宋紹征，朱孟敏，袁玉國(guó)，榮耀，徐晟，陳思，梅珺琰，成勇 揚(yáng)州大學(xué) 獸醫(yī)學(xué)院 江蘇省轉(zhuǎn)基因動(dòng)物制藥工程研究中心，江蘇 揚(yáng)州 2250092 江蘇省動(dòng)物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 揚(yáng)州 225009

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轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶介導(dǎo)的山羊β-乳球蛋白基因敲除和人乳鐵蛋白基因定點(diǎn)整合

宋紹征1,2，朱孟敏1，袁玉國(guó)1,2，榮耀1，徐晟1，陳思1，梅珺琰1，成勇1,2
1 揚(yáng)州大學(xué) 獸醫(yī)學(xué)院 江蘇省轉(zhuǎn)基因動(dòng)物制藥工程研究中心，江蘇 揚(yáng)州 225009
2 江蘇省動(dòng)物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 揚(yáng)州 225009

宋紹征, 朱孟敏, 袁玉國(guó), 等. 轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶介導(dǎo)的山羊β-乳球蛋白基因敲除和人乳鐵蛋白基因定點(diǎn)整合. 生物工程學(xué)報(bào), 2016, 32(3): 329–338.

Song SZ, Zhu MM, Yuan YG, et al. BLG gene knockout and hLF gene knock-in at BLG locus in goat by TALENs. Chin J Biotech, 2016, 32(3): 329–338.

摘 要:為了敲除山羊乳中致敏源β-乳球蛋白 (BLG) 基因，同時(shí)在BLG基因座定點(diǎn)整合人乳鐵蛋白 (hLF)基因。首先針對(duì)山羊BLG第3外顯子識(shí)別位點(diǎn)設(shè)計(jì)了1對(duì)特異性TALEN-3-L/R質(zhì)粒對(duì)；同時(shí)，構(gòu)建了含有1個(gè)HSV-TK負(fù)篩選基因的hLF基因打靶載體BLC14-TK。TALENs質(zhì)粒對(duì)轉(zhuǎn)染山羊胎兒成纖維細(xì)胞，2 μg/mL嘌呤霉素篩選3 d，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序來(lái)驗(yàn)證其切割DNA活性。打靶載體BLC14-TK與TALEN-3-L/R質(zhì)粒對(duì)共轉(zhuǎn)染山羊胎兒成纖維細(xì)胞，經(jīng)700 μg/mL G418 和2 μg/mL GCV共篩選藥物抗性細(xì)胞株；通過(guò)整合檢測(cè)和同源重組檢測(cè)來(lái)篩選hLF基因打靶細(xì)胞株；BLG–/hLF+打靶細(xì)胞株作為供核細(xì)胞進(jìn)行山羊體細(xì)胞核移植。結(jié)果為：TALEN-3-L/R致突變率為25%?30%；獲得BLG–/hLF+打靶細(xì)胞6株；共制作重構(gòu)胚胎335枚，移植受體山羊23只，B超檢測(cè)到30?35 d的妊娠受體9只 (妊娠率39.1%)，其中1只50日齡克隆胎兒驗(yàn)證為BLG–/hLF+基因型。以上結(jié)果表明獲得BLG基因座定點(diǎn)整合hLF基因的基因打靶山羊是可行的，為培育羊乳中含低致敏原和富含hLF的山羊新品系奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞:TALENs，人乳鐵蛋白，BLG，基因打靶，體細(xì)胞核移植

Received: June 28, 2015; Accepted: October 15, 2015

Supported by: National Major Special Projects on New Cultivation for Transgenic Organisms (No. 2011ZX08008-004), Priority Academic Program ?Development of Jiangsu Higher Education Institutions, Graduate Research and Innovation Projects in Yangzhou University (No. CXLX-1435).

