雷 雨，段繼華，羅 意，黃飛毅，康彥凱，郭嘉懿，董麗娟，李賽君（湖南省農業(yè)科學院 茶葉研究所，國家茶樹改良中心湖南分中心，農業(yè)部湖南茶樹及茶葉加工科學觀測實驗站，湖南 長沙 410125）

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茶樹新品系“53-34”父本的EST-SSR標記鑒定

雷 雨，段繼華，羅 意，黃飛毅，康彥凱，郭嘉懿，董麗娟，李賽君*
（湖南省農業(yè)科學院 茶葉研究所，國家茶樹改良中心湖南分中心，農業(yè)部湖南茶樹及茶葉加工科學觀測實驗站，湖南 長沙 410125）

摘要：本研究采用EST-SSR標記對茶樹新品系“53-34”及其母本和4個可能父本進行了分析。結果表明： 24對引物共檢測到69個等位位點，平均2.88；53-34與湘波綠及4個可能父本的相同位點數(shù)分別占其擴增總位點數(shù)的85.71%、71.43%、65.71%、60.00%、74.26%，最大為湘波綠，最小為福云7號。6份供試材料間相似系數(shù)變幅為0.44～0.77，平均0.57。根據相似系數(shù)矩陣按UPGMA法進行聚類，在相似系數(shù)平均值0.57處可將參試的6份材料劃分為三大類：第Ⅰ類高芽齊；第Ⅱ類湘波綠、53-34與古藺牛皮茶；第Ⅲ類云大72-04與福云7號。參試材料的相似系數(shù)和親緣關系樹狀圖在分子水平上顯示了53-34的4個可能父本中，古藺牛皮茶與其親緣關系最近，可能為53-34的父本。

關鍵詞：茶樹；53-34；EST-SSR；父本鑒定

茶樹育種一直是世界主要產茶國的重點工程，也是各國茶葉產業(yè)發(fā)展的基礎。目前茶樹種質創(chuàng)新利用和新品種選育的主要手段是單株選育和雜交育種，而雜交育種是茶樹創(chuàng)造種質變異的主要方式［1］。茶樹新品系“53-34”是以湘波綠為母本，與高芽齊（國家級良種）、福云7號（國家級良種）、古藺牛皮茶［2］（四川省級良種）及云大72-04（我所從云南大葉種實生后代中選育的一個株系）四個品種（系）的混合花粉人工雜交授粉選育而成。由于為混合花粉，因此確定其父本對開展53-34的鑒定、評價及利用具有重要意義。

DNA分子標記是以個體間遺傳物質內核苷酸序列變異為基礎的遺傳標記，是直接在DNA分子上檢測生物間的差異，是DNA水平遺傳變異的直接反映，不受環(huán)境與基因表達與否的限制，數(shù)量多、多態(tài)性高、遺傳穩(wěn)定［3］。分子標記根據原理不同分為RFLP、AFLP、RAPD、SSR、ISSR、STMS、SCAR、SNP等，現(xiàn)已廣泛應用于高密度遺傳圖譜的構建、基因定位和克隆、植物親緣關系鑒別及遺傳多樣性研究、分子標記輔助選擇育種等領域［4］。DNA分子標記技術應用于鑒別茶樹品種間的親子關系已有相關報道［5-10］。

EST-SSR（expressed sequence tag based simple sequence repeat）是在搜索 EST中微衛(wèi)星的基礎上，根據微衛(wèi)星兩側的已知序列來設計引物，進而對動植物進行標記研究的一種方法。ESTSSR標記具有多態(tài)性高、共顯性遺傳、技術簡單、重復性好、數(shù)量豐富和對基因組有很好的覆蓋性等特點［11-12］。本研究利用EST-SSR標記，結合參試材料間的相同位點比較、相似系數(shù)及在此基礎上的樹狀圖對茶樹新品系“53-34”及它的母本湘波綠和4個可能父本進行親緣關系和遺傳背景分析，以明確53-34的父本，進一步研究茶樹遺傳規(guī)律，為茶樹親本選配、單株選擇及分子標記輔助育種提供科學依據。

1　材料與方法

1.1材料

供試材料6份，分別為高芽齊、湘波綠、53-34、云大72-04、福云7號、古藺牛皮茶。2014年4下旬，在本所茶樹種質資源圃，取一芽二葉新梢，用液氮迅速冷凍后放入-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2方法

1.2.1DNA的提取

采用改進的SDS法［13］提取基因組DNA。 0.7%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質量，WF2800-D3B分光光度計（北京瑞利分析儀器公司）測定DNA濃度。

1.2.2引物合成

24對EST-SSR引物參照劉振等［14］和Zhao等［15］的引物編號和序列，由長沙鼎國生物技術有限公司合成。

1.2.3PCR擴增和產物檢測

PCR擴增在Mastercycler 5322型PCR儀（Eppendorf Biotech. Int’l Trade CO.，Ltd）上進行，擴增體系、凝膠電泳及銀染顯色參照姚明哲等［13］的方法。電泳在JY-SCZ7型電泳儀（北京六一儀器廠）上進行。用Tannon2500R凝膠成像儀（上海天能科技有限公司）拍照記錄。

1.3數(shù)據處理

利用人工方法讀帶，將電泳圖上可重復、清晰的條帶記為“1”，同一位置無帶或不易分辨的弱帶計為“0”，建立原始數(shù)據矩陣。計算每對引物擴增位點的多態(tài)性信息量（polymorphism information content， PIC），PIC= 1-ΣPi2，式中Pi表示第 i 個等位位點出現(xiàn)的頻率［16］。采用NTSYS2.1軟件［17］計算供試材料間的遺傳相似系數(shù)，按UPGMA （unweighted pair group method using arith- metic averages）法聚類，并繪制樹狀聚類圖。

