是必需的。在強的藍綠光下，OCP被光激活，在藻膽體中將過剩光能耗散為熱，同時減少1O2形成［11-14］。不過，最新研究發(fā)現(xiàn)，在強的橙紅光條件下，OCP不被光激活，但仍能保護藍藻細胞，這種光保護與OCP作用減少了1O2的濃度有關，體外實驗表明OCP在沒有類胡蘿卜素存在情況下本身就是一個很好的1O2清除劑［15］。OCP的水溶性、結合類胡蘿卜素的特性以及本身具備的1O2淬滅功能使得它在抗氧化應用方面具有潛在應用價值。目前，已有報道在大腸桿菌中重組表達OCP和合成類胡蘿卜素，進而生產(chǎn)結合類胡蘿卜素的OCP［16］。

但是，游離態(tài)OCP（不結合類胡蘿卜素）本身清除1O2的活性仍然缺乏體內(nèi)實驗證據(jù)。本研究首先從藍藻水體提取的宏基因組中擴增OCP基因SyOCP，然后以大腸桿菌（本身不合成類胡蘿卜素）為背景，以光敏劑染料亞甲基藍（MB：Methylene blue）產(chǎn)生光氧化脅迫［17］，通過分析SyOCP重組大腸桿菌對MB的耐受性，旨在體內(nèi)驗證游離態(tài)藍藻OCP內(nèi)在的抗1O2功能。

1 材料與方法

1.1 材料

大腸桿菌菌株DH5α和BL21（DE3）以及質(zhì)粒pET30a（+）均為本實驗室保存。Phusion高保真DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶Nde I和Sac I、DNA連接酶均為Thermo Scientific公司產(chǎn)品；質(zhì)粒DNA提取試劑盒、DNA凝膠純化試劑盒、PCR mix、DNA和蛋白分子量標準均為北京Transgene公司產(chǎn)品。亞甲基藍為Sigma公司產(chǎn)品，其它生化試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 藍藻水體宏基因組DNA的提取 取一定體積的藍藻水體（取自昆明滇池），12 000 r/min離心2-5 min，離心后的沉淀相當于1.2 mL過夜培養(yǎng)的大腸桿菌離心后的菌體。加0.5 mL提取緩沖液（50 mmol/L Tris-HCl pH8.5，5 mmol/L EDTA，50 mmol/L NaCl），重懸徹底；加等體積的Tris飽和酚，混勻，65℃加熱5-10 min，中間短促混勻2-3次，12 000 r/min離心5 min；取上清，加入等體積的酚∶氯仿∶異戊醇（25∶24∶1），混勻，12 000 r/min離心5 min；取上清，加入等體積的氯仿，混勻，12 000 r/min離心5 min；取上清，加入1/10體積的3 mol/L醋酸鈉（pH5.2）和2倍體積的預冷無水乙醇，-20℃放置30 min；12 000 r/min離心10 min，沉淀用70%乙醇洗一次，室溫干燥5-10 min；加入50-100 mL H2O 溶解沉淀。

1.2.2 藍藻SyOCP基因的克隆 根據(jù)GenBank中藍藻Synechocystis sp. PCC 6803的OCP對應DNA序列（Acc. CP003265.1的1765600-1766800 nt）設計PCR引物（表1）。取0.5-1 μL提取的藍藻水體宏基因組DNA為模板，利用引物SyOCP-Fw、SyOCP-Rv和Phusion 高保真DNA聚合酶進行第一輪PCR（退火溫度為56℃）。擴增產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測，根據(jù)情況進行適當倍數(shù)稀釋或不稀釋，取1 μL為模板，用引物SyOCP-5Nd、SyOCP-3Sc和Phusion 高保真DNA聚合酶進行第二輪PCR（50℃退火，1個循環(huán)；60℃退火，30個循環(huán)）。將膠回收的第二輪PCR產(chǎn)物SyOCP用Nde I、Sac I雙酶切，純化后與同樣酶切的質(zhì)粒pET30a（+）連接、轉(zhuǎn)化DH5α，然后利用引物SyOCP-5Nd和Tt7Dw-Rv、通過菌落PCR（退火溫度為53℃）鑒定陽性重組克隆pET（SyOCP），隨后通過測序驗證。