國(guó)家轉(zhuǎn)基因生物新品種培育重大專項(xiàng) (No. 2011ZX08008-004)，江蘇高校優(yōu)勢(shì)學(xué)科建設(shè)工程資助項(xiàng)目，揚(yáng)州大學(xué)研究生科研創(chuàng)新計(jì)劃項(xiàng)目 (No. CXLX-1435) 資助。

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2015-11-11 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20151111.1619.003.html

隨著人類生活品質(zhì)的提高，對(duì)乳品質(zhì)的要求也越來(lái)越高[1]。由于山羊乳更接近于人乳，成為牛乳過(guò)敏癥患者最理想的替代乳品[2]。β-乳球蛋白 (BLG) 是山羊乳的主要過(guò)敏源之一，山羊乳可通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)進(jìn)行人乳化改造，降低乳汁中過(guò)敏源和增加人乳鐵蛋白 ( H u m a n lactoferrin，hLF) 成分，可以提高羊奶的品質(zhì)和質(zhì)量，使其更具消費(fèi)價(jià)值[3]。人乳鐵蛋白是一種最初在人乳汁中發(fā)現(xiàn)的鐵結(jié)合蛋白，分子量大小為80 kDa[4]，具有廣泛的抗菌活性。現(xiàn)在已有很多轉(zhuǎn)基因動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器來(lái)生產(chǎn)人乳鐵蛋白的報(bào)道[5-6]，在牛[7]和山羊[8]中，已經(jīng)成功培育出轉(zhuǎn)hLF基因的克隆動(dòng)物，但到目前為止還沒(méi)有定點(diǎn)敲入hLF基因山羊的報(bào)道。

TALE (Transcription activator-like effector)是一類轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)蛋白[9]，利用TALENs可使DNA雙鏈發(fā)生斷裂，引發(fā)生物體的內(nèi)源性修復(fù)機(jī)制，介導(dǎo)同源重組或非同源末端連接，能夠特異性地提高定點(diǎn)修飾的效率。通過(guò)TALENs介導(dǎo)的基因打靶技術(shù)，對(duì)致敏原乳蛋白基因進(jìn)行敲出，同時(shí)可定點(diǎn)引入人源的功能蛋白，利用內(nèi)源的乳腺特異性表達(dá)調(diào)控序列，在乳腺中特異性的表達(dá)人源蛋白，實(shí)現(xiàn)乳汁的人乳化，改善乳汁品質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。2004年孫麗新等將人乳鐵蛋白 (hLF) 基因在山羊β-酪蛋白基因位點(diǎn)定點(diǎn)插入，希望在家畜乳汁中特異性地高效表達(dá)人乳鐵蛋白，但最終未獲得基因打靶的山羊[10]。2007年Shen等報(bào)道了在山羊胎兒成纖維細(xì)胞中敲除山羊β-酪蛋白基因，希望能獲得降低乳過(guò)敏原性的山羊新品系[11]，但未能獲得基因打靶的山羊。

本研究應(yīng)用TALENs基因打靶技術(shù)，在山羊中敲除致敏原BLG基因，同時(shí)在BLG基因座定點(diǎn)敲入hLF基因，并通過(guò)體細(xì)胞核移植技術(shù)獲得基因打靶的克隆山羊胎兒。以此驗(yàn)證TALENs介導(dǎo)下BLG基因座基因編輯；hLF cDNA精確整合山羊BLG基因座染色體，為精準(zhǔn)轉(zhuǎn)基因分子育種建立基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1質(zhì)粒與菌種

TALENs質(zhì)粒及試劑盒購(gòu)自上海斯丹賽生物技術(shù)有限公司 (CMV-SP6-TALENs Vector Set，Cat No.: 1803-015)。BLC14質(zhì)粒菌種 (包含山羊BLG5'調(diào)控序列、CMV增強(qiáng)子、hLF cDNA、PolyA信號(hào)、NEO基因、山羊BLG3'調(diào)控序列)[12]，宿主菌為埃希氏大腸桿菌Escherichia coli DH5α，含有單個(gè)負(fù)篩選HSV-TK基因的質(zhì)粒Porf-hsv1tk (Invitrogen，4.4 kb)，均由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2引物

