金日生， 徐冰彥，袁傳勛*

(1.合肥工業(yè)大學(xué)農(nóng)產(chǎn)品生物化工教育部工程研究中心，安徽合肥 230009;2.中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院林產(chǎn)化學(xué)工業(yè)研究所，江蘇南京 210042)

響應(yīng)面法優(yōu)化酶法提取油茶籽餅粕多糖工藝

金日生1,2， 徐冰彥1，袁傳勛1*

(1.合肥工業(yè)大學(xué)農(nóng)產(chǎn)品生物化工教育部工程研究中心，安徽合肥 230009;2.中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院林產(chǎn)化學(xué)工業(yè)研究所，江蘇南京 210042)

摘要[目的]提高油茶籽餅粕多糖的提取率。[方法]以榨油后的油茶籽餅粕為原料，利用酶水解與傳統(tǒng)熱水浸提相結(jié)合的方法提取油茶籽餅粕多糖。考察了中性蛋白酶、纖維素酶、半纖維素酶及果膠酶對(duì)油茶籽餅粕多糖提取率的影響，對(duì)提取工藝中酶解溫度、酶解時(shí)間、酶添加量分別進(jìn)行單因素試驗(yàn)，在此基礎(chǔ)上利用3因素3水平的響應(yīng)面法優(yōu)化工藝參數(shù)。[結(jié)果]中性蛋白酶法提取油茶籽餅粕多糖的酶解最佳工藝條件為酶解溫度40 ℃、酶解時(shí)間120 min、加酶量2.0%，此工藝條件下粗多糖得率為15.66%，是優(yōu)化前得率7.65%的2.05倍。[結(jié)論]該方法提取率高，是一種有效的油茶籽餅粕多糖提取方法。

關(guān)鍵詞油茶籽餅粕；多糖；酶法；單因素試驗(yàn)；響應(yīng)面分析

油茶是山茶科山茶屬多年生喬木，是我國(guó)特有的木本油料作物[1]。油茶籽餅粕是油茶籽榨油后的殘余物，年平均產(chǎn)量約為39.71萬(wàn)t[2]。油茶籽餅粕中除含有油脂外，還有蛋白質(zhì)、糖類等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[3]。研究表明，油茶籽餅粕主要含有多糖15%～30%，茶皂素10%～15%，粗蛋白10%～15%[4]。據(jù)報(bào)道，油茶籽多糖具有抗血栓[5]、降血糖血脂、抗動(dòng)脈粥樣硬化、降血壓、防治心血管疾病等作用[6]；此外，其對(duì)增加血清凝集素抗體、增強(qiáng)機(jī)體免疫力以及修復(fù)代謝紊亂也有明顯效果[7]。而目前油茶籽粕大部分被用作清塘劑、肥料和燃料，甚至被廢棄，少量用于茶皂素的提取，極少部分用作飼料，造成了很大的浪費(fèi)。因此，加大對(duì)油茶籽副產(chǎn)物尤其是油茶籽粕資源的綜合利用，開發(fā)油茶籽粕多糖，對(duì)提高油茶資源綜合利用率、延長(zhǎng)產(chǎn)業(yè)鏈均具有重要意義。

目前，油茶籽餅粕多糖提取方法有熱水浸提法、醇提法、發(fā)酵法、微波輔助提取、超聲波輔助提取等[7-10]。由于酶法作用條件溫和、操作相對(duì)簡(jiǎn)單且具有較高的提取率，也常用于多糖的提取[11]。王維香等采用復(fù)合酶解法提取裙帶菜硫酸多糖，與單純熱水浸提相比，該法可提高硫酸多糖提取率，多糖得率達(dá)7.76%[12]。王元鳳等比較了熱水提取、果膠酶提取、復(fù)合酶提取3種方法對(duì)茶多糖提取效果的影響，結(jié)果表明，熱水提取后的茶渣采用復(fù)合酶在最佳條件下(pH 5.5、加酶量0.5%、溫度40 ℃、時(shí)間3 h)提取，茶多糖的提取率為3.29%，是水提的2.70倍[13]。目前少見酶法輔助提取油茶籽餅粕多糖的報(bào)道，因此，筆者進(jìn)行了酶法提取油茶籽餅粕多糖的研究工作。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1原料及主要試劑。油茶籽餅粕，安徽大別山科技開發(fā)有限公司。中性蛋白酶(活性:100 U/mg)、果膠酶(活性:100 U/mg)、纖維素酶(活性:30 U/mg)、半纖維素酶(活性:30 U/mg)，合肥博美生物科技有限公司。磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、98%濃硫酸、苯酚、無(wú)水乙醇等，均購(gòu)自于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，均為分析純。

1.1.2主要儀器設(shè)備。752N紫外可見分光光度計(jì)，上海儀電分析儀器有限公司；數(shù)顯恒溫水浴鍋，上海申勝生物技術(shù)有限公司； LG10-2.4A離心機(jī)，北京醫(yī)用離心機(jī)廠；RE52CS-1旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠；FD-1冷凍干燥機(jī)，北京博醫(yī)康技術(shù)公司。

