顧洪濤，李映志，葉春海，陳 亮

(廣東海洋大學，廣東湛江 524000)

菠蘿蜜EST-SSR標記開發(fā)及其種質資源遺傳多樣性分析

顧洪濤，李映志*，葉春海*，陳 亮

(廣東海洋大學，廣東湛江 524000)

摘要[目的]分析菠蘿蜜EST-SSR標記的穩(wěn)定性和多態(tài)性揭示能力，并將其用于菠蘿蜜種質資源遺傳多樣性研究。[方法]利用已獲得的菠蘿蜜cDNA文庫中的EST 序列，通過搜索SSR序列，設計引物，PCR擴增后，銀染檢測擴增結果。[結果]設計開發(fā)出479對EST-SSR引物，其中399對能在菠蘿蜜上擴增出產(chǎn)物，282對具有多態(tài)性，多態(tài)性擴增引物占58.87%；從中選擇60對能夠清晰擴增的多態(tài)性引物，對64份菠蘿蜜種質資源進行遺傳多樣性分析，60對EST-SSR引物共擴增出188條帶，不同引物的擴增條帶數(shù)在2～11，平均3.13條；其中有168條為多態(tài)性條帶，多態(tài)率為89.36%；每對引物的多態(tài)信息含量(PIC)為 0.407 7～0.958 9，平均PIC為0.792 2，這說明供試材料具有較高的遺傳多樣性。系統(tǒng)聚類分析結果表明，在相似系數(shù)0.688 1處，可將64份菠蘿蜜種質資源分成二大類群，在相似系數(shù)0.732 5處，第二大類群又可分為4個亞群。[結論]EST-SSR 標記的多態(tài)性揭示能力強，用于分析菠蘿蜜種質遺傳多態(tài)性的能力強，其應用前景廣闊。

關鍵詞菠蘿蜜；EST-SSR；遺傳多樣性；種質資源

菠蘿蜜(ArtocarpusheterophyllusLam.)，又稱木菠蘿、樹菠蘿等，屬于桑科菠蘿蜜屬植物，起源于印度，引入我國已有1400多年的歷史[1]，在我國廣東、廣西、四川、海南和云南等地均有栽培[2]。近年來，隨著菠蘿蜜經(jīng)濟價值和用途越來越多地被人們所發(fā)現(xiàn)和重視，菠蘿蜜種植面積不斷擴大，對菠蘿蜜新品種的需求也日益強烈。分子標記是當前廣泛用于農作物新品種選育的重要輔助手段，但在菠蘿蜜中可利用的分子標記還很少。

EST(Expressed Sequence Tag)是由cDNA文庫克隆、測序獲得的序列，屬于基因編碼區(qū)。EST-SSR標記是在EST序列的基礎上，通過搜索SSR序列，根據(jù)其兩側的序列設計引物開發(fā)的一種分子標記。EST-SSR標記的開發(fā)避免了SSR開發(fā)的高成本、耗力耗時[3]等缺點，卻延續(xù)了SSR標記的典型優(yōu)點，即多態(tài)性高、重復性好、共顯性標記[4]等。由于EST序列來源于基因編碼區(qū)，與基因功能有關且高度保守，因此，EST-SSR標記可直接鑒定表達重要農藝性狀的基因，且在種間具有高度通用性。

近年來，鑒于EST-SSR標記的各種優(yōu)點，EST-SSR標記被廣泛應用于作物種質資源的遺傳多樣性分析和親緣關系鑒定，如小麥[5]、棉花[6]、辣椒[7]、梨[8]、荔枝[9]、越橘[10]等，但在菠蘿蜜中鮮見報道。筆者在測序獲得的菠蘿蜜EST序列基礎上，分析SSR序列特征并用以開發(fā)EST-SSR標記，并將其用于菠蘿蜜種質遺傳多樣性分析，以期為進一步開展種質鑒定、基因定位、圖譜構建等提供有力工具。

1材料與方法

1.1試驗材料從廣東海洋大學菠蘿蜜種質資源圃隨機選取64份菠蘿蜜種質，這64份種質主要來自雷州半島、海南和云南等地，只有小部分來自馬來西亞、巴基斯坦等國。采集種質的新鮮葉片，于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2方法