PCR引物設(shè)計(jì)借助于Primer Premier 5.0軟件完成，引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司和上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成 (表1)。

表1　檢測(cè)所用引物Table 1 Primers for detection

1.1.3主要試劑

DMEM/F12 (Hyclone，Cat No. D2906)，F(xiàn)BS (Hyclone，Cat No. SH30070.03)，Trypsin (Amresco，Cat No. 0458)，嘌呤霉素、M2、M16、透明質(zhì)酸酶、核熒光染料Hochest 33342、細(xì)胞松弛素B、6-甲基氨基蝶呤等均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；各種限制性內(nèi)切酶、DNA連接酶和DNA聚合酶購(gòu)自寶生物工程 (大連) 有限公司；DNA純化試劑盒購(gòu)自QIAGEN公司；TALEN快速構(gòu)建試劑盒購(gòu)自上海斯丹賽生物技術(shù)有限公司。其他未說(shuō)明試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純，分別購(gòu)自上海藥劑、上海生工生物工程有限公司、南京生興生物有限公司。

1.1.4實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

薩能奶山羊購(gòu)自杭州彩洋牧業(yè)有限公司，實(shí)驗(yàn)用白羊來(lái)自揚(yáng)大聯(lián)環(huán)藥業(yè)基因工程有限公司實(shí)驗(yàn)羊場(chǎng)。

1.2方法

1.2.1BLC14-TK打靶載體構(gòu)建

含有單個(gè)負(fù)篩選HSV-TK基因的質(zhì)粒Porf-hsv1tk經(jīng)XhoⅠ酶切線性化，純化后用Klenow酶補(bǔ)平末端。質(zhì)粒BLC14經(jīng)SalⅠ+ NotⅠ酶切并回收10 600 bp的片段，用Klenow酶補(bǔ)平末端；末端補(bǔ)平的Porf-hsv1tk片段與補(bǔ)平的BLC14片段連接獲得打靶載體BLC14-TK。

1.2.2TALENs核酸蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建

對(duì)于奶山羊基因組中BLG基因座的序列進(jìn)行TALENs的設(shè)計(jì)，奶山羊BLG基因序列(NCBI，emb|Z33881.1|，8 088 bp) 來(lái)自Nucleotide數(shù)據(jù)庫(kù)。根據(jù)TALENs核酸酶TAL Effector Nucleotide Targeter 2.0在線軟件，其網(wǎng)址為“https://tale-nt.cac.cornell.edu/node/add/talen”。

TALEN的識(shí)別位點(diǎn)位于山羊BLG第3外顯子，轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)下游，其中，L臂：3 959?3 974；R臂：3 992?4 008；spacer長(zhǎng)度為17 bp，見(jiàn)表2。

1.2.3山羊胎兒成纖維細(xì)胞的分離、培養(yǎng)

無(wú)菌手術(shù)取約35日齡山羊胎兒，D-Hank’s洗滌2次，去除頭、四肢、內(nèi)臟后，將剩余部分組織剪碎成約1 mm3大小，D-Hank’s洗滌3次；加入5 mL消化液 (0.05%胰酶+0.04% EDTA)，移液管反復(fù)吹打消化15 min；待溶液渾濁后，靜置1 min，取上層渾濁液于另一潔凈離心管，D-Hank’s液離心洗滌2次，細(xì)胞計(jì)數(shù)并用培養(yǎng)液 (含DMEM/F12+10% FBS) 調(diào)整密度至 5×105個(gè)/mL接種于六孔板中，置 CO2培養(yǎng)箱中，37 ℃、5% CO2、飽和濕度下靜置培養(yǎng)。剩余未消化組織重復(fù)上述步驟再次消化，直至組織塊基本消失。

表2　TALENs識(shí)別位點(diǎn)Table 2 Recognition sequence of TALENs

1.2.4TALENs特異性位點(diǎn)致突變活性檢驗(yàn)