表1 本工作中所使用的引物

1.2.3 大腸桿菌誘導表達和蛋白電泳 將表達載體pET（SyOCP）轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）。挑單克隆接菌于LB液體培養(yǎng)基（含100 μg/mL 氨芐青霉素），37℃培養(yǎng)過夜；按1∶100比例將菌液轉(zhuǎn)接于相同培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)至OD600為0.6；然后，加IPTG至終濃度0.5 mmol/L，30℃繼續(xù)培養(yǎng)7 h。誘導表達菌離心后的菌體用PBS緩沖液（pH7.4）重懸，然后進行超聲破菌。取16 μL 細菌裂解物，12 000 r/min離心5 min；轉(zhuǎn)移全部上清作為樣品S，沉淀用16 μL PBS緩沖液重懸后作為樣品P，同時取16 μL細菌裂解物作為樣品T。另外，在加IPTG前取200 μL菌液，離心后菌體用16 μL PBS緩沖液重懸，作為未誘導樣品（UI）。所有樣品加4 μL 5×蛋白上樣緩沖液，混勻后煮沸5 min，然后用12% SDS-PAGE進行電泳分析［18］。通過比較誘導前后的蛋白電泳條帶判斷SyOCP基因在大腸桿菌中的表達情況。

1.2.4 大腸桿菌對亞甲基藍的抗性分析 從大腸桿菌BL21（DE3）［含表達載體pET（SyOCP）或?qū)φ湛蛰d體pET30a（+）］的LB平板上挑單克隆接菌，37℃培養(yǎng)過夜；按1∶100比例進行菌液轉(zhuǎn)接，37℃培養(yǎng)至OD600為0.6（或調(diào)至0.6），然后進行以下兩種實驗：（1）菌落點板：將菌液進行梯度倍數(shù)（1、2、4和8）稀釋，各取2 μL成排點樣在LB平板［含100 μg/mL 氨芐青霉素、0.5 mmol/L IPTG以及不同濃度（20、30和40 μmol/L）的亞甲基藍］上，平板于37℃光照下培養(yǎng)1-2 d，最后通過Bio-Rad公司的凝膠成像系統(tǒng)拍照。（2）細菌生長曲線測定：往菌液加入終濃度0.5 mmol/L IPTG以及不同終濃度（0 μmol/L和25 μmol/L）的亞甲基藍，37℃光照下繼續(xù)培養(yǎng)9 h，每隔1 h測定OD600值；最后以OD600值為縱坐標、培養(yǎng)時間（h）為橫坐標進行作圖。該實驗重復2次，通過比較表達菌［含pET（SyOCP）］和對照菌［含pET30a（+）］的菌落生長狀態(tài)和生長曲線，判定其對亞甲基藍的抗性。

1.2.5 生物信息學分析和統(tǒng)計分析 引物設計、核酸和蛋白序列分析通過Invitrogen公司的分子生物學軟件Vector NTI Advance 11進行。使用NCBI在線工具Blastn和Blastp分別進行核酸和蛋白的序列多重比對，并采用鄰近法（Neighbor-joining）生成與其關聯(lián)的系統(tǒng)進化樹。實驗數(shù)據(jù)分析及作圖使用Microsoft Excel程序。

2 結果

2.1 藍藻SyOCP基因的克隆

藍藻在營養(yǎng)豐富的淡水中能大量繁殖。本工作從取自昆明滇池的藍藻水體中提取宏基因組總DNA，取1 μL作為模板，用引物SyOCP-Fw、SyOCPRv進行第一輪PCR，取5 μL進行電泳檢測，結果（圖1-A）未能明顯觀察到目的擴增條帶（預期大小為1 036 bp）。直接取第一輪PCR產(chǎn)物1 μL作為模板，用引物SyOCP-5Nd、SyOCP-3Sc進行第二輪PCR（巢式），取5 μL進行電泳檢測，結果獲得了非常明亮的、特異性好的擴增條帶，但大小似乎偏小（圖1-B）。但該條帶的膠回收產(chǎn)物1 μL經(jīng)電泳檢測后，大小與預期（972 bp）一致（圖1-C），取名為SyOCP。由于引物SyOCP-5Nd、SyOCP-3Sc的5'末端分別引入了酶切位點Nde I和Sac I，因此第二輪PCR產(chǎn)物SyOCP通過Nde I、Sac I雙酶切，直接克隆到了大腸桿菌表達載體pET30a（+）上，菌落PCR（使用引物SyOCP-5Nd和Tt7Dw-Rv）條帶明亮、大小正確（圖1-D），表明獲得了藍藻SyOCP基因的大腸桿菌重組表達載體pET（SyOCP）。

圖1 SyOCP基因的克隆

2.2 藍藻SyOCP基因的生物信息學分析

利用T7啟動子和終止子引物對pET（SyOCP）質(zhì)粒DNA進行雙向測序，結果表明擴增的SyOCP基因編碼區(qū)大小為954 bp，編碼一個317氨基酸的蛋白（理論分子量大小為34.7 kD）。與GenBank數(shù)據(jù)庫中藍藻Synechocystis PCC 6803的OCP相應序列進行比對分析，結果顯示擴增的SyOCP基因有4個堿基突變（T與C之間互變），但均為沉默突變，未造成蛋白的氨基酸序列改變（圖2，黑體陰影字母為突變產(chǎn)生堿基）。

