林樟楠，劉宏娟，張建安，王革華清華大學(xué)　核能與新能源技術(shù)研究院，北京　100084

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耐乙酸粘紅酵母合成油脂

林樟楠，劉宏娟，張建安，王革華
清華大學(xué)核能與新能源技術(shù)研究院，北京100084

林樟楠, 劉宏娟, 張建安, 等. 耐乙酸粘紅酵母合成油脂. 生物工程學(xué)報(bào), 2016, 32(3): 339–346.

Lin ZN, Liu HJ, Zhang JA, et al. Lipid synthesis by an acidic acid tolerant Rhodotorula glutinis. Chin J Biotech, 2016, 32(3): 339–346.

摘 要:乙酸是木質(zhì)纖維素在水解過(guò)程中的主要副產(chǎn)物，高濃度的乙酸嚴(yán)重影響產(chǎn)油微生物的生長(zhǎng)和油脂合成。本文研究了粘紅酵母對(duì)乙酸的耐受性及其利用乙酸合成微生物油脂的能力。結(jié)果表明，在初始葡萄糖、木糖濃度分別為6 g/L和44 g/L的混合糖培養(yǎng)基中，乙酸濃度低于10 g/L時(shí)，不會(huì)對(duì)菌體生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制作用，油脂合成還得到了促進(jìn)。當(dāng)乙酸添加量為10 g/L時(shí)，生物量、油脂產(chǎn)量、油脂含量較對(duì)照組分別提高了21.5%、171.2%和121.6%。進(jìn)一步研究表明，粘紅酵母具備利用乙酸合成油脂的能力，當(dāng)以乙酸為唯一碳源，濃度為25 g/L時(shí)，油脂產(chǎn)量達(dá)到3.20 g/L，油脂質(zhì)量得率為13%。微生物油脂成分分析表明，粘紅酵母以乙酸為底物制得的油脂可以作為制備生物柴油的油脂原料，其主要成分為棕櫚酸、硬脂酸、油酸、亞油酸和亞麻酸，其中飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸含量分別為40.9%和59.1%。由于粘紅酵母具有利用乙酸合成微生物油脂的能力，在以木質(zhì)纖維素水解液為原料生產(chǎn)微生物油脂的脫毒過(guò)程中，一定濃度的乙酸可以不必脫除。

關(guān)鍵詞:粘紅酵母，微生物油脂，乙酸，玉米芯水解液，發(fā)酵

Received: July 10, 2015; Accepted: October 13, 2015

Supported by: Tsinghua University Initiative Scientific Research Program (No. 2012Z02144), the Foundation of Key Laboratory for Industrial Biocatalysis (Tsinghua University) (No. 2015302), National Energy Administration (No. 20131448926).

清華大學(xué)自主科研計(jì)劃項(xiàng)目 (No. 2012Z02144)，工業(yè)生物催化教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 (清華大學(xué)) 開(kāi)放基金資助項(xiàng)目 (No. 2015302)，國(guó)家能源局項(xiàng)目 (No. 20131448926) 資助。

在全球經(jīng)濟(jì)高速發(fā)展的今天，能源需求缺口日益增大，常規(guī)能源的開(kāi)發(fā)近乎飽和，尋求新型可再生能源迫在眉睫。生物柴油作為一種生物能源，因其環(huán)境友好且可以可再生資源為原料而受到了人們的廣泛關(guān)注。目前工業(yè)上生產(chǎn)生物柴油的原料主要為動(dòng)植物油脂和廢棄油脂。以動(dòng)植物油脂為原料成本較高；以廢棄油脂為原料雖然成本較低，但很難大量回收，難以實(shí)現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)。

微生物油脂是一種單細(xì)胞油脂，由微生物發(fā)酵產(chǎn)生[1]。其成分與植物油類(lèi)似，經(jīng)轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)生成生物柴油[2-6]。由于微生物具有生長(zhǎng)繁殖快、生長(zhǎng)周期短和不受季節(jié)影響等優(yōu)點(diǎn)，近年來(lái)受到研究者的廣泛關(guān)注。一些產(chǎn)油微生物可以利用廉價(jià)廢棄物中的單糖作為生產(chǎn)微生物油脂的原料，既能有效處理一些工農(nóng)業(yè)廢棄物，又能大大降低生產(chǎn)微生物油脂的成本。因此以木質(zhì)纖維素為原料生產(chǎn)微生物油脂成為目前有關(guān)微生物油脂研究的熱點(diǎn)。