收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期山羊胎兒成纖維細(xì)胞，用電轉(zhuǎn)染液洗滌離心后重懸細(xì)胞密度至1×106個(gè)/mL。TALEN-3-L/R質(zhì)粒經(jīng)QIAGEN試劑盒純化后溶于超純水中，細(xì)胞懸液中等比例加入TALEN-3-L/R質(zhì)粒，使其總濃度至10 μg/mL，在2 mm間隙電極杯中，以1.5 kV/cm、200 μs的條件電擊2次，靜置5 min，轉(zhuǎn)移到正常的培養(yǎng)液 (DMEM/F12+10% FBS) 中，接種到6孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度下的CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。24 h后加入2 μg/mL嘌呤霉素篩選，隔天換液1次，同時(shí)設(shè)置正常未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞作對(duì)照；3?4 d后待對(duì)照細(xì)胞全部死亡后，換正常培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)10?15 d后，觀察存活細(xì)胞。

待細(xì)胞匯合至80%左右時(shí)，收集存活細(xì)胞，提取DNA，進(jìn)行PCR檢測(cè)，引物分別為TALEN-3-a/b，序列詳見(jiàn)1.1.2的表1，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)上海華大基因科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.5hLF基因打靶細(xì)胞系的建立

打靶載體BLC14-TK經(jīng)NotⅠ酶切而線性化，使用QIAGEN膠回收試劑盒回收長(zhǎng)度為15 kb的DNA片段，溶解于無(wú)菌超純水中，與TALEN-3-L/R共轉(zhuǎn)染山羊胎兒成纖維細(xì)胞，基因濃度均為10 μg/mL，轉(zhuǎn)染方法同1.2.4，同時(shí)設(shè)置正常未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞作對(duì)照。

轉(zhuǎn)染36 h后，在培養(yǎng)液中添加G418 (700 μg/mL) 和GCV (2 μg/mL) 繼續(xù)篩選培養(yǎng)；篩選培養(yǎng)10?14 d后，即正常細(xì)胞對(duì)照組全部死亡時(shí)，挑取單克隆細(xì)胞株以正常培養(yǎng)液(DMEM/F12+10% FBS) 擴(kuò)大培養(yǎng)，收集細(xì)胞，其中1/2凍存 (DMEM/F12 + 10% DMSO + 20% FBS) 以作體細(xì)胞核移植供核細(xì)胞，另1/2提取DNA以作PCR檢測(cè)。

以單克隆細(xì)胞株DNA為模板，應(yīng)用CMV+LTF1/2引物進(jìn)行人乳鐵蛋白整合檢測(cè)，應(yīng)用TK1/2引物進(jìn)行TK基因檢測(cè)，NEO-3'-a/b引物進(jìn)行靶位點(diǎn)同源重組檢測(cè)，引物序列見(jiàn)1.1.2的表1。

1.2.6體細(xì)胞核移植試驗(yàn)羊的準(zhǔn)備

正常成年雌性白山羊?yàn)楣┵|(zhì)羊，于發(fā)情后第9?13天開(kāi)始注射FSH，連續(xù)3 d，每天2次，總劑量240?300 IU。第4天注射氯前列烯醇1 mL (0.1 mg)，第5天注射LHRH 50 μg。寄母羊同步發(fā)情。

1.2.7核移植、融合與激活

冷凍細(xì)胞于37 ℃復(fù)蘇后，貼壁細(xì)胞生長(zhǎng)至80%更換為0.5% FBS培養(yǎng)液中饑餓培養(yǎng)48 h，細(xì)胞懸浮于M2培養(yǎng)液備用。卵母細(xì)胞置于5 μg/mL Hochest33342 和7.5 μg/mL CB的M2中處理30 min，在熒光顯微鏡下去除細(xì)胞核與第一極體，并移入供核細(xì)胞。