1.2.1基因組總DNA提取與檢測。液氮磨樣后，利用改良的CTAB大量法[11]提取基因組DNA，RNase A消化其中的RNA后，進行精提取，DNA沉淀用1×TE溶解，-20 ℃保存?zhèn)溆?。提取的DNA樣品使用0.8%瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計檢測DNA的質量和純度。

1.2.2EST-SSR引物開發(fā)。從NCBI中搜索并下載菠蘿蜜的EST序列，外加已獲得的菠蘿蜜EST序列，通過MISA軟件搜索SSR序列，再利用Primer 3.0 Plus軟件設計SSR引物，委托北京鼎國生物科技有限公司合成。

1.2.3EST-SSR引物擴增與篩選。從64份種質中選取8份形態(tài)性狀明顯差異的種質進行PCR擴增，篩選出能擴增出明顯條帶的引物。PCR擴增反應體系為20 μL，其中，DNA模板2 μg/mL,dNTPs溶液2 mmol/L，Taq酶50 U/mL，Mg2+溶液2 mmol/L,引物0.2 μmol/L，1×Taq酶Buffer溶液，用去離子水定容至20 μL。PCR反應程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR反應產(chǎn)物經(jīng)6%的非變性聚丙烯酰胺凝膠(PAGE)電泳后，用0.2%的AgNO3染色，含NaOH的甲醛溶液顯色。

1.2.4遺傳多樣性分析。從可擴增出清晰條帶的EST-SSR引物中，隨機選擇60對引物，對收集的64份菠蘿蜜種質進行遺傳多樣性分析。PCR反應體系及擴增程序同“1.2.3”。

1.3數(shù)據(jù)分析統(tǒng)計EST-SSR標記的帶型，有帶記為“1”，無帶記為“0”，空缺記為“—”。針對每對SSR引物，只讀其典型的共顯性SSR主帶(圖1a和1b)；對于不存在共顯性2條帶型的，即讀擴增出來的所有帶(圖1c)。統(tǒng)計所擴增的條帶總數(shù)、多態(tài)性條帶數(shù)，并計算多態(tài)性條帶所占比例和每個引物的多態(tài)信息含量(PIC)。利用NTSYSpc-Version 2.02j軟件處理“1、0”數(shù)據(jù)，首先用Similarity程序獲得相似系數(shù)矩陣，再利用UPGMA法進行聚類分析，獲得64份種質的親緣關系樹狀圖。

2結果與分析

2.1菠蘿蜜EST-SSR引物的篩選從菠蘿蜜EST序列共設計479對EST-SSR引物，其中有80對引物未擴增出PCR產(chǎn)物，能擴增出產(chǎn)物的引物399對，占83.30%。在能擴增出產(chǎn)物的引物中，有117對引物所擴增出的PCR產(chǎn)物無多態(tài)性，多態(tài)性引物282對，所占比例為58.87%。這說明由菠蘿蜜EST序列開發(fā)出的EST-SSR標記在菠蘿蜜DNA中有很好的擴增效果。

2.2菠蘿蜜EST-SSR標記的多態(tài)性從282對多態(tài)性引物中選擇60對能夠擴增出條帶清晰、多態(tài)性高、易統(tǒng)計的引物，對64份菠蘿蜜種質進行遺傳多樣性分析。擴增結果見圖1和表1。60對引物共擴增出188條帶，平均每個引物能擴增3.13條帶，不同引物擴增的條帶數(shù)在2～11，其中168條帶具有多態(tài)性，多態(tài)率為89.36%。每對引物的PIC為0.407 7～0.958 9，平均PIC為0.792 2，明顯大于0.500 0，這說明EST-SSR在64份菠蘿蜜種質上具有較高的遺傳多樣性揭示能力。

