周明明李曉雁任夢楠程珂萌黃海東

（1. 天津農學院農學與資源環(huán)境學院，天津 300384；2. 天津農學院食品科學與生物工程學院，天津 300384）

韋蘭膠合成菌的原生質體制備與再生研究

周明明1李曉雁2任夢楠1程珂萌1黃海東1

（1. 天津農學院農學與資源環(huán)境學院，天津 300384；2. 天津農學院食品科學與生物工程學院，天津 300384）

旨在研究EDTA預處理、菌齡、酶解濃度、酶解溫度及酶解時間對Sphingomonas sp. ATCC 31555原生質體制備與再生的影響。結果表明，菌齡10 h，12 mmol/L EDTA預處理，溶菌酶濃度45 μg/mL、酶解溫度28℃、酶解時間25 min。得到原生質體的形成率達97.3%，再生率達33.9%。研究結果為菌株進行原生質體融合、基因組改組等選育優(yōu)良菌種提供參考。

鞘氨醇單胞菌；韋蘭膠；原生質體；再生

微生物多糖安全無毒、理化性質優(yōu)良，在食品、醫(yī)藥、材料等許多工業(yè)領域具有廣泛的應用價值，比動物多糖、植物多糖具有更為廣泛的應用前景［1］。鞘氨醇膠是鞘氨醇單胞菌屬菌株合成的一類微生物多糖的統(tǒng)稱，其多糖主鏈結構相似，側鏈基團種類多樣［2］。韋蘭膠是由Sphingomonas sp. ATCC 31555發(fā)酵產生的一種胞外多糖，是繼黃原膠和結冷膠之后最具市場前景的微生物膠之一。韋蘭膠的主鏈由D-葡萄糖、D-葡糖醛酸、D-葡萄糖和L-鼠李糖的四糖重復單元組成，側鏈由單鏈的L-甘露糖或單鏈的L-鼠李糖構成［3］。韋蘭膠溶液具有獨特的剪切稀釋性能，以及增稠性、懸浮性和乳化性［4］，在石油開采、水泥及混凝土制品等領域具有廣泛的應用，并具備在食品、醫(yī)藥等領域應用的潛力［5］。

目前韋蘭膠的工業(yè)化生產仍存在一些問題，其碳源轉化率僅有40%-50%、產量只有15-20 g/L，與黃原膠等微生物膠的發(fā)酵生產相比，韋蘭膠的碳源轉化率和產量都較低，生產成本較高［6］，為解決此問題，研究者在培養(yǎng)基和發(fā)酵調控方面進行了大量研究，使韋蘭膠的發(fā)酵產量得到不同程度的提高［7，8］。但韋蘭膠合成菌原生質體制備與再生條件的研究還未見報道，本研究以韋蘭膠合成菌Sphingomonas sp. ATCC 31555為出發(fā)菌株，對影響菌株原生質體制備與再生的因素進行了研究，以期獲得生產成本低及產量提高的目的菌株，為利用原生質體融合及基因組改組等選育更為優(yōu)良的菌株提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 韋蘭膠產生菌（Sphingomonas sp.）ATCC 31555。

1.1.2 試劑 磷酸緩沖液：0.1 mol/L磷酸氫二鈉，0.1 mol/L磷酸二氫鈉 pH7.0；高滲緩沖液：0.1 mol/L磷酸氫二鈉，0.1 mol/L磷酸二氫鈉，0.8 mol/L甘露醇 pH7.0；原生質體穩(wěn)定液（SMM）：0.5 mol/L蔗糖，20 mol/L MgCl2，0.02 mol/L順丁烯二酸，pH6.5；溶菌酶：用SMM溶液配制，終濃度0.5 mg/mL，過濾除菌，-20℃保存?zhèn)溆?。酚藏花紅染色劑（Sigma）。

1.1.3 培養(yǎng)基 固體培養(yǎng)基（g/L）：蔗糖15.0，蛋白胨5.0，牛肉膏3.0，酵母膏3.0，瓊脂粉15.0，pH7.0。液體培養(yǎng)基（g/L）：蔗糖15.0，蛋白胨2.5，磷酸氫二鉀2.5，磷酸氫二銨1.5，硫酸鎂0.1，酵母粉1.5，pH7.0。補充基本培養(yǎng)基（BNK）（%）：蔗糖18.1，蛋白胨0.5，牛肉膏0.3，瓊脂粉2.0，pH7.0。再生補充培養(yǎng)基（BZNK）（%）：BNK配方中瓊脂改為0.8。