在微生物油脂的生產(chǎn)中，找到廉價(jià)而又來(lái)源廣泛的碳源至關(guān)重要。秸稈、甘蔗渣、玉米芯等可水解為單糖的木質(zhì)纖維素是生產(chǎn)微生物油脂的極佳碳源[7-11]。但在木質(zhì)纖維素水解的過(guò)程中，也會(huì)產(chǎn)生一些有機(jī)酸、醛類(lèi)和酚類(lèi)物質(zhì)，其中乙酸為主要的降解產(chǎn)物之一[12]。當(dāng)外界pH低于乙酸解離常數(shù)時(shí)，乙酸主要以親脂性未解離的形式存在，其可通過(guò)簡(jiǎn)單擴(kuò)散的方式穿過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，乙酸在細(xì)胞質(zhì)環(huán)境中解離造成胞內(nèi)pH下降，從而抑制細(xì)胞的正常生長(zhǎng)[13]。乙酸對(duì)產(chǎn)油微生物的生長(zhǎng)和油脂積累有顯著影響[14]，研究表明，培養(yǎng)基中乙酸濃度超過(guò)5 g/L時(shí)，圓紅冬孢酵母的細(xì)胞生長(zhǎng)和油脂合成受到嚴(yán)重抑制，而當(dāng)乙酸濃度在20 g/L以上時(shí)，圓紅冬孢酵母幾乎無(wú)法生長(zhǎng)[15]。Huang等研究了乙酸對(duì)發(fā)酵型絲孢酵母的抑制作用，結(jié)果表明乙酸會(huì)降低菌體對(duì)葡萄糖的攝取速率, 同時(shí)也影響菌體油脂合成，當(dāng)乙酸濃度在30 mmol/L (1.8 g/L) 和66.6 mmol/L (4.0 g/L) 時(shí)，油脂產(chǎn)量分別下降了25%和50%[16]。

粘紅酵母Rhodotorula gutini As2.107，為本實(shí)驗(yàn)室保存菌種，具有較高的乙酸耐受性，能夠在30 g/L的乙酸液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。本文以粘紅酵母As2.107為研究對(duì)象，以與玉米芯水解液相同糖濃度配比的培養(yǎng)基進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，探討了粘紅酵母對(duì)乙酸的耐受性以及乙酸對(duì)粘紅酵母油脂合成的影響。相關(guān)結(jié)果可加深對(duì)粘紅酵母油脂合成代謝機(jī)理的認(rèn)識(shí)，并為水解液發(fā)酵微生物油脂的工藝優(yōu)化提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1菌種及培養(yǎng)基

粘紅酵母Rhodotorula gutini As2.107，為本實(shí)驗(yàn)室保存菌種。

固體斜面培養(yǎng)基g/L：酵母粉10，蛋白胨20，葡萄糖20，瓊脂，pH 5.0。

種子培養(yǎng)基g/L：葡萄糖15，(NH4)2SO42，酵母粉1，KH2PO47，Na2HPO42，MgSO41.5，pH 5.5。

發(fā)酵培養(yǎng)基g/L：葡萄糖6，木糖44，KNO33.8，酵母粉4，KH2PO46，Na2HPO42，MgSO42，CaCl20.1，F(xiàn)eCl30.07，乙酸0–30，用NaOH調(diào)節(jié)pH至6.0。

1.2培養(yǎng)方法

將斜面菌株接入種子培養(yǎng)基中，搖瓶裝液量為20%，在搖床中以30 ℃、轉(zhuǎn)速180 r/min條件下培養(yǎng)24 h。搖瓶發(fā)酵采用500 mL三角瓶，培養(yǎng)基裝量100 mL，培養(yǎng)溫度30 ℃，轉(zhuǎn)速180 r/min，初始pH為6.0，接種量為10% (V/V) 。