2.3菠蘿蜜種質的聚類分析利用NTSYSpc-Version 2.02j軟件對64份菠蘿蜜種質進行聚類分析，構建其親緣關系樹狀圖(圖2)。由圖2可知，60對EST-SSR引物擴增出的168條多態(tài)性條帶能夠將64份菠蘿蜜種質資源區(qū)分歸類，種質之間的遺傳相似系數(shù)在0.688 1～0.994 7，平均相似系數(shù)為0.841 4，這說明64份菠蘿蜜種間親緣關系較近。在相似系數(shù)0.688 1處，該64份種質可分為兩大組，第一組全部為干苞，第二組既有干苞，又有濕苞(13、25、31和32即為濕苞)。在相似系數(shù)0.732 5處，第二組又可分為4個亞組，4個亞組中干、濕苞仍未各自獨立聚為一類，這說明干、濕苞不能在DNA水平上完全分開。5和14號、10和11號的相似系數(shù)為0.994 7，這說明5和14、10和11號菠蘿蜜種質很可能來源于同一親本或起源于同一地區(qū)。

注：a、b、c分別為引物JeSB0001、JeSB0170、JeSB0134，M為DL1 000 DNA Maker，1～64為64份菠蘿蜜材料。Note：a，b and c were electrophoresis of JeSB0001，JeSB0170 and JeSB0134，respectively.M was DL1 000 DNA Marker；1-64 were 64 samples of A.heterophyllus.圖1　64份菠蘿蜜種質EST-SSR標記電泳圖譜Fig.1　Electrophoresis of EST-SSR markers in 64 germplasms of A.heterophyllus