2　結果分析

2.1引物擴增的等位位點數(shù)及多態(tài)性

24對引物在供試材料間共檢測到等位位點69個（表1），平均每對引物可檢測到2.88個，其中最多的為（引物A90）5個，最少的為2個（引物228、SSR8、A157、A113、1110、663、A58、A55、SSR4）。引物的多態(tài)性信息含量（PIC）最大為0.81，最小為0.23，平均0.51，同時多態(tài)性位點數(shù)占等位位點的比例達75%。以上結果說明所選用的24對SSR核心引物在參試材料間具有相對較高的多態(tài)性。

2.253-34與湘波綠及4個可能父本的相同位點比較

69個等位位點中，53-34共擴增出35個，其中湘波綠及4個可能的父本與其相同的位點數(shù)分別占其擴增總位點數(shù)的85.71%、71.43%、65.71%、60.00%、74.26%，具有相同位點數(shù)最多的是湘波綠，最少的是福云7號。除去53-34與湘波綠的相同位點數(shù)（共30個），53-34特有位點共5個，4個可能父本與其具有相同的特有位點數(shù)及所占的比例見表2，比例最大的為古藺牛皮茶（80%），最小的為高芽齊（40%）。

表1　24對引物在6個供試材料中的擴增結果Table 1 The amplifcation information of 24 pairs of primer in 6 accessions

表2　53-34與湘波綠及4個可能父本的等位位點比較Table 2 Comparison of allelic loci between 53-34 withxiangbolv and 4 possible male parents

2.3供試材料間的親緣關系

從表3可以看出，供試材料間的相似系數(shù)變幅為0.44～0.77，平均值為0.57。其中53-34與母本湘波綠的相似系數(shù)最大為0.77，四個可能的父本中，53-34與古藺牛皮茶的相似系數(shù)最大為0.62，表明它們之間的親緣關系較近；湘波綠與福云7號相似系數(shù)最小為0.44，表明它們之間的親緣關系較遠。根據相似系數(shù)矩陣按UPGMA法進行聚類，在相似系數(shù)平均值0.57處將參試的6份材料分為3類：第Ⅰ類高芽齊；第Ⅱ類湘波綠、53-34與古藺牛皮茶；第Ⅲ類云大72-04與福云7號。

表3　6個供試材料的相似系數(shù)Table 3 The similarity coeffcient of 6 accessions

3 　討論

相似系數(shù)是反映親緣關系遠近的直接證據，本研究中，與53-34相似系數(shù)最大的是母本湘波綠（0.77），其次是古藺牛皮茶（0.62），而且它們聚為了一類，說明53-34與湘波綠和古藺牛皮茶的遺傳背景相似度較高，古藺牛皮茶可能是53-34的父本。同時，53-34與母本及4個可能父本的等位位點比較情況也說明這一點，53-34與母本湘波綠和古藺牛皮茶所具有的相同位點數(shù)最多，比例最大。特有位點中，與古藺牛皮茶相同位點數(shù)比例達到80%。另外，從表型特征來看，53-34制紅綠茶品質均優(yōu)，有花香，具有母本湘波綠的優(yōu)點；同時又具有父本古藺牛皮茶較強的抗寒、抗旱能力，芽頭肥壯，葉大而光澤，這些均在一定程度上佐證了古藺牛皮茶是53-34的可能父本。

圖1　6份供試材料EST-SSR數(shù)據的UPGMA聚類分析樹狀圖Fig.1 Dendrogram of 6 individuals based on EST-SSR date using UPGMA clustering method

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Identification of Male Parents for “53-34” Tea Cultivar Based on SSR Markers

LEI Yu，DUAN Ji-hua，LUO Yi，HUANG Fei-yi，KANG Yan-kai，GUO Jia-yi，DONG Li-juan，LI Sai-jun*
（Tea Research Institute of Hunan Academy of Agriculture Sciences； National Center for Tea Improvement， Hunan Branch； Hunan Observation and Experiment Station of Tea Plant and Tea Processing，Ministry of Agriculture，P.R.China， Changsha 410125， China）

Abstract：EST-SRR primers were used to identify the male parents for 53-34 tea cultivar among 4 possible male parents. The result showed that totally 69 alleles were amplifed using 24 core EST-SSR primers， on average of 2.88.The percentage of common alleles with 53-34 is 85.71%， 71.43%， 65.71%， 60.00%， 74.26%， the maximum is Xiangbolv， the minimum is Fuyun 7. The similarity coeffcient among different cultivars varied from 0.44-0.77， on average of 0.57. The 6 accessions were classifed into 3 groups based on the UPGMA method with the similarity coeffcient at 0.57， and the group Ⅰcontained Gaoyaqi； the groupⅡcontained Xiangbolv， 53-34 and Gulin-niupicha； the groupⅢcontained Yunda 72-04，F(xiàn)uyun 7. The results of the similarity coeffcient and dendrogram showed a closer relationship between 53-34 and Gulinniupicha， Gulin-niupicha is the possible male parent of 53-34.

Key words：Tea， 53-34， EST-SSR， Male parents identifcation

中圖分類號：S571.1

文獻標識碼：A

文章編號：1009-525X（2016）01-28-31

收稿日期：2016-01-06

修訂日期：2016-01-25

項目基金：湖南省科技廳重大科技專項（2014FJ1006）

作者簡介：雷雨（1982-），女，常德石門人，助理研究員，主要從事茶樹種質資源與遺傳育種研究。

*通訊作者：李賽君，hnhjhlsj@126.com