1.3分析方法

1.3.1菌體生物量的測(cè)定

離心收集菌體，用去離子水洗滌兩次，60 ℃烘干至恒重，生物量以每升發(fā)酵液含干菌體的質(zhì)量表示。

1.3.2發(fā)酵液成分的測(cè)定

實(shí)驗(yàn)中殘?zhí)橇考耙种莆餄舛炔捎酶咝б合嗌V法 (島津公司LC-20A) 測(cè)定，色譜柱型號(hào)Aminex?HPX-87H柱 (Bio-Rad 美國(guó))，柱溫65 ℃，流動(dòng)相0.005 mol/L H2SO4，流速為0.8 mL/min，進(jìn)樣量20 μL，葡萄糖、木糖和乙酸用RID-10A檢測(cè)器檢測(cè)。

1.3.3油脂含量的測(cè)定

發(fā)酵液離心集菌，菌體沉淀按每克濕菌10 mL的比例加入4 mol/L鹽酸，振蕩混勻，75 ℃水浴處理2 h，冷卻后加入2倍體積氯仿∶甲醇 (1∶1) 提取液，充分振蕩混勻后，以5 000 r/min離心5 min，用分液漏斗，取氯仿層，再加入10 mL氯仿，重復(fù)前述操作，合并有機(jī)相后，蒸餾揮發(fā)除去氯仿即得粗油脂[12]。

1.3.4油脂成分的測(cè)定

取微生物油脂100 mg，加0.6 mol/L KOH-甲醇溶液2 mL和正己烷2 mL后，劇烈振蕩2 min，在30 ℃放置15 min，加水5 mL，靜置分層。取正己烷層利用氣相色譜分析脂肪酸成分。氣相色譜工作條件：氣相色譜儀島津GC-2010，毛細(xì)管氣相色譜柱FFAP-CB，F(xiàn)ID檢測(cè)器，程序升溫，初始柱溫180 ℃，保持0.5 min，然后以10 ℃/min的升溫速率升至250 ℃，保持6 min；進(jìn)樣口溫度為250 ℃，檢測(cè)器溫度為260 ℃[17]。

2　結(jié)果與討論

2.1混合糖培養(yǎng)基中乙酸濃度對(duì)油脂產(chǎn)量的影響

在葡萄糖濃度為6 g/L、木糖濃度為44 g/L的混合糖培養(yǎng)基中添加乙酸，考察粘紅酵母對(duì)乙酸的耐受性，乙酸的添加量分別為0、4、6、8、10和12 g/L，粘紅酵母細(xì)胞生長(zhǎng)、底物消耗、以及油脂合成情況如圖1所示。在不添加乙酸的混合糖培養(yǎng)基中，發(fā)酵進(jìn)行至86 h結(jié)束，油脂產(chǎn)量為1.77 g/L，油脂含量為13.4%。乙酸的添加影響細(xì)胞生長(zhǎng)，在發(fā)酵初期，細(xì)胞生長(zhǎng)速率均低于對(duì)照。當(dāng)培養(yǎng)基中乙酸的添加量低于10 g/L時(shí)，菌體生長(zhǎng)和油脂合成隨著乙酸濃度的增加而逐漸升高，乙酸添加量為10 g/L時(shí)，生物量、油脂產(chǎn)量、油脂含量和得率均達(dá)到最高，分別為16.07 g/L、4.80 g/L、29.4%和11%，較對(duì)照組分別提高了21.5%、171.2%、121.6%和175%。當(dāng)乙酸添加量大于10 g/L時(shí)，油脂產(chǎn)量、油脂含量與得率均大幅度下降，乙酸濃度為12 g/L時(shí)，油脂產(chǎn)量、油脂含量和得率分別為1.72 g/L、18.3%和6%，與添加10 g/L乙酸相比，分別下降了64.2%、38.8%和45.5%。由以上結(jié)果可知，當(dāng)乙酸濃度低于10 g/L時(shí)，油脂合成受到了促進(jìn)。