重構(gòu)卵在M16培養(yǎng)液中培養(yǎng)30 min后進(jìn)行融合 (融合液: 0.3 mmol/L甘露醇+0.05 mmol/L氯化鈣+0.1 mmol/L 硫酸鎂+3% BSA)，條件為1.2 kV/cm、40 μs、2個(gè)脈沖。融合后在M16中培養(yǎng) 30 min 后觀察，未融合卵按上述條件重復(fù)1次。

融合卵在M16中培養(yǎng)5 h后開(kāi)始激活 (M16培養(yǎng)液+5 μmol/L 離子霉素+7.5 μg/mL CB)，精確控制5 min；然后在含2 mmol/L 6-DMAP和7.5 μg/mL CB的M16中培養(yǎng)5 h，最后移至M16培養(yǎng)液中直到胚胎移植[13-15]。

1.2.8胚胎移植與妊娠檢查

激活后的重構(gòu)卵在M16培養(yǎng)中培養(yǎng) (5% CO2，38 ℃)，挑取排出“第二極體”的胚胎 (單細(xì)胞)，通過(guò)手術(shù)法移入同步發(fā)情寄母山羊的輸卵管，每只受體移植5?20枚胚胎，在胚胎移植后30?35 d進(jìn)行B超檢查，妊娠羊單飼養(yǎng)，常規(guī)管理。

1.2.9克隆胎兒鑒定

無(wú)菌手術(shù)剖宮產(chǎn)取出50日齡克隆胎兒，并獲得細(xì)胞系，應(yīng)用跨NEO基因和山羊BLG-3’調(diào)控區(qū)外側(cè)的NEO-3'-a/b引物PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物測(cè)序，DNAStar軟件分析測(cè)序比對(duì)結(jié)果，進(jìn)行基因打靶鑒定。

2　結(jié)果與分析

2.1打靶載體BLC14-TK的構(gòu)建

將HSV-TK基因片段與線性化的BLC14片段連接，構(gòu)建了BLC14-TK打靶載體，其結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1。

圖1　BLC14-TK打靶載體結(jié)構(gòu)示意圖Fig. 1 The structure diagram of BLC14-TK targeting vector. BLG: goat β-lactoglobulin promoter; CMV: human cytomegalovirus immediate early promoter; hLF: human lactoferrin cDNA; PolyA: SV40early mRNA polyadenylation; Neo: neomycin resistance gene; TK: herpes simplex virus thymidine kinase (HSV-tk) gene.

2.2胎兒成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)

利用胰蛋白酶消化得到的原代胎兒成纖維細(xì)胞通常較小，胎兒成纖維細(xì)胞是一種貼壁細(xì)胞，通常呈梭形長(zhǎng)條狀。細(xì)胞群呈渦旋狀或者不規(guī)則排列，細(xì)胞密度過(guò)大時(shí)成纖維細(xì)胞會(huì)呈細(xì)長(zhǎng)條狀，細(xì)胞群會(huì)呈現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的白色群落。典型的胎兒成纖維細(xì)胞如圖2所示。

圖2　原代胎兒成纖維細(xì)胞 (100×)Fig. 2 P0generation of fetal fibroblast cells (100×).

2.3TALENs活性細(xì)胞PCR檢測(cè)和測(cè)序結(jié)果

TALENs-3-L/R質(zhì)粒轉(zhuǎn)染胎兒成纖維細(xì)胞后獲得了嘌呤抗性細(xì)胞，以提取細(xì)胞DNA為模板PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序進(jìn)一步驗(yàn)證了突變細(xì)胞系，見(jiàn)圖3。從圖上箭頭所示處開(kāi)始出現(xiàn)重疊套峰，此處位于山羊BLG基因第3外顯子(TALENs-3-L/R識(shí)別位點(diǎn))。根據(jù)重疊套峰的情況，可初步確定TALEN-3-L/R質(zhì)粒對(duì)在胎兒成纖維細(xì)胞中切割基因組DNA雙鏈的致突變活性為25%?30%之間。

圖3　TALEN-3-L/R PCR活性產(chǎn)物測(cè)序峰圖Fig. 3 The sequencing peak diagram of TALEN-3-L/R PCR products.