1.2 方法

1.2.1 菌種活化 取-70℃保藏的菌種Sphingomonas sp. ATCC 31555，在無菌操作條件下將其劃線到固體平板培養(yǎng)基上，30℃恒溫培養(yǎng)72 h，挑取單菌落在試管斜面上蛇形劃線，30℃恒溫培養(yǎng)72 h。

1.2.2 菌株發(fā)酵曲線的測定 在無菌操作條件下，用5 mL無菌水將試管斜面上的菌體沖洗下來，按10%的接種量將其接種到含有100 mL液體培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，30℃，180 r/min搖床培養(yǎng)72 h，定時取樣，并測定發(fā)酵液的pH、菌數(shù)、黏度和韋蘭膠的產物量。

1.2.3 原生質體的制備 菌株Sphingomonas sp. ATCC 31555液體培養(yǎng)至對數(shù)生長前期，取適量菌液在8 000 r/min條件下離心5 min，棄上清液，用磷酸緩沖液洗滌菌體細胞。將菌體懸浮于適量的SMM緩沖液中，使溶液中細胞濃度約含108-109CFU/mL。取菌液0.1 mL，用無菌水倍比稀釋，涂布平板培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)4 d后得菌落數(shù)A（菌落總數(shù)）。在剩余的菌懸液中加入溶菌酶，混合均勻后于37℃保溫一定時間，4 000 r/min 離心10 min，棄上清液，用高滲緩沖液洗滌除酶，取菌液0.1 mL，用無菌水倍比稀釋，進行剩余菌數(shù)B（未被酶裂解的剩余細胞）的測定。

1.2.4 原生質體的再生 取0.1 mL酶解后的原生質體懸液，用SMM緩沖液倍比稀釋，取1 mL加入底層BNK補充培養(yǎng)基的中央，再倒入上層BZNK培養(yǎng)基，混勻，30℃培養(yǎng)4-5 d后計數(shù)，將菌落數(shù)計為C（再生菌落數(shù)）。原生質體形成率與再生率的計算公式：原生質體形成率（%）=（A-B）/A×100%，原生質體再生率（%）=（C-B）/（A-B）×100%。

1.2.5 菌體與原生質體的熒光顯微鏡觀察 用SMM溶液作溶劑配制0.01%的酚藏花紅染色劑［9］。將菌懸液和制備好的原生質體溶液分別與酚藏花紅染色劑按1∶1的比例進行染色，然后取少量滴于載玻片上，加蓋玻片，在熒光顯微鏡下進行觀察。

2 結果

2.1 菌株Sphingomonas sp. ATCC 31555的發(fā)酵曲線

對菌株Sphingomonas sp. ATCC 31555進行72 h的搖瓶發(fā)酵，其間進行pH、黏度、菌數(shù)和韋蘭膠產物量的測定。細胞生長曲線（圖1）顯示，菌株在培養(yǎng)5 h后進入對數(shù)生長期，58 h進入穩(wěn)定期，此時菌數(shù)達9.5×109CFU/mL；韋蘭膠產物量曲線與細胞生長曲線近乎平行，在58 h時達到韋蘭膠產量最高；發(fā)酵液的pH在6-7之間小范圍波動，因韋蘭膠屬于酸性多糖，且使用高碳氮比培養(yǎng)基，發(fā)酵期間pH總體呈降低趨勢，發(fā)酵67 h時pH最低為6.31；發(fā)酵液的黏度在對數(shù)生長期的后期迅速增加，在67 h達到最大值。由于菌株合成產物后，細胞外包裹高分子多糖不利于原生質體的制備，選擇黏度較低的10 h菌齡發(fā)酵液進行原生質體制備的研究。