序號Code引物名稱Primername引物序列(5'-3')Primersequence等位位點數(shù)Allelelocus多態(tài)性位點PolymorphismlocusPIC1JeSB0001F:TGGCTCCACCTCAATGTATAAAG,R:TGTTACATTTCTTGGAT-GAAGGG210.71482JeSB0006F:AATCAACAGATCTGCTCTTTCCC,R:TGAATGTTGAGGATTAGAAGT-GTGA330.87903JeSB0007F:GTATCGCTATTGAGGTTGTGCC,R:AAGAACAATTCGCCACAGAATTA220.73364JeSB0008F:GTGGGTTTTTGGAATCTTCTTCT,R:TGAAAATCCCAAGACTACTG-GAA330.91175JeSB0020F:GAAATTCTCAAGTCCCGAAAGAG,R:ATTCCATCCGGATTTAGAT-CAAC220.75236JeSB0021F:GTCCAGCAACTGTTGGATAGAAT,R:ATCCCGTAT-GTCTCTCTTTCTCC220.77147JeSB0023F:CTCTGCTTCCACTTCTGCTACTC,R:ATCCCCAAGCCCAATCTC220.75758JeSB0030F:AAATTGACCATTTTCCTCTCTCG,R:CTCTGTTTTTGTCCTCTGTCCTC320.83559JeSB0035F:GAAGATGAAGATCTGAGTTGGGA,R:TGATAAGAGTCCAACCTC-CAAAG220.672410JeSB0049F:CTCTTTGGCTTTCATTTCTTCAA,R:TTGAGGATTCTAAATTGAGCT-GC210.631811JeSB0050F:GCACGGATAACTGTTCAGACTTT,R:AAGCTGAACTTGCTCAGTTTT-GT320.871312JeSB0054F:CGACGGTGAAGAAGAAACAGA,R:CAACAAGAAGCCTTTATTTTCCC210.730213JeSB0057F:AGGAACAGAAACAGCACAGAGAG,R:AAGGACCTGATTGGAATTTT-GAA220.759714JeSB0067F:CCGCTTGAAGAAGTCGAGTAAT,R:AGCTCAGAACTCTCAAAAGCTCA320.601115JeSB0080F:GGTATTCGTACATCTTCTCGTCG,R:ATCACGCTCCCGAAGAAAAAC330.887216JeSB0094F:CCAAATACAATAGAGCAACGACC,R:TGTTGTAGTGTATTGAGC-CATCG220.745817JeSB0095F:CCAAATACAATACAGCAATGCCT,R:AGCCATCGTATGTCAT-CAAAGTT210.745118JeSB0096F:GGCCTAAGCAAAGTGTAACTCAA,R:TGCACTCTACTGCGGATA-AAAAT550.937119JeSB0101F:ATTGGAGATTGGCTCTTTGTCTT,R:TACTCCACGATTGTTTGT-GCTAA330.883120JeSB0102F:CACCTGATTTCATTTCTTCCGTA,R:GTACAGAGCATTCAAC-CCAGAAA210.679421JeSB0104F:GAGGCCAAAGAAGAAGATCAAGT,R:GTAAAGCAATGCTCGAAA-CAAAC550.896722JeSB0106F:GTCCTCCTCTTCTCCTTCTCCTT,R:CGAATCGAGGTCTAATTCTTGG220.745823JeSB0107F:ATAGCCTCCTCTTGAACTTCGAC,R:GTCTGTCAGCATCAACGAGT-TCT430.865724JeSB0108F:TATCAACCCAAATCCTTCCTTTT,R:AGGTCAGTGACGTG-TACGAGTTT430.935025JeSB0111F:CTTCAACAGTGTACTGAGAGCGT,R:CGCTAAAAGAGTCCTTG-GAGAAG320.407726JeSB0116F:TAAAGTCGAAGAAGGAATCTCCC,R:CGAGATACCTTAATCCCTCTC-CT440.933127JeSB0120F:ACCTAACCTCCGAATCTAAACCA,R:AAAAAGCACATAGCCTTAGAC-CC550.958928JeSB0123F:GAGAGAATGGTGCTGATAATTCG,R:CACTATGCTGTAATG-GAAGAGGG320.753329JeSB0125F:GTTAGAGGGAAAACCAAAAGAGC,R:ATATTCTCTTCACGAGAC-CCTCC330.742430JeSB0130F:TCATCTTCATCTTCTTCGTTGGT,R:GAGAGAAAATGGAAAGTGAAG-CA440.907631JeSB0133F:CGACGGCGAGTATAGAAGAGTAA,R:AGATTATTACCACTACCGC-CACC440.880332JeSB0134F:CCCATTTTTGTTCCTTTCTTTTT,R:ACCCTAACTTGGGTTTT-GATTTG11110.955733JeSB0135F:AATTTGCAGTTCGTACAGTGACC,R:TTCGATGATACGAAGGTCGAG440.916634JeSB0137F:AAGGAGATCCCCTGTTGCTC,R:CTTCTTCTAGGTGGCGTATCACC550.948935JeSB0145F:GTTCACAAGTTATTGGTGTGCAA,R:TGAAGGTGAAGATGAT-GATTTTGT330.809536JeSB0149F:TAGGCTTTGTATGAAACCCAAAA,R:TACATCAACCAGTAGCTCCA-CAA220.810437JeSB0150F:GGAGAGGAGAGGTCAGTTCTAGC,R:AGCGCTCTAAGAATTCTG-GTTTT330.654538JeSB0155F:ACTGCCTTAGAGAGGGAAAGAGA,R:TACACGCGTTTTACAGCTAAA-CA540.953439JeSB0161F:GAAACATAGGAGACCCACATGAA,R:ATAATGGTATCTCGGAGG-GAAAA220.757340JeSB0165F:ATGTTGAATATAATGGGCACCAG,R:AATGCAACAACAAAGTCAG-GATT310.499841JeSB0166F:GAGAAGGAGGAAGAGGATGAAGA,R:TTCGGATGTAATATGCATA-AGCTC220.779342JeSB0170F:TAGGGCATGAGTTTGACCACTAT,R:ACACCCCTTTTCTTCT-CAAAATC660.955743JeSB0171F:AGTGAGGAGGAGAAGGAGAAAGA,R:AAAAACCACACATCAT-CAAAAGC330.719544JeSB0174F:GAAGGACAATGATGACGAGAATC,R:TGACCCATTTGAGAAT-TCATCTT210.749545JeSB0179F:TCCCTGATCATCAAGTTTTTCTT,R:GCAGGAATTCCCTTCTTTTTA-AC220.764846JeSB0181F:CTGAGCTACAACCACAGCCA,R:CATCAACGACGAACACGAAC440.936447JeSB0185F:AAAACGTTACGCAACTACTGCTG,R:GTAGTGTTGGGGTGTGTCT-TAGC220.717048JeSB0187F:CTCAAGCTTCCCTTCTTCCTTC,R:TCTCGAGGTAGAGGATCTTTTCA430.882949JeSB0190F:GCATACAACGACCAGTTTCATAA,R:GCTCTTGTTGTTCTTAAGGTT-GAA220.608250JeSB0206F:CGAATAAGACCCATACTCATCT,R:AAAGAATTGAACAAGG-GAGAAGG330.733151JeSB0224F:AAGCTTGACCTCATCAATGTAGC,R:CTACATCCACACCTACGCTCTCT210.749852JeSB0233F:CGCAAAGAATCTGATAGAACAGC,R:GATTGACCCCTAAGAAAG-CAACT220.735253JeSB0235F:AAACTCAGAAGCTGTTTCAGGTG,R:AGACATGGACACCTCTGGT-GAAT210.749054JeSB0241F:GGTTTCTGAAATTGTGTTTCCTG,R:TTTTCTCCAAATTAGGGCTA-AGG880.984855JeSB0268F:TGAACTCAACTCTCCCTCTTCAC,R:ACCATCTTCATCATCACCATCAT330.895156JeSB0284F:AGCGTTTCAATGGTTTTAGCAG,R:GTCCTCTTTAACGACGCCTTTT220.545757JeSB0291F:GTCAGGAAATTGAAGCATTTTGG,R:CTGTTTATAATAGCTC-CCGGGTC320.876458JeSB0320F:CAGCAGCAACAGCAAACTAATC,R:TCTGGTTCTGTAAATTGAACTGC220.702959JeSB0326F:GTTGGAATTGCTAACAGTGTAGA,R:GTCTGCATCTCTCGCTTCCT330.894460JeSB0447F:CTTGCCCTTTTTCACTGTTTATG,R:TTTTGATTCTTGTGCAGTTGC-TA220.7186總計Total1881680.7922

