袁會蘭，邊晨凱，陳度宇，張 宇，許 雷

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院研究生院，北京 100081)

中華根瘤菌NP1亞硝酸鹽還原酶基因的表達(dá)和酶學(xué)性質(zhì)研究

袁會蘭，邊晨凱，陳度宇，張 宇，許 雷1*

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院研究生院，北京 100081)

摘要[目的]研究中華根瘤菌NP1(Sinorhizobium sp.NP1)中亞硝酸鹽還原酶基因(nir)的原核表達(dá)情況以及粗酶液的化學(xué)性質(zhì)。[方法]構(gòu)建該基因的原核表達(dá)載體pET32a-nir，然后對重組蛋白質(zhì)進行SDS-PAGE和Western blotting分析獲得NIR酶在原核生物中的表達(dá)情況。通過測定粗酶液對亞硝酸鹽降解情況研究相關(guān)酶學(xué)性質(zhì)。[結(jié)果]SDS-PAGE檢測結(jié)果表明，可溶性融合表達(dá)產(chǎn)物約為57 ku，其中亞硝酸鹽還原酶大小約40 ku，與酶分子量的預(yù)估值一致；Western blotting證實該蛋白可與根據(jù)亞硝酸鹽還原酶合成的多克隆抗體發(fā)生強陽性反應(yīng)；酶學(xué)性質(zhì)分析表明，亞硝酸鹽還原酶活力約為247.15 U/mL，最適pH 6.5，最適反應(yīng)溫度37 ℃，該酶對NaCl的耐受性為0.3 mol/L。[結(jié)論]亞硝酸鹽還原酶蛋白重組質(zhì)粒能在大腸桿菌系統(tǒng)中高效表達(dá)，研究其酶學(xué)性質(zhì)為生物清除提供了技術(shù)保障。

關(guān)鍵詞中華根瘤菌；亞硝酸鹽還原酶；原核表達(dá)；生物清除

亞硝酸鹽是自然界氮循環(huán)中的重要物質(zhì)，廣泛存在于土壤、水和植物中，同時也是目前養(yǎng)殖水體中魚類死亡的主要因子，嚴(yán)重威脅著水體中很多珍稀魚類和動物的生命安全。研究發(fā)現(xiàn)，亞硝酸鹽主要通過與魚體血紅素結(jié)合成高鐵血紅素，使魚體內(nèi)氧氣減少從而影響魚類的生理活動致其死亡[1-4]。隨著人們生活水平的提高，飲食習(xí)慣也發(fā)生了很大變化，很多食物中亞硝酸鹽成為誘發(fā)心血管疾病的因素之一[5]；亞硝酸鹽還是強致癌物亞硝胺的前體物質(zhì)，與食品中蛋白質(zhì)分解中間產(chǎn)物仲胺反應(yīng)形成亞硝胺，可誘發(fā)多種癌癥如肝癌和咽癌[6]等。此外，含氮化合物還是大氣中細(xì)顆粒物(PM2.5)成分之一，而PM2.5的大小對人類的身心健康有很大影響[7-8]。因此，實現(xiàn)亞硝酸鹽的生物清除具有重要的現(xiàn)實意義。

Sinorhizobiumsp.NP1為中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物學(xué)教研室分離的一株高效脫氮的異養(yǎng)硝化菌[9]。筆者利用已獲得的亞硝酸鹽還原酶基因(nir)[10]構(gòu)建該基因的原核表達(dá)載體，經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)，獲得具活性的粗酶液，并測定該酶的一些特性，以期為生物脫氮的工業(yè)應(yīng)用提供參考。

1材料與方法

1.1材料及主要試劑試驗菌株苜蓿中華根瘤菌NP1(Sinorhizobiumsp.NP1)為中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物學(xué)教研室分離。亞硝酸鹽還原酶基因(nir)(GenBank登錄號為FJ598613)。各限制性內(nèi)切酶、T4連接酶和Gene Walking試劑盒均購自大連寶生物工程有限公司?；蚪M和質(zhì)粒提取試劑盒以及膠回收試劑盒購自O(shè)mega公司。PCR引物及基因測序均由北京擎科生物技術(shù)有限公司完成。

1.2方法

1.2.1亞硝酸鹽定量測定方法。利用N-(1-萘基)-乙二胺光度法[11]對溶液中亞硝酸鹽進行定量測定，亞硝酸鹽最低檢出量為0.003 mg/L，最高檢出量為0.200 mg/L。若亞硝酸鹽濃度大于0.200 mg/L，需對樣品進行稀釋。

1.2.2亞硝酸鹽還原酶原核表達(dá)載體的構(gòu)建和表達(dá)。

1.2.2.1亞硝酸鹽還原酶原核表達(dá)載體的構(gòu)建。根據(jù)目的基因的序列，結(jié)合pET32a表達(dá)載體上的內(nèi)切酶切位點，設(shè)計nir帶酶切位點引物進行PCR擴增。