分別以SyOCP基因編碼區(qū)及其推導的蛋白序列作為檢索對象，利用NCBI 在線Blastn、Blastp工具進行核酸和蛋白的序列多重比對，隨后分別生成基于鄰近法的系統(tǒng)進化樹。結果（圖3）顯示，本研究從藍藻水體中克隆的SyOCP與其直系同源物（Ortholog）在基因和蛋白進化上似乎僅局限于藍細菌內(nèi)，它們的最遠親緣體為擬甲色球藻（Chroococcidiopsis，一種耐極端環(huán)境的最原始藍藻），植物中沒有其同源物。而且，SyOCP幾乎可以認為就源自于自然界中的主要集胞藻菌（Synechocystis sp. PCC 6803）。另外還發(fā)現(xiàn)，就SyOCP同源比較而言，在基因水平上集胞藻與聚球藻（Synechococcus）、無類囊體藍藻（Gloeobacter violaceus）等最同源（圖3-A），而在蛋白水平上集胞藻則與螺旋藻（Spirulina）和節(jié)旋藻（Arthrospira）的親緣關系最近（圖3-B）。有趣的是，在基因系統(tǒng)進化樹中發(fā)現(xiàn)了SyOCP的高度同源基因存在于枯草芽胞桿菌（Bacillus subtilis）中（圖3-A），其中原因還不得而知。

2.3 藍藻SyOCP基因在大腸桿菌中的誘導表達

含表達載體pET（SyOCP）的大腸桿菌BL21（DE3）用0.5 mmol/L IPTG于30℃誘導表達7 h，超聲裂解后經(jīng)12% SDS-PAGE分析，結果（圖4）表明SyOCP基因在大腸桿菌中獲得了高水平的表達，而且重組表達蛋白大部分可溶，位于上清組分（S）中，大小接近于其理論分子量（34.6 kD）。

2.4 異源表達SyOCP顯著增強大腸桿菌對亞甲基藍的抗性

本研究進一步分析了SyOCP在大腸桿菌中的功能，即檢測異源表達SyOCP的大腸桿菌對亞甲基藍（MB）的抗性。菌落點板實驗結果（圖5）顯示，含表達載體pET（SyOCP）的大腸桿菌BL21（DE3）菌株相比含對照空載體pET30a（+）的菌株，在無MB平板上的菌落生長沒有明顯差異；而在所有含不同濃度（20、30 和40 μmol/L）MB平板上的菌落生長都受抑制，但前者狀況更好，而且這種差異整體上隨點菌稀釋倍數(shù)的增加和MB濃度的增加而愈加顯著。同時，細菌生長曲線測定結果（圖6）也表明，大腸桿菌生長確實受MB（25 μmol/L）抑制，但含pET（SyOCP）的菌株相比對照菌株［含pET30a（+）］生長得更快，受抑制程度更低。這些結果歸納起來說明，在大腸桿菌中異源表達SyOCP顯著提高了宿主菌對MB的抗性。

圖2 SyOCP基因的核苷酸序列及其推導的蛋白序列

3 討論

藍藻水溶性橙色胡蘿卜素蛋白（OCP）在強光下被激活發(fā)揮雙重光保護作用——淬滅過剩能量和1O2，幫助藍藻細胞抵御光氧化脅迫［1，11-14］；同時，OCP蛋白本身還可以直接作為1O2的清除劑［15］，但游離態(tài)OCP的體內(nèi)生物學活性仍沒有得到驗證。

本研究成功從滇池藍藻水體提取的宏基因組中擴增得到OCP基因SyOCP。生物信息學分析表明SyOCP就是來源于主要藍藻種類——集胞藻（Synechocystis sp. PCC 6803）。這種不需要預先分離藍藻特定菌株、直接從藍藻水體宏基因組中擴增OCP基因的簡捷方法可用于克隆其它藍藻基因，甚至可用作借鑒從其它環(huán)境宏基因組中分離目標基因。不過，特別要提及的是，最好采用兩輪PCR擴增，因為首輪PCR的目標產(chǎn)物量經(jīng)常較低，而第二輪嵌套式PCR則很容易擴增出足量的目標基因。