注：13、25、31和32號為濕苞，其余均為干苞。Note:13, 25, 31 and 32 wer wet buds; others were dry buds.圖2　64份菠蘿蜜種質資源聚類圖Fig.2　UPGMA dendrogram of the 64 germplasms of A.heterophyllus

3討論

雖然分子標記技術較為成熟，并被廣泛應用于作物種質資源遺傳多樣性分析、基因組比較、遺傳圖譜構建、基因組關聯(lián)分析及QTL定位等，但在菠蘿蜜遺傳分析中的應用較少，主要是AFLP、ISSR、RAPD等。王艷紅[12]利用磁珠法發(fā)掘菠蘿蜜SSR分子標記，但效率偏低。EST-SSR標記由cDNA文庫中的EST序列設計而來，開發(fā)成本低，在種質資源遺傳分析方面具有獨特的優(yōu)越性，而且其呈現(xiàn)的是基因編碼區(qū)變異，是功能基因的直接鑒定與評價。

在該研究中，由菠蘿蜜EST序列設計出的479對SET-SSR引物中，能有效擴增出PCR產(chǎn)物的引物有399對，有效擴增率為83.30%，其中能產(chǎn)生多態(tài)性擴增產(chǎn)物的引物有282對，多態(tài)性擴增率為58.87%，高于董清華等[13]開發(fā)的草莓EST-SSR標記的多態(tài)性擴增率53.00%，顯著高于Eujayl等[14]開發(fā)的小麥EST-SSR標記的多態(tài)性擴增率16.00%。這表明由菠蘿蜜EST序列開發(fā)SSR標記具有較高的效率。

從多態(tài)性擴增引物中選擇清晰易讀的EST-SSR引物60對，對64份菠蘿蜜種質進行遺傳多樣性分析。結果表明，60對引物共擴增出188條帶，其中具有多態(tài)性的條帶數(shù)為168，占89.36%，顯著高于Li等[15]利用AFLP對50份菠蘿蜜種質分析的20.3%，高于葉春海等[16]利用RAPD對雷州半島菠蘿蜜種質分析的88.4%。每對引物的PIC在0.407 7～0.958 9，平均PIC為0.792 2，明顯大于0.500 0，這表明EST-SSR標記應用于菠蘿蜜研究不僅可行，還具有較高的多態(tài)性揭示能力。