2.4人乳鐵蛋白基因打靶細(xì)胞系的驗(yàn)證

打靶載體BLC14-TK與TALEN-3-L/R質(zhì)粒對(duì)共轉(zhuǎn)染山羊胎兒成纖維細(xì)胞2×107個(gè)，經(jīng)G418和GCV篩選獲得34株藥物抗性細(xì)胞。

hLF基因整合檢測(cè)，獲得32株轉(zhuǎn)人乳蛋白基因細(xì)胞，PCR產(chǎn)物大小均為470 bp (圖4)。

通過(guò)對(duì)HSV-TK基因檢測(cè)從反面驗(yàn)證同源臂重組的可能性，經(jīng)PCR引物TK1/2對(duì)基因打靶細(xì)胞株DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物大小為780 bp(圖5)，有6株未檢測(cè)到TK基因。初步證明這6株細(xì)胞為同源重組細(xì)胞株，分別命名為T-1、T-2、T-3、T-4、T-5、T-6。

經(jīng)跨NEO基因和山羊BLG-3′外側(cè)的PCR引物NEO-3′-a/b對(duì)上述6株細(xì)胞進(jìn)一步進(jìn)行同源重組檢測(cè)，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為2 391 bp，證明該6株細(xì)胞均為打靶細(xì)胞株 (圖6)。

圖4　部分hLF整合檢測(cè)PCR圖Fig. 4 hLF transgenic integration analysis of PCR. M: DL-2000 DNA marker; P: BLC14-TK; vector1-15: transfected cell samples.

圖5　部分轉(zhuǎn)hLF基因細(xì)胞株的TK基因檢測(cè)PCR圖Fig. 5 PCR detection of the TK gene. M: DL-2000 DNA marker; P: BLC14-TK; vector1-16: transfected cell samples.

圖6　部分PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)hLF基因細(xì)胞株同源臂重組Fig. 6 Homologous recombination detection of hLF transgenic cells by PCR. M: λ-EcoT14Ⅰ digest DNA marker; 1–4: transfected cell samples.

表3　細(xì)胞核移植生產(chǎn)克隆胎兒統(tǒng)計(jì)Table 3 Details of production of cloned fetuses by nuclear transfer

圖7　BLG–/hLF+基因型克隆胎兒照片F(xiàn)ig. 7 The photo of cloned fetus with BLG–/hLF+.

圖8　B超檢查妊娠圖Fig. 8 The pregnancy by B-ultrasound.

2.5克隆胚的發(fā)育情況

如表3所示，共獲得430枚去核卵，融合后獲得352 枚重構(gòu)卵，融合率為81.9%；激活后的335枚重構(gòu)胚胎短暫培養(yǎng)后移入23只同步發(fā)情受體山羊輸卵管中，在移植后的30?35 d進(jìn)行B超診斷，9只懷孕，妊娠率為39.1%。手術(shù)剖宮產(chǎn)獲取1只50日齡胎兒 (T-4)，胎兒和B超檢查見(jiàn)圖7和8，測(cè)序比對(duì)結(jié)果如圖9所示，BK-94#胎兒與BLG-3’下游具有同源序列 (方框所示)，充分證明該胎兒為BLG基因座打靶胎兒，并建立細(xì)胞系。

圖9　BK-94打靶胎兒同源臂測(cè)序?qū)Ρ冉Y(jié)果圖Fig. 9 Sequence homology result of BK-94 targeting fetus.