從液相色譜測(cè)定結(jié)果來(lái)看，發(fā)酵結(jié)束時(shí)，乙酸濃度均降為0 g/L，由此表明，粘紅酵母可在一定濃度范圍內(nèi)代謝乙酸合成油脂。Xiong等在其研究中也觀(guān)察到了乙酸可以促進(jìn)真皮毛孢子菌油脂合成的現(xiàn)象[18]。在適宜pH條件下，乙酸更多地以解離形式存在，從而很難穿過(guò)細(xì)胞膜造成細(xì)胞毒性，有些產(chǎn)油酵母可將乙酸作為碳源進(jìn)行發(fā)酵，因此促進(jìn)了油脂的合成。而當(dāng)乙酸濃度高于10 g/L時(shí)，油脂產(chǎn)量顯著下降，這主要是由于在培養(yǎng)過(guò)程中伴隨著乙酸根離子的消耗，培養(yǎng)環(huán)境pH升高，達(dá)到堿性，從而對(duì)菌體生長(zhǎng)和油脂合成造成影響[19]。

從底物代謝情況來(lái)看 (圖1A、圖1B)，當(dāng)葡萄糖、木糖和乙酸同時(shí)存在時(shí)，葡萄糖被優(yōu)先利用。葡萄糖消耗完，木糖的消耗速率并未迅速增加，而此時(shí)乙酸進(jìn)入快速代謝，當(dāng)乙酸濃度降至較低水平時(shí)，木糖代謝速率則顯著增加。因此，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，3種底物代謝的順序是葡萄糖優(yōu)于乙酸，乙酸優(yōu)于木糖。

圖1　粘紅酵母在添加乙酸的混合糖培養(yǎng)基中底物消耗 (A)、乙酸代謝 (B) 及細(xì)胞生長(zhǎng) (C) 過(guò)程Fig. 1 Sugar consumption (A), acetic acid consumption (B) and cell growth (C) of Rhodotorula glutinis in mixed sugar medium with acetic acid addition.

2.2粘紅酵母以乙酸為單一碳源合成油脂

由前面結(jié)果可知，在混合糖培養(yǎng)基中添加一定濃度的乙酸可促進(jìn)粘紅酵母油脂的合成，推測(cè)粘紅酵母可代謝乙酸合成油脂，因此，本文進(jìn)一步探討了粘紅酵母以乙酸為唯一碳源時(shí)細(xì)胞生長(zhǎng)和油脂合成情況。乙酸的初始濃度分別為15、20、25、30 g/L，細(xì)胞生長(zhǎng)、底物消耗及油脂合成情況如圖2所示。

由圖2可知，粘紅酵母能夠以乙酸為唯一碳源進(jìn)行油脂合成，隨著乙酸初始濃度的增加，菌體生長(zhǎng)遲滯期逐漸延長(zhǎng)。發(fā)酵進(jìn)行至36 h時(shí)，以15 g/L乙酸為底物的培養(yǎng)基中菌體濃度為5.4 g/L，而此時(shí)以20、25、30 g/L乙酸為底物的培養(yǎng)基中，菌體幾乎沒(méi)有生長(zhǎng)，但遲滯期過(guò)后，菌體能夠生長(zhǎng)并且進(jìn)行油脂的合成，表明粘紅酵母對(duì)乙酸有較強(qiáng)的耐受性。乙酸初始濃度為25 g/L時(shí)，油脂產(chǎn)量和油脂含量最高，分別為3.20 g/L和24.2%；乙酸初始濃度為15 g/L時(shí)，生產(chǎn)強(qiáng)度最高，為34 mg/(L·h)。當(dāng)乙酸初始濃度為30 g/L時(shí)，菌體的生長(zhǎng)和油脂合成受到了顯著抑制，發(fā)酵結(jié)束時(shí)，剩余乙酸濃度為12.37 g/L。高濃度乙酸的抑制作用還是比較明顯的，在發(fā)酵過(guò)程中，乙酸被菌體利用，pH值升高，盡管粘紅酵母生長(zhǎng)的pH范圍較廣，在搖瓶中，過(guò)高的pH值是影響菌體生長(zhǎng)的一個(gè)重要因素[19]。從得率上看，初始濃度分別為15、20、25、30 g/L的乙酸培養(yǎng)基中，油脂得率相當(dāng)，說(shuō)明不同的底物濃度影響油脂產(chǎn)量和生產(chǎn)強(qiáng)度，但并不影響得率。