F-CGCGGATCCATGACTGAACAACTTC(BamHI)

R-CCCAAGCTTCTACATCGACGC(HindIII)

將純化后的PCR產(chǎn)物與PET32a分別用BamHI和HindIII雙酶切，酶切片段膠回收，T4 DNA連接酶連接，構(gòu)建nir原核表達(dá)載體。轉(zhuǎn)化后篩選插入nir基因的重組pET32a載體，提取重組載體，轉(zhuǎn)化BL21，篩選重組pET32a表達(dá)載體質(zhì)粒。

1.2.2.2SDS-PAGE和Western blotting分析鑒定表達(dá)產(chǎn)物。挑陽性克隆pET32a-nir在LB液體培養(yǎng)基中37 ℃、220 r/min過夜培養(yǎng)，1%接菌量轉(zhuǎn)接入LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至菌液A600為0.6～0.8，1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)nir的表達(dá)，誘導(dǎo)條件：30 ℃、180 r/min誘導(dǎo)2～3 h，然后用等體積PBS溶液洗2次，加2 mL PBS溶液進行超聲破碎(超聲3 s，停5 s，共10 min)，與4×Loading buffer混合后高溫煮10 min，再13 000 r/min離心10 min，取20 μL樣品進行SDS-PAGE電泳(5%濃縮膠電壓80 V，1 h，12%分離膠電壓120 V，時間2～3 h)，將其中一塊凝膠用考馬斯亮藍(lán)R250染色，另一塊凝膠進行100 mA過夜轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜結(jié)束后用麗春紅染色1～2 min，經(jīng)水沖洗后用含5%脫脂奶粉的TBST溶液封閉4 h，以500倍稀釋的中華根瘤菌NP1菌株亞硝酸鹽還原酶抗原免疫兔血清為一抗，500倍稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔血清為二抗進行免疫印跡分析。

1.2.3亞硝酸鹽還原酶粗酶性質(zhì)測定。

1.2.3.1亞硝酸鹽還原酶粗酶活力。挑取陽性克隆pET32a-nir和含空載體pET32a對照組菌在LB液體培養(yǎng)基中37 ℃、220 r/min過夜培養(yǎng)，1%接菌量轉(zhuǎn)接入LB液體培養(yǎng)基中37 ℃、220 r/min培養(yǎng)至菌液A600為0.6～0.8時，加入IPTG至終濃度為1 mmol/L，30 ℃、180 r/min誘導(dǎo)6 h。超聲破碎離心取上清獲得粗酶液。

1.2.3.2粗酶活力最適pH。用不同pH緩沖液和亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液配制底物溶液，分別調(diào)節(jié)pH為3.0、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、9.0、10.0和11.0，加入等量粗酶液，37 ℃下反應(yīng)2 h，測定粗酶活力。

1.2.3.3粗酶活力最適溫度。在最適pH條件下，分別于20、30、35、37、40、45、50和60 ℃水浴中測定粗酶活力。

1.2.3.4NaCl對粗酶活力的影響。在最適pH和溫度條件下，分別設(shè)置NaCl濃度為0、0.2、0.3、0.4、0.6、0.8、1.0和1.2 mol/L，測定粗酶活力。

2結(jié)果與分析

2.1亞硝酸鹽還原酶原核表達(dá)載體的構(gòu)建和表達(dá)

2.1.1亞硝酸鹽還原酶重組表達(dá)載體的構(gòu)建。 將已測序確認(rèn)含有目的片段的TA克隆質(zhì)粒，經(jīng)BamHI和HindIII酶切位點消化后切膠回收目的產(chǎn)物并在T4 DNA連接酶作用下與經(jīng)BamHI和HindIII酶消化的pET32a載體連接，轉(zhuǎn)化至表達(dá)菌株BL21，雙酶切(圖1)驗證成功獲得nir基因的重組表達(dá)載體pET32a-nir。提取表達(dá)菌株中質(zhì)粒DNA測序后證實，載體插入片段與目的基因序列完全一致，未發(fā)現(xiàn)堿基突變。

注： M.DL5 000分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，1.pET32a-nir酶切，2.pET32a酶切，3.PCR產(chǎn)物的酶切。Note： M.DL5 000 Marker；1.Digestion of recombinant plasmid pET32a-nir；2.Digestion of plasmid pET32a；3.Digestion of PCR product.圖1　表達(dá)載體雙酶切鑒定結(jié)果Fig.1　Electrophoresis of DNA samples digested with BamHI and HindⅢ