3　討論

本研究應(yīng)用定向BLG基因座的基因置換和TALEN介導(dǎo)的基因打靶技術(shù)，獲得了BLG–/hLF+靶向性修飾細(xì)胞系及胎兒，在國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)報(bào)道[5-6]。動(dòng)物基因打靶技術(shù)可以對(duì)家畜遺傳基因進(jìn)行精確修飾，使家畜轉(zhuǎn)基因育種的隨機(jī)性轉(zhuǎn)變?yōu)榭煽匦?，有利于單一性狀的改良，降低了外源基因漂移和丟失的可能性，也降低了動(dòng)物轉(zhuǎn)基因育種的風(fēng)險(xiǎn)度。在乳汁中添加人乳鐵蛋白等功能成分，減少或去除致敏原，是乳產(chǎn)品人乳化改造重要途徑[3,16]。

早期有關(guān)基因打靶研究報(bào)道是應(yīng)用長(zhǎng)片段同源臂作為打靶載體獲得的，不僅其效率低，而且檢測(cè)和篩選繁瑣，并且導(dǎo)致后期基因打靶動(dòng)物克隆的困難。2004年，孫麗新等[10]將hLF基因在山羊β-酪蛋白基因位點(diǎn)定點(diǎn)插入的研究，Shen等[11]將人纖溶酶原激活物 (htPAm) 基因在山羊β-酪蛋白基因定點(diǎn)插入的研究，Marques等[17]在α1 (Ⅰ) 原骨膠原 (COL1A1)基因的3′非翻譯區(qū)引入人alpHa-1-antitrypsin (hAAT) 基因的研究，張學(xué)明等[18]在β酪蛋白基因位點(diǎn)敲入gdnf基因的研究，但是均沒(méi)有獲得基因打靶動(dòng)物個(gè)體。本研究中主要使用TALENs能夠明顯地提高打靶效率，主要是對(duì)山羊β-乳球蛋白 (BLG) 基因進(jìn)行敲除，同時(shí)定點(diǎn)整合hLF基因，成功地獲得了6株BLG–/hLF+基因打靶細(xì)胞株，結(jié)果顯示其基因打靶效率得到明顯提高。

TALEN是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)基因編輯技術(shù)，前幾年在微生物、植物和小鼠胚胎干細(xì)胞中有較多應(yīng)用報(bào)道[19-21]，在大家畜及動(dòng)物體細(xì)胞中應(yīng)用尚未見(jiàn)報(bào)道，本研究證實(shí)了TALEN能夠介導(dǎo)對(duì)靶向基因敲入和敲出。從34株藥物抗性細(xì)胞株中有6株為打靶細(xì)胞株 (效率高達(dá)17.6%)，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于經(jīng)典基因打靶的效率[22-23]。此外，本實(shí)驗(yàn)室保存的BLC14乳腺特異性表達(dá)載體含有hLF基因、CMV增強(qiáng)子及山羊BLG調(diào)控區(qū)，其穩(wěn)定表達(dá)能力在小鼠、山羊乳腺上皮細(xì)胞以及成體轉(zhuǎn)基因山羊乳腺中已經(jīng)得到了驗(yàn)證[12,15,24-25]。

本研究在山羊BLG基因座的第3外顯子上設(shè)計(jì)了TALENs的識(shí)別位點(diǎn)，左右臂長(zhǎng)度分別為16 bp、17 bp，spacer長(zhǎng)度為17 bp，TALENs作用時(shí)FokⅠ酶會(huì)形成一個(gè)異源二聚體的結(jié)構(gòu)。研究結(jié)果表明，這種TALENs在BLG基因座上的定點(diǎn)切割效應(yīng)同時(shí)會(huì)催化打靶載體(BLC14-TK) 在宿主動(dòng)物染色體BLG基因座上的同源重組事件，TALENs的這一作用在國(guó)內(nèi)外也鮮有報(bào)道。