通過IPTG誘導，SyOCP基因在大腸桿菌中獲得了高水平的蛋白表達，并且大部分可溶。該結果印證了OCP的水溶特性。另外，我們通過菌落點板法和細菌生長曲線測定法分析，發(fā)現(xiàn)異源表達SyOCP顯著增強了重組大腸桿菌對常見1O2光敏誘發(fā)劑——亞甲基藍的耐受性（圖5，圖6）。大腸桿菌本身不合成類胡蘿卜素，所用培養(yǎng)基中也沒有添加類胡蘿卜素，因此這種耐受性應該歸因于大腸桿菌重組表達的SyOCP蛋白對1O2（亞甲基藍受光激發(fā)產(chǎn)生）的直接清除。該結果是通過細胞體內(nèi)分析驗證了游離態(tài)OCP直接淬滅1O2的生物學活性。

圖3 鄰近法構建SyOCP基因（A）及蛋白（B）的系統(tǒng)進化樹

水溶性抗1O2的OCP能結合脂溶性的類胡蘿卜素，可被認為是一類“載脂蛋白”。 類胡蘿卜素又是重要的抗氧化劑（包括抗1O2），因此推測結合類胡蘿卜素的OCP應該起著獨特的抗氧化作用（面大、部位廣、效果佳），它在抗氧化方面的應用前景十分廣闊。目前已有報道在大腸桿菌中重組生產(chǎn)結合類胡蘿卜素的OCP［16］，可以作為抗氧化添加組分用于食品、化妝品等行業(yè)。另外，我們注意到，植物中的強光保護機制主要是通過類囊體膜上與葉綠素共存的類胡蘿卜素直接起作用，將過剩光能耗散為熱，減少三線態(tài)葉綠素和1O2產(chǎn)生，并作為底物以非酶氧化方式清除1O2，從而最終減少光反應活性中心PSII中的1O2濃度，緩解光氧化脅迫和光抑制［5，7］。生物信息學分析表明植物中沒有OCP的直系同源物，那么藍藻中獨有的、由OCP介導的光保護機制是否可以通過轉(zhuǎn)基因引入以提高植物對強光的耐受性，是我們下一步要探討的問題，而本研究已為此奠定了較好的前期研究基礎。

圖4 SyOCP基因在大腸桿菌BL21（DE3）中的重組表達

圖5 菌落點板分析SyOCP表達大腸桿菌對亞甲基藍（MB）的抗性

4 結論

本研究直接從藍藻水體提取的宏基因組中擴增得到OCP基因SyOCP，該基因來源于主要藍藻種類——集胞藻（Synechocystis sp. PCC 6803）。通過IPTG誘導，SyOCP基因在大腸桿菌中獲得了高水平的可溶性表達。而且，異源表達SyOCP的重組大腸桿菌對亞甲基藍的耐受性得到了顯著提高，從而在體內(nèi)驗證了藍藻OCP（不結合類胡蘿卜素）內(nèi)在的抗1O2功能。

圖6 細菌生長曲線分析SyOCP表達大腸桿菌對亞甲基藍（MB）的抗性

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（責任編輯 馬鑫）

Gene Cloning of the Orange Carotenoid Protein from Cyanobacteria，and Its Ectopic Expression and Functional Evaluation in Escherichia coli

LIU Chang LUO Zhu ZHANG Meng-ru YANG Yu-mei LIU Xian GONG Ming ZOU Zhu-rong
（Engineering Research Center of Sustainable Development and Utilization of Biomass Energy（Ministry of Education），Key Laboratory of Biomass Energy and Environmental Biotechnology of Yunnan Province，School of Life Sciences，Yunnan Normal University，Kunming 650500）

The aim is to verify the orange carotenoid protein（OCP）in cyanobacteria can scavenge singlet oxygen（1O2）independent of carotenoids in vivo. The cyanobacterial OCP gene was amplified by PCR，and then subjected to prokaryotic inducible expression and further evaluation of anti-1O2activity in Escherichia coli by bacterial dot-plating test and growth curve assay. Results showed that the gene（SyOCP）of OCP was successfully amplified from the metagenome of the cyanobacteria water，with a coding region of 954 bp. Bioinformatics analysis indicated that SyOCP was from the major cyanobacteria species—Synechocystis sp. PCC 6803. By IPTG induction，the SyOCP gene was highly expressed in E. coli with soluble protein. In addition，the ectopic expression of SyOCP in recombinant E. coli resulted in the notable enhancement of it on the tolerance to the common1O2-induced photosensitizer dye，methylene blue. The intrinsic anti-1O2role of cyanobacterial OCP（without binding carotenoids）was in vivo verified in E. coli.

cyanobacteria；orange carotenoid protein；metagenome；singlet oxygen；methyl blue

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.07.021

2015-11-20

國家自然科學基金項目（31160169，31460067）

劉暢，女，碩士研究生，研究方向：植物逆境生理和分子生物學；E-mail：501705740@qq.com

鄒竹榮，男，博士，研究方向：植物逆境生理和分子生物學；E-mail：zouzr09@sina.com