成 楊，楊 陽，劉 振，趙 洋，楊培迪（湖南省農業(yè)科學院 茶葉研究所，國家茶樹改良中心 湖南分中心，湖南 長沙 410125）

?

雙價抗蟲基因轉化對茶籽生長發(fā)育影響的研究初探

成 楊，楊 陽，劉 振，趙 洋，楊培迪
（湖南省農業(yè)科學院 茶葉研究所，國家茶樹改良中心 湖南分中心，湖南 長沙 410125）

摘要：以保存本所茶樹資源圃的黃葉峒茶和牛皮茶為研究對象，進行花粉管通道法轉基因操作研究，觀察其結實率和發(fā)芽率，初步探明了雙價抗蟲基因轉化對茶籽生長發(fā)育的影響。

關鍵詞：花粉管通道法；轉基因；茶籽；生長發(fā)育

轉基因技術是將人工分離和修飾過的基因導入到生物體基因組中，由于導入基因的表達，引起生物體的性狀的可遺傳的修飾，這一技術稱之為轉基因技術（Transgene technology），是目前世界各國現(xiàn)代生物技術產(chǎn)業(yè)研究的重點。通過轉基因方法使茶樹獲得抗蟲基因，可以很好的解決茶樹蟲害問題，同時解決茶樹農藥殘留和農藥使用對茶園生態(tài)環(huán)境造成的破壞和污染問題。在茶樹轉基因的研究上，已經(jīng)有了很多的研究成果，但是真正獲得擁有穩(wěn)定轉入基因的植株很少［1，2］。

花粉管通道法操作簡便、直接，直接將部分DNA片段轉入受體基因組，性狀容易穩(wěn)定；且在試驗過程中不需要經(jīng)過愈傷組織階段，繞過了茶樹轉基因操作上的一大難題［3］?；ǚ酃芡ǖ婪ㄊ且环N較早出現(xiàn)也較成熟的轉基因方法，在多種作物的轉基因研究上尤其是轉基因抗蟲棉花上取得了非常良好的效果［4］。然而花粉管通道法轉化成功率低，且轉化操作會影響結實率和萌發(fā)率［5，6］，因此在轉化成果的鑒定上，存在一定難度。本研究連續(xù)三年開展Bt和Cpti雙價抗蟲基因轉化試驗對茶籽生長發(fā)育情況的影響研究，以便為茶樹花粉管通道法轉基因研究提供參考。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

1.1.1材料

選取種植于湖南省農業(yè)科學院茶葉研究所（湖南省茶葉研究所）種質資源圃中處于盛花期的黃葉峒茶（第一年受體）和牛皮茶（第二年增加的受體）為受體材料。菌株為天根生物科技有限公司提供的E.coil DH5α 感受態(tài)菌株。質粒為上海生工生物工程有限公司合成的含有Bt 和Cpti 抗蟲基因序列的卡那霉素抗性T載體質粒。

1.1.2儀器

培英科技有限公司生產(chǎn)的HZC-250恒溫振蕩培養(yǎng)箱、上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠生產(chǎn)的XMTD-204數(shù)顯式恒溫水浴鍋、德國eppendorf公司生產(chǎn)的Mastercycler PCR儀以及Cenrrifuge5417R冷凍高速離心機、北京市六一儀器廠生產(chǎn)的DYY-7C型電泳儀。

1.2實驗方法

1.2.1質粒DNA的轉化與擴增

將T 載體質粒轉入E.coil DH5α 感受態(tài)菌株當中，將轉化后的菌株制成4 個不同濃度梯度的菌液，分別涂在加入了50 mg/L 的卡那霉素作為抗原的LB 固體培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，37℃恒溫培養(yǎng)16 h，挑取單菌株加入到裝有100 mL的LB 液體培養(yǎng)基的三角瓶（250 mL）當中，37℃下150 r/min 的恒溫搖床中震蕩培養(yǎng)20h［7］。

1.2.2DNA 的制備

SDS 堿裂解法提取質粒DNA［8］，制成低密度DNA 提取液并進行檢測。

1.2.3花粉管通道法轉化

開花后1～2 h內進行人工授粉，授粉1 h 后去除花冠，沿與柱頭成45°左右切除約1/3 柱頭，將5μL DNA 提取液滴于柱頭上。掛牌標記并摘去其所在枝上其他未經(jīng)處理的茶花，次日重復滴注1 次，自然成熟后收獲茶籽。

1.2.4 花發(fā)育情況和茶籽發(fā)芽率的統(tǒng)計

自茶花接受過轉化處理后，每個月觀察一次，通過觀察茶花子房的顏色和飽滿度，來判斷其是否正常發(fā)育，第二年10月份霜降前后收取茶籽并統(tǒng)計結實率。與前兩年的結實率進行對比。

前一年收取的茶樹種子在實驗室中培養(yǎng)，選取處理后種子30粒，未處理種子60粒，進行對照實驗。用溫水浸3～4 h，水溫20℃～25℃。事先做好發(fā)芽盤，盤底要鉆些漏水的小孔，以免積水。盤內底層先墊一層吸水紙，紙上鋪1.5 cm厚的干凈細沙。然后將溫水浸好后的茶籽，取出平攤在沙上，再在攤好的茶籽上蓋一層薄沙，灑水濕潤，放入恒溫培養(yǎng)箱中加溫催芽。箱內溫度保持在25℃～30℃之間，發(fā)芽盤的細沙要保持濕潤，每天加水通氣兩、三次［9］。

2　結果與分析

2.1接種后的茶樹結實率

對2012～2014年連續(xù)三年接種后花的發(fā)育與結實率情況進行統(tǒng)計，結果表明，三年間花朵正常發(fā)育率平均為33.93%，結實率為16.25%（表1）。