該研究聚類結果仍未能將菠蘿蜜干、濕苞分開，這與王耀輝[17]的研究結果一致。但聚類分析所獲得的遺傳相似系數(shù)在0.688 1～0.994 7，平均相似系數(shù)為0.841 4，高于王耀輝[17]利用ISSR標記分析78份菠蘿蜜種質的相似系數(shù)0.502 3～0.944 7和平均相似系數(shù)0.766 6，還高于王艷紅[12]對菠蘿蜜種質聚類分析的相似系數(shù)0.576 3～0.965 5和平均相似系數(shù)0.814 0。這可能是因為64份菠蘿蜜種質資源親緣關系較近，但也不能排除是因為EST-SSR標記來源于cDNA文庫所致。cDNA文庫中的序列來自高度保守的基因編碼區(qū)，正因高度保守，在植物進化過程中，發(fā)生突變的概率相對較小，基因間差異也較小。

4結論

菠蘿蜜的EST-SSR 標記是一種高效的功能性標記，其引物開發(fā)設計過程簡單、省時省力，PCR擴增條帶清晰、效果穩(wěn)定，適用于菠蘿蜜種質資源之間的遺傳多樣性分析。該研究由EST設計開發(fā)的60對EST-SSR引物不僅能擴增出清晰的條帶，且64份種質的遺傳多樣性聚類分析結果體現(xiàn)出較高的多態(tài)性揭示能力。因此，隨著EST數(shù)據(jù)庫中EST序列的豐富，EST-SSR標記被越來越多地應用于菠蘿蜜種質資源研究，為促進菠蘿蜜種質資源的創(chuàng)新利用和遺傳改良奠定基礎。

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Development of EST-SSR Markers inArtocarpusheterophyllusLam. and Its Genetic Diversity Analysis of Germplasm Resources

GU Hong-tao, LI Ying-zhi*, YE Chun-hai*et al

(Guangdong Ocean University, Zhanjiang, Guangdong 524000)

Abstract[Objective] To analyze the stability and polymorphism reveal ability of EST-SSR markers in Artocarpus heterophyllus Lam., and to apply in genetic diversity analysis of germplasm resources. [Method] By using the obtained EST sequence in A. heterophyllus cDNA library, SSR sequences were searched, and primer was designed. After PCR amplification, the amplified results were detected by silver staining method. [Result] A total of 479 pairs of EST-SSR primers were designed. Among them, 399 pairs could amplify products in A. heterophyllus DNA, and 282 pairs had polymorphic bands, accounting for 58.87%. Then, 60 pairs of polymorphic primers were selected to analyze genetic diversity among 64 germplasms of A. heterophyllus. Sixty pairs of EST-SSR primers produced 188 bands; and the amplified bands per pair of primers ranged from 2 to 11 with an average of 3.13. Among them, there were 168 polymorphic bands, showing a polymorphic rate of 89.36%. Polymorphic information content (PIC) of each pair primers was 0.407 7 - 0.958 9 with an average PIC of 0.792 2, indicating that the test material had a higher genetic diversity. Cluster analysis showed that 64 A. heterophyllus germplasms were divided into two groups at the similarity coefficient of 0.688 1. The larger group was then divided into four subgroups at the similarity coefficient of 0.732 5. [Conclusion] EST-SSR markers of A. heterophyllus has strong polymorphism reveal ability, and can be used to identify genetic differences among different A. heterophyllus germplasms, showing broad prospects in application.

Key wordsArtocarpus heterophyllus Lam.; EST-SSR; Genetic diversity; Germplasm

基金項目廣東省科技計劃項目(2013B020304004)。

作者簡介顧洪濤(1990- )，女，湖北黃崗人，碩士研究生，研究方向：園藝作物遺傳育種。* 通訊作者，李映志，教授，博士，碩士生導師，從事園藝作物遺傳育種研究；*通訊作者，葉春海，教授，博士，博士生導師，從事園藝作物遺傳育種研究。

收稿日期2016-03-30

中圖分類號S 602

文獻標識碼A

文章編號0517-6611(2016)11-135-05