粘紅酵母以乙酸為唯一底物進(jìn)行油脂合成時(shí)，其對(duì)乙酸的代謝速率高于含有乙酸的混合糖培養(yǎng)基。其原因一方面是由于混合糖培養(yǎng)基中總糖濃度已達(dá)50 g/L，過(guò)高的乙酸添加會(huì)引起底物抑制的現(xiàn)象；另一方面，在混合糖培養(yǎng)基中，葡萄糖優(yōu)先代謝，葡萄糖代謝完，乙酸代謝速率才顯著增加。而以乙酸為唯一碳源時(shí)則避免了上述兩方面的影響，因此，以乙酸為唯一碳源時(shí)，粘紅酵母能夠代謝更高濃度的乙酸，且對(duì)乙酸的代謝速率更快。

Lee等研究了釀酒酵母利用乙酸的代謝途徑，發(fā)現(xiàn)釀酒酵母可將乙酸轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶A，其反應(yīng)式可表示為：Acetate+ATP+CoASH?Acetyl-CoA+AMP+ Ppi，此反應(yīng)是被乙酰輔酶A合成酶所催化[20-21]。乙酰輔酶A是脂肪合成的第一步，乙酰輔酶A的形成為產(chǎn)油酵母利用乙酸合成微生物油脂提供了可能性。Christophe等檢測(cè)了彎曲隱球菌Cryptococcus curvatus對(duì)乙酸的利用能力，先用15 g/L的葡萄糖培養(yǎng)基對(duì)彎曲隱球菌進(jìn)行培養(yǎng)，當(dāng)葡萄糖被消耗殆盡，且生物量積累到一定程度時(shí)，再添加乙酸為碳源進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，乙酸的添加量為5 g/L，總油脂產(chǎn)量為2.4 g/L[22]。彎曲隱球菌也可以利用乙酸、丙酸、丁酸的混合酸培養(yǎng)基合成微生物油脂，當(dāng)混合酸濃度為6.5 g/L時(shí)，油脂產(chǎn)量為0.32 g/L[23]。Li等報(bào)道了淺白色隱球酵母 Cryptococcus albidus利用乙酸合成微生物油脂的能力，當(dāng)乙酸濃度為30 g/L時(shí)，其油脂產(chǎn)量達(dá)到最高，為0.96 g/L[24]。本文研究結(jié)果表明，粘紅酵母對(duì)乙酸具有較高的耐受性，且具有利用乙酸合成油脂的能力。

2.3微生物油脂成分分析

將粘紅酵母利用乙酸或混合糖 (葡萄糖6 g/L；木糖44 g/L) 制得的微生物油脂的成分進(jìn)行分析，并與大豆油的組成成分進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果如表1所示。由表1可知，粘紅酵母利用乙酸為唯一碳源合成的油脂組成為棕櫚酸、硬脂酸、油酸、亞油酸和亞麻酸，與大豆油脂及以混合糖為底物合成的微生物油脂成分相似。與植物油相比，粘紅酵母合成的微生物油脂中，油酸含量較高，而亞油酸含量低于植物油，以乙酸為底物時(shí)，生成的油脂中飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸含量分別為40.9%和59.1%，油脂不飽和度為67.5。生物柴油中必須含有一定量的不飽和脂肪酸從而防止油脂固化，不飽和脂肪酸有利于柴油均勻燃燒，保持較高的熱功率，但是脂肪酸不飽和度高于133.13的生物柴油在燃燒過(guò)程中易導(dǎo)致甘油三酯的聚合反應(yīng)，產(chǎn)生沉積物，不利發(fā)動(dòng)機(jī)的潤(rùn)滑[25]。以上結(jié)果表明粘紅酵母以乙酸為底物制得的油脂可作為制備生物柴油的原料。

圖2　粘紅酵母以乙酸為唯一碳源的乙酸代謝 (A) 和細(xì)胞生長(zhǎng) (B) 過(guò)程Fig. 2 Acetic acid consumption (A) and Cell growth (B) of Rhodotorula glutinis with acetic acid as single carbon source.