2.2 原生質體的制備與再生

2.2.1 EDTA預處理對原生質體制備與再生的影響 本研究對不同濃度梯度的EDTA對菌體進行預處理，結果（圖2）顯示，原生質體的形成率隨著EDTA濃度的增大而增大，再生率則在12 mmol/L之前呈上升趨勢，之后呈下降趨勢。隨著EDTA濃度的增大，菌體細胞壁的破壞程度越來越大，酶的作用增強，形成率和再生率上升，再生率在EDTA濃度為12 mmol/L之后下降。以原生質體形成率與再生率乘積作為判別標準［10］，選擇EDTA濃度為12 mmol/L作為原生質體制備與再生的最佳濃度。

圖1 菌株Sphingomonas sp. ATCC 31555的發(fā)酵曲線

圖2 EDTA濃度對原生質體形成率與再生率的影響

2.2.2 青霉素預處理對原生質體制備與再生的影響 本實驗在菌體培養(yǎng)10 h時，加入0-100 μg/mL濃度梯度的青霉素繼續(xù)培養(yǎng)2 h后，加入EDTA預處理和溶菌酶進行作用，觀察青霉素預處理對原生質體制備與再生的影響，結果如圖3所示。菌株原生質體的形成率呈下降趨勢，青霉素對再生率的影響比較明顯，在青霉素濃度為10 μg/mL之后，原生質體再生率急劇下降，原因是隨著青霉素濃度的增大，抑制了菌體的正常生長，細胞數(shù)量下降，再加上酶對原生質體的傷害，使得原生質體的形成率和和再生率都降低。綜合考慮原生質體的形成率與再生率，選擇不加青霉素作為菌株原生質體制備與再生的最佳條件。

圖3 青霉素濃度對原生質體形成率與再生率的影響

2.2.3 溶菌酶濃度對原生質體制備與再生的影響 對5-245 μg/mL之間濃度梯度的溶菌酶進行實驗，結果（圖4）顯示，隨著酶濃度的增加，原生質體形成率逐漸增大，再生率在酶濃度為45 μg/mL時值最大，為31.1%，之后迅速下降。依據原生質體形成率與再生率乘積最大原則［10］，選擇酶濃度為45 μg/mL作為原生質體制備與再生的最佳條件。

圖4 酶濃度對原生質體形成率與再生率的影響

2.2.4 酶解溫度對原生質體制備與再生的影響 本研究在不同的酶解溫度下進行了原生質體制備與再生實驗［11］，結果如圖5所示。隨著溫度的升高，原生質體的形成率一直上升，原因是隨著溫度的升高，酶的活性增強。再生率則相反，呈下降趨勢，一方面是因為酶在作用過程中，不僅酶解了細胞壁，還對早期形成的原生質體膜造成了損傷，另一方面是因為菌體的最適培養(yǎng)溫度為30℃，溫度升高使原生質體的活性降低，導致其破壞甚至死亡，因而再生率較低［12］。綜合考慮，選擇酶解溫度為28℃作為原生質體制備與再生的最佳條件。

圖5 酶解溫度對原生質體形成率與再生率的影響

2.2.5 酶解時間對原生質體制備與再生的影響 對不同的酶解時間進行研究，結果（圖6）顯示，酶解時間在25 min之前，原生質體的形成率上升較快，之后增長緩慢，再生率則一直處于下降趨勢。原因是隨著酶解時間的延長，在25 min時原生質體基本釋放完全，再延長酶解時間，原生質體形成率也不會大幅度增加。由于酶解時間過長，細胞脫壁太徹底，使細胞失去再生的引物，且雜酶的損害程度也增強［13］，因而再生率下降。綜合考慮，選擇酶解時間為25 min作為原生質體制備與再生的最佳條件。

圖6 酶解時間對原生質體形成率與再生率的影響

2.3 原生質體制備條件的驗證

在最佳條件下，菌體培養(yǎng)至對數(shù)生長前期10 h，12 mmol/L EDTA預處理，溶菌酶濃度45 μg/mL，酶解溫度28℃，酶解時間25 min的條件下進行實驗。結果表明，原生質體形成率達97.3%，再生率達33.9%。菌株Sphingomonas sp. ATCC 31555及其原生質體經酚藏花紅染色后，在熒光顯微鏡下的細胞形態(tài)。由圖7可以看出菌株Sphingomonas sp. ATCC 31555的細胞為桿狀，兩端略窄，大小為（0.5-0.7）μm×（1.0-1.7）μm。其原生質體大多數(shù)菌體呈類球狀，直徑0.6-0.9 μm，實現(xiàn)了原生質的制備。