表1　2012～2014年接種茶花發(fā)育和結實情況Table 1 The inoculated tea fower seeding rate in 2012～2014

2.2接種后茶籽發(fā)芽情況

將2013年接種后的茶籽與普通茶籽進行沙培，并對發(fā)芽情況進行調查，結果表明：接種后所收獲茶籽的發(fā)芽率（16.7%）要遠低于對照普通茶籽的發(fā)芽率（33.3%和40.0%），說明茶樹Bt和Cpti雙價抗蟲基因轉化試驗對茶籽的生長發(fā)育有著明顯的負面影響。

表2　接種后茶籽與普通茶籽發(fā)芽情況Table 2 The germination rate of inoculated tea seeds and common tea seads

3　討論

綜合觀察三年的接種茶花發(fā)育情況，在進行花粉管通道法的操作之后，結實率最高沒有超過20%，最低的一年只有12.5%。而對比2012年［10］和2013年實驗的茶籽發(fā)芽率來看，進行了轉化操作的茶籽發(fā)芽（出苗）率為普通茶籽的一半左右。

綜上所述，花粉管通道法對茶籽發(fā)芽（出苗）率的負面影響是非常明顯的，這一點與許珺然等所做的實驗結論基本一致［6，11］。由于茶樹雜交后結實率的范圍非常廣泛［12］，因此實驗當中茶樹結實率雖然略偏低，但基本在正常范圍內，這一點與許珺然等和李興林、王曉娟的實驗有一定差距［5， 6， 11］。一方面可能是因為接種時間對作物的影響，在許珺然的實驗中，就明確提出進行轉化時間越靠后，結實率越高［11］；另一方面也可能是因為本實驗中所用外源DNA濃度僅有許珺然等人實驗的一半［6］，濃度相對偏低。除此之外，茶樹極長的結實周期也可能有一定的影響。這一方面的研究將在下一階段中具體進行。

由此可見，花粉管通道法本身成功率較低，必須依靠大量的實驗樣本來提高取得轉化成功樣本的概率，同時做好實驗室培養(yǎng)操作，盡量提高茶籽的發(fā)芽率［9］。

參考文獻

［1］ 譚和平， 周李華， 錢杉杉， 等. 茶樹轉基因技術研究進展［J］.武漢植物學研究， 2009， 27（3）： 323-326.

［2］ 項威， 史成穎， 賀志榮， 等.根癌農桿菌介導茶樹轉基因體系的建立［J］.安徽農業(yè)大學學報， 2012， 39（5）： 721-724.

［3］ 龔秦秦， 沈慰芳， 周光宇. 授粉后外源DNA導入植物技術——DNA通過花粉管通道進入胚囊［J］. 中國科學（B），1988（6）： 611-614.

［4］ 喻樹迅， 范術麗. 國產(chǎn)轉基因棉花研發(fā)及產(chǎn)業(yè)化［J］. 生物產(chǎn)業(yè)技術， 2010， （3）： 35-41.

［5］ 李興林， 王曉娟.外源DNA導入麥類作物結實率的研究［J］.天津科技大學學報. 2006；21（3）： 5-7.

［6］ 許珺然， 張顯， 張勇， 等. 抗菌肽基因Gnk2-1經(jīng)花粉管通道法導入西瓜的初步研究［J］. 園藝學報， 2014， 41（4）： 1467-1475.

［7］ 梁建慶， 葉志華， 江秀梅， 等. 轉化條件對質粒DNA轉化大腸桿菌的影響［J］. 微生物學雜志， 2004（4）： 15-17.

［8］ 石瀅， 崔巖， 趙莉佩， 等. 球形孢子絲菌DNA提取方法的比較［J］. 中國真菌學雜志， 2015， 10（4）： 216-219.

［9］ 張玉翠. 茶樹種苗的鑒定和檢驗技術［J］. 中國種業(yè)， 2004，（5）： 39-40.

［10］ 成楊， 趙洋， 楊培迪， 等. 茶樹Bt和Cpti雙價抗蟲基因轉化研究（簡報）［J］. 茶葉通訊， 2014， 41（4）： 41-43.

［11］ 許珺然. 花粉管通道法轉化抗菌肽基因Gnk2-1到西瓜的研究［D］. 咸陽：西北農林科技大學， 2014.

［12］ 李家賢， 何玉媚. 茶樹人工雜交結實習性的試驗探討［J］. 廣東茶業(yè)， 1999（04）： 18-22.

The effect of the Transformation of the Dual Resistance Gene on the Growth of Tea Seeds

CHENG Yang，YANG Yang，LIU Zhen，ZHAO Yang，YANG Pei-di
（Tea Research Institute of Hunan Academy of Agricultural Sciences， Changsha， 410125， China）

Abstract：The experiment studied the effect of the transformation of the Dual Resistance Gene on the growth of tea seeds by observation of seed rate and germination rate. The tea cultivars used in this experiment are Huangyetongcha and Niupicha planted in the Tea Germplasm Garden of Hunan Tea Research Institute. And the gene transformation method is Pollen Tube Pathway.

Key words：Pollen Tube Pathway， Gene transformation， Tea seed， Germination rate

中圖分類號：S571.1

文獻標識碼：A

文章編號：1009-525X（2016）01-35-37

收稿日期：2015-12-22

修訂日期：2016-01-13

基金項目：國家現(xiàn)代農業(yè)產(chǎn)業(yè)技術體系建設專項（CARS-23）、湖南省農業(yè)科學院創(chuàng)新團隊

作者簡介：成楊（1985-），男，江蘇南通人，助理研究員，主要從事茶樹育種研究。