2.1.2SDS-PAGE和Western blotting分析鑒定表達(dá)產(chǎn)物。1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)后的宿主菌液經(jīng)超聲勻漿后取上清進行SDS-PAGE，結(jié)果見圖2。由圖2可知，誘導(dǎo)重組表達(dá)菌與誘導(dǎo)空載體菌相比目的蛋白大量表達(dá)，而未誘導(dǎo)的2種菌株蛋白質(zhì)表達(dá)量未見明顯差異。Western blotting免疫印跡顯示，中華根瘤菌NP1 亞硝酸鹽還原酶抗原免疫兔血清能與誘導(dǎo)重組表達(dá)菌的57 ku蛋白帶發(fā)生強陽性反應(yīng)，而空載體菌在相應(yīng)位置未檢測到免疫反應(yīng)條帶。樣品中免疫反應(yīng)雜帶較多可能是由于合成的多克隆抗體(圖3)。

注： M.蛋白marker，1.pET32a-nir誘導(dǎo)，2.pET32a誘導(dǎo)，3.pET32a-nir未誘導(dǎo)，4.pET32a未誘導(dǎo)。Note：M.Protein marker，1.Induced expression of pET32a-nir，2.Induced expression of pET32a，3.No induced expression of pET32a-nir，4.No induced expression of pET32a.圖2　誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析Fig.2　SDS-PAGE analysis of the products induced expression

注： M.蛋白marker；1.pET32a-nir誘導(dǎo)，2.pET32a誘導(dǎo)，3.pET32a-nir未誘導(dǎo)，4.pET32a未誘導(dǎo)。Note：M.Protein marker，1.Induced expression of pET32a-nir，2.Induced expression of pET32a，3.No Induced expression of pET32a-nir，4.No Induced expression of pET32a.圖3　誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物的Western blotting分析Fig.3　Western blotting analysis of the products induced expression

2.2亞硝酸鹽還原酶酶學(xué)性質(zhì)

2.2.1亞硝酸鹽還原酶粗酶活力。測得該酶粗酶液活力為247.15 U/mL，可用于后續(xù)試驗。

2.2.2最適pH。由圖4可知，在pH為5～8時，酶活力較高，反應(yīng)的最適pH為6.5；對照組空載體未檢測到明顯酶活性。

圖4　pH對亞硝酸鹽還原酶活力的影響Fig.4　Effects of pH on the activity of NIR

2.2.3最適溫度。由圖5可知，在溫度為30～45 ℃時酶活力均較強，酶活力最適溫度為37 ℃。當(dāng)溫度低于20 ℃時，酶活力較低；當(dāng)溫度高于55 ℃時，酶活力基本喪失。對照組空載體未檢測到明顯酶活性。

圖5　溫度對亞硝酸鹽還原酶活力的影響Fig.5　Effects of temperature on the activity of NIR

2.2.4NaCl對粗酶活力的影響。由圖6可知，當(dāng)NaCl濃度低于0.3 mol/L時，對酶活力影響較?。划?dāng)NaCl濃度再增加時該酶活性受到抑制，逐漸降低直至無活性。水產(chǎn)養(yǎng)殖的水體中存在一定的鹽濃度，淡水鹽濃度一般不超過0.05%，海水平均鹽濃度為3.5%。因此，利用該粗酶液可以在淡水養(yǎng)殖中通過快速去除水體中亞硝酸鹽發(fā)揮重要作用。

圖6　NaCl對亞硝酸鹽還原酶活力的影響Fig.6　Effects of NaCl on the activity of NIR

3結(jié)論與討論

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Expression of Nitrite Reductase Gene ofSinorhizobiumsp. NP1 and the Enzymatic Properties

YUAN Hui-lan, BIAN Chen-kai, CHEN Du-yu, XU Lei*et al

(Graduate School of Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081)

Abstract[Objective] To study the prokaryotic expression and enzymatic properties of nitrite reductase gene of Sinorhizobium sp. NP1. [Method] Prokaryotic expression vector pET32a-nir was constructed. Then, Western blotting and SDS-PAGE analysis were performed to study its expression in prokaryote. The enzyme properties were studied by measuring the degradation of nitrite. [Result] The result of SDS-PAGE showed that the fusion expression product was about 57 ku, including 40 ku target protein, which was consistent with the molecular weight of the enzyme. Western blotting confirmed that the protein had a strong positive reaction with the polyclonal antibody which was synthesized by NIR. Enzymatic properties analysis showed that the activity of the enzyme was 247.15 U/mL, the optimum reaction pH value was 6.5, the optimum reaction temperature was 37 ℃, the tolerance to NaCl was 0.3 mol/L. [Conclusion] The recombinant plasmid of NIR could be efficiently expressed in E. coli, and the study of enzymatic properties provides a technical support for the biological removal of .

Key wordsSinorhizobium sp.; Nitrite reductase; Prokaryotic expression; Biological removal of

基金項目國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃資助項目(2006AA10C413)。

作者簡介袁會蘭(1987-)，女，山東菏澤人，碩士研究生，研究方向：微生物分子生物學(xué)與基因工程。*通訊作者，研究員，從事環(huán)境微生物與分子生物學(xué)研究。

收稿日期2016-03-28

中圖分類號Q 812

文獻標(biāo)識碼A

文章編號0517-6611(2016)11-132-03