本試驗(yàn)還表明，TALEN左臂的載體存在嘌呤霉素抗性基因有利于中靶細(xì)胞的早期篩選，因?yàn)猷堰拭顾睾Y選可以殺死幾乎所有的正常細(xì)胞 (非轉(zhuǎn)基因的細(xì)胞)，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行NEOr+和GCV–篩選，減少或消除了假陽(yáng)性細(xì)胞的殘留，這樣極大地提高了細(xì)胞篩選的效率，更有利于細(xì)胞的聚集。這一結(jié)果雖然目前僅在BLG基因座和胎兒成纖維細(xì)胞上獲得成功，但從試驗(yàn)原理來(lái)看，在其他基因座及細(xì)胞系基因打靶研究中應(yīng)該也具有借鑒作用。

總之，本研究共獲得6株hLF基因打靶細(xì)胞作為供核細(xì)胞，制備重構(gòu)胚移植23只受體，30–35 d B超檢測(cè)到妊娠受體9只，獲得1只50日齡打靶胎兒，并建立細(xì)胞系。這些結(jié)果表明TALENs介導(dǎo)和編輯的基因打靶胎兒成纖維細(xì)胞在去核山羊卵母細(xì)胞中具有恢復(fù)發(fā)育全能性和發(fā)育成個(gè)體的能力，同時(shí)山羊BLG基因的部分敲除和hLF基因敲入未影響胚胎早期的發(fā)育。但9只受體均未出生羔羊的結(jié)果似乎提示中靶細(xì)胞對(duì)胎兒中后期的發(fā)育有一定干擾或影響，但體細(xì)胞克隆出現(xiàn)中后期胎兒停止發(fā)育也是比較公認(rèn)的因素[13,23]，因此，相關(guān)后續(xù)研究有必要繼續(xù)進(jìn)行。

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(本文責(zé)編陳宏宇)

BLG gene knockout and hLF gene knock-in at BLG locus in goat by TALENs

Shaozheng Song1,2, Mengmin Zhu1, Yuguo Yuan1,2, Yao Rong1, Sheng Xu1, Si Chen1, Junyan Mei1, and Yong Cheng1,2
1 Jiangsu Provincial Research Center for Animal Transgenesis and Biopharming, College of Veterinary Medicine, Yangzhou University, Yangzhou 225009, Jiangsu, China
2 Jiangsu Co-innovation Center for Prevention and Control of Important Animal Infectious Diseases and Zoonosis, Yangzhou 225009, Jiangsu, China

Abstract:To knock out β-lactoglobulin (BLG) gene and insert human lactoferrin (hLF) coding sequence at BLG locus of goat, the transcription activator-like effector nucleases (TALEN) mediated recombination was used to edit the BLG gene of goat fetal fibroblast, then as donor cells for somatic cell nuclear transfer. We designed a pair of specific plasmid TALEN-3-L/R for goat BLG exon Ⅲ recognition sites, and BLC14-TK vector containing a negative selection gene HSV-TK, was used for the knock in of hLF gene. TALENs plasmids were transfected into the goat fetal fibroblast cells, and the cells were screened three days by 2 μg/mL puromycin. DNA cleavage activities of cells were verified by PCR amplification and DNA production sequencing. Then, targeting vector BLC14-TK and plasmids TALEN-3-L/R were co-transfected into goat fetal fibroblasts, both 700 μg/mL G418 and 2 μg/mL GCV were simultaneously used to screen G418-resistant cells. Detections of integration and recombination were implemented to obtain cells with hLF gene site-specific integration. We chose targeting cells as donor cells for somatic cell nuclear transfer. The mutagenicity of TALEN-3-L/R was between 25% and 30%. A total of 335 reconstructed embryos with 6 BLG–/hLF+targeting cell lines were transferred into 16 recipient goats. There were 9 pregnancies confirmed by ultrasound on day 30 to 35 (pregnancy rate of 39.1%), and one of 50-day-old fetus with BLG–/hLF+was achieved. These results provide the basis for hLF gene knock-in at BLG locus of goat and cultivating transgenic goat of low allergens and rich hLF in the milk.

Keywords:TALENs, human lactoferrin, BLG, gene targeting, somatic cell nuclear transfer

Corresponding author:Yong Cheng. Tel: +86-514-87979348; E-mail: ssz0610@163.com