圖7 韋蘭膠合成菌的細胞（A）及其原生質體（B）形態(tài)（1 000×）

3 討論

本研究用酶法去除菌株細胞壁制備原生質體，在原生質體的形成與再生過程中，要獲得較高的原生質體形成率與再生率，應綜合考慮各個影響因素［14］。微生物的生理狀態(tài)對原生質體的形成非常重要，對數(shù)生長期的細胞生長比較旺盛，活力較強，酶解易于釋放原生質體［15］，但隨著培養(yǎng)時間的延長，胞外多糖產物會阻擋酶對實驗菌株的作用，因此選擇對數(shù)生長期初期作為原生質體制備的最佳菌齡。原生質體制備時，溶菌酶作用于細胞壁肽聚糖主鏈的β-1，4-糖苷鍵上，從而破壞細菌的細胞壁結構［16］，但革蘭氏陰性菌的原生質體制備更為復雜，陰性菌細胞壁的肽聚糖結構外還有脂多糖層，會阻擋溶菌酶的作用，EDTA可以螯合Ca2+和Mg2+，使脂多糖解體，進而暴露內層的肽聚糖分子被溶菌酶所水解［17］，結果顯示EDTA有利于對實驗菌株的酶解。青霉素可以與轉肽酶的活性中心結合，抑制肽橋的形成，從而抑制細菌細胞壁中肽聚糖的交聯(lián)，使細胞壁結構疏松，有利于溶菌酶的作用［18］，但本實驗的結果顯示青霉素影響菌株生長，降低了原生質體形成率，因此不選擇使用青霉素進行預處理。不同的微生物菌種細胞壁組分有差異，因而對酶的敏感性不同，不同廠家溶菌酶的活性差異以及實驗菌株的生長溫度范圍，都會影響酶促反應的條件，如酶濃度、酶解溫度及時間等，進而影響原生質體的形成率與再生率，因此，有必要對酶促反應條件進行研究。原生質體制備時，隨著溶菌酶濃度的增加，酶與菌體的作用更加充分，所以原生質體形成率上升，但過高的酶濃度，使溶菌酶中混有的雜酶（核糖核酸酶、過氧化物酶等）作用呈現(xiàn)，造成原生質體的活力降低［19］。酶解時間過短，原生質體釋放不充分；酶解時間過長，會使形成的原生質體皺縮，且損害細胞質膜或造成原生質體破裂，導致再生率下降［20］。

4 結論

本研究通過對影響韋蘭膠合成菌Sphingomonas sp. ATCC 31555原生質體制備與再生的最佳條件：菌齡10 h，12 mmol/L EDTA預處理，溶菌酶濃度45 μg/mL、酶解溫度28℃、酶解時間25 min，在此條件下菌株原生質體的形成率和再生率分別達到97.3%和33.9%。

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（責任編輯 李楠）

Conditions for Protoplast Preparation and Regeneration by Sphingomonas sp. ATCC 31555

ZHOU Ming-ming1LI Xiao-yan2REN Meng-nan1CHENG Ke-meng1HUANG Hai-dong1
（1. College of Agronomy and Resources & Environment，Tianjin Agricultural University，Tianjin 300384；2. College of Food Science and Biotechnology，Tianjin Agricultural University，Tianjin 300384）

The effects of EDTA pretreatment，cell age and the concentration，temperature and work time of enzymolysis on protoplast formation and regeneration by Sphingomonas sp. ATCC 31555 were studied. The results showed that the formation rate and regeneration rate reached 97.3% and 33.9% respectively，when the cells cultivated 10 h，pretreated by 12 mmol/L EDTA，using 45 μg/mL of lysozyme，enzymolysis at 28℃ for 25 min. The result of this paper provides a reference for breeding fine microbial strains by protoplast fusion and genome shuffling.

Sphingomonas；welan gum；protoplast；regeneration

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.07.019

2015-11-19

國家自然科學基金項目（31571790）

周明明，女，碩士研究生，研究方向：微生物多糖；E-mail：zmmydx@126.com

黃海東，教授，研究方向：資源細菌及工程；E-mail：hhaidong@126.com