表1　粘紅酵母利用混合糖或乙酸合成微生物油脂的脂肪酸組成Table 1 Lipid composition of R. glutinis with mixed sugar or acetic acid as substrates

3　結(jié)論

本文研究了乙酸對(duì)粘紅酵母細(xì)胞生長(zhǎng)和油脂合成的影響，結(jié)果表明，粘紅酵母具有較高的乙酸耐受性并可以利用乙酸進(jìn)行油脂合成。在初始葡萄糖、木糖濃度分別為6 g/L和44 g/L的混合糖培養(yǎng)基中，當(dāng)乙酸添加量低于10 g/L時(shí)，不會(huì)對(duì)菌體生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制作用，同時(shí)還對(duì)油脂合成起到促進(jìn)作用。粘紅酵母可以以乙酸為唯一碳源合成油脂，乙酸初始濃度為25 g/L時(shí)，油脂產(chǎn)量和油脂含量分別可達(dá)3.20 g/L和24.2%。油脂成分分析結(jié)果表明，粘紅酵母以乙酸為底物制得的油脂可以作為制備生物柴油的油脂原料。

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支撐架(圖2)的作用首先是用于承受壓裝時(shí)裝置所受的的軸向載荷，在裝置吊運(yùn)時(shí)承受整個(gè)裝置的重力，要求結(jié)構(gòu)呈360°等分，剛度大。為此我們?cè)O(shè)計(jì)成采用Q235材料的工字型的六根梁，并且在兩邊各焊了25 mm厚的Q235鋼板作為加強(qiáng)筋，焊后去應(yīng)力退火。其次，支撐架將作為液壓站、拉桿連接套、電接點(diǎn)壓力表、吊耳等的載體，面積較大，我們將這些零部件，均勻地布置在支撐架的上方，避免吊運(yùn)時(shí)發(fā)生傾斜。

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(本文責(zé)編郝麗芳)

Lipid synthesis by an acidic acid tolerant Rhodotorula glutinis

Zhangnan Lin, Hongjuan Liu, Jian’an Zhang, and Gehua Wang
Institute of Nuclear and New Energy Technology, Tsinghua University, Beijing 100084, China

Abstract:Acetic acid, as a main by-product generated in the pretreatment process of lignocellulose hydrolysis,significantly affects cell growth and lipid synthesis of oleaginous microorganisms. Therefore, we studied the tolerance of Rhodotorula glutinis to acetic acid and its lipid synthesis from substrate containing acetic acid. In the mixed sugar medium containing 6 g/L glucose and 44 g/L xylose, and supplemented with acetic acid, the cell growth was not inhibited when the acetic acid concentration was below 10 g/L. Compared with the control, the biomass, lipid concentration and lipid content of R. glutinis increased 21.5%, 171% and 122% respectively when acetic acid concentration was 10 g/L. Furthermore, R. glutinis could accumulate lipid with acetate as the sole carbon source. Lipid concentration and lipid yield reached 3.20 g/L and 13% respectively with the initial acetic acid concentration of 25 g/L. The lipid composition was analyzed by gas chromatograph. The main composition of lipid produced with acetic acid was palmitic acid, stearic acid, oleic acid, linoleic acid and linolenic acid, including 40.9% saturated fatty acids and 59.1% unsaturated fatty acids. The lipid composition was similar to that of plant oil, indicating that lipid from oleaginous yeast R. glutinis had potential as the feedstock of biodiesel production. These results demonstrated that a certain concentration of acetic acid need not to be removed in the detoxification process when using lignocelluloses hydrolysate to produce microbial lipid by R. glutinis.

Keywords:Rhodotorula glutinis, microbial lipid, acetic acid, corncob hydrolysate, fermentation

Corresponding authors: Hongjuan Liu. Tel/Fax: +86-10-89796086; E-mail: liuhongjuan@tsinghua.edu.cn Jian’an Zhang. E-mail: zhangja@tsinghua.edu.cn