1.2方法

1.2.1油茶籽餅粕多糖的提取工藝流程。油茶籽餅粕原料→酶解→提取→抽濾→醇沉→抽濾→干燥→粗多糖制品。精確稱取油茶籽餅粕原料1.0 g，加入10倍量磷酸鹽緩沖液(pH 7.5)、一定量的酶，在一定溫度下，酶解一定時(shí)間。移入95 ℃水浴鍋，滅酶。然后再加入10倍量去離子水，調(diào)整料液比至1∶20 g/mL， 90 ℃水浴提取30 min，離心，收集上層清液，加入5倍體積無(wú)水乙醇，攪拌，多糖沉淀析出，靜置過(guò)夜，收集沉淀，真空冷凍干燥得油茶籽餅粕粗多糖。

1.2.2油茶籽餅粕多糖得率的測(cè)定。具體公式如下：

式中，粗多糖質(zhì)量即多糖粗品質(zhì)量(g)；多糖含量即粗多糖中多糖所占百分比(%)；樣品質(zhì)量即油茶籽餅粕質(zhì)量(g)。

1.2.3酶的種類對(duì)油茶籽餅粕多糖得率的影響。分別加入中性蛋白酶、纖維素酶、半纖維素酶及果膠酶，固定酶解溫度50 ℃，酶解時(shí)間60 min，酶添加量1.0%，考察酶的種類對(duì)油茶籽餅粕多糖得率的影響。

1.2.4單因素試驗(yàn)。固定酶解時(shí)間60 min，酶添加量1.0%，考察酶解溫度(30、40、50、60、70 ℃)對(duì)多糖提取率的影響；固定酶解溫度50 ℃，酶添加量1.0%，考察酶解時(shí)間(30、60、90、120、150 min)對(duì)多糖提取率的影響；固定酶解溫度50 ℃，酶解時(shí)間90 min，考察酶添加量(0%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%)對(duì)多糖提取率的影響。

1.2.5響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)。根據(jù)酶解單因素試驗(yàn)結(jié)果，以酶解溫度、酶解時(shí)間、酶添加量作自變量，以多糖提取率為響應(yīng)值，采用軟件Design-Expert 8.05的Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)響應(yīng)面法優(yōu)化中性蛋白酶酶解提取工藝，試驗(yàn)因素水平見表1。

表1　Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平

2結(jié)果與分析

2.1酶的種類對(duì)油茶籽餅粕多糖得率的影響由圖1可知，以縱坐標(biāo)粗多糖得率為考察指標(biāo)，進(jìn)行酶的篩選。結(jié)果顯示，加入中性蛋白酶，粗多糖得率最高?？赡苁且?yàn)橹行缘鞍酌改苡行Ы到馀c多糖結(jié)合在一起的蛋白質(zhì)，從而釋放出更多的多糖，且經(jīng)粗多糖脫蛋白的過(guò)程，也能更多去除粗多糖中的蛋白質(zhì)，進(jìn)一步提高多糖的純度。

圖1　酶的種類對(duì)油茶籽餅粕多糖得率的影響Fig.1　Effects of enzyme type on the extraction rate of polysaccharides from camellia seed cake

2.2單因素試驗(yàn)結(jié)果分析

2.2.1酶解溫度對(duì)多糖提取率的影響。由圖2可知，酶解溫度對(duì)油茶籽餅粕粗多糖提取率影響顯著，酶解溫度對(duì)粗多糖得率的影響呈現(xiàn)先上升后下降的變化。當(dāng)酶解溫度為50 ℃時(shí)，酶解效果最好，粗多糖得率最高。當(dāng)溫度超過(guò)50 ℃，部分酶開始失活，粗多糖得率開始下降。由此可知，中性蛋白酶最適溫度為50 ℃，故選擇40、50、60 ℃作為響應(yīng)面試驗(yàn)中酶解溫度的3個(gè)考察水平。

圖2　酶解溫度對(duì)多糖得率的影響Fig.2　Effects of enzymolysis temperature on the extraction rate of polysaccharides

2.2.2酶解時(shí)間對(duì)多糖得率的影響。由圖3可知，酶解時(shí)間對(duì)油茶籽餅粕粗多糖得率影響較小，隨著酶解時(shí)間的增加，多糖溶液的吸光值一直處于上升趨勢(shì)，粗多糖得率逐漸增加。在酶解時(shí)間30～90 min，多糖得率的增加趨勢(shì)明顯，而在酶解時(shí)間90～150 min，多糖得率的增加趨勢(shì)趨于平緩。故從工藝和經(jīng)濟(jì)成本2個(gè)方面考慮，選取60、90、120 min作為響應(yīng)面試驗(yàn)中酶解時(shí)間的3個(gè)考察水平。

圖3　酶解時(shí)間對(duì)多糖得率的影響Fig. 3　Effects of enzymolysis time on the extraction rate of polysaccharides

2.2.3酶添加量對(duì)多糖得率的影響。由圖4可知，酶添加量對(duì)油茶籽餅粕粗多糖提取率影響較大，在酶添加量0%～1.5%，粗多糖得率逐漸增加，而在1.5%～2.0%增加幅度平緩。因此，從提取率和經(jīng)濟(jì)成本2個(gè)方面考慮，選取1.0%、1.5%、2.0%作為響應(yīng)面試驗(yàn)中酶添加量的3個(gè)考察水平。

圖4　酶添加量對(duì)多糖得率的影響Fig. 4　Effects of enzymolysis dosage on the extraction rate of polysaccharides

2.3響應(yīng)面試驗(yàn)方案及結(jié)果分析

2.3.1響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果。通過(guò)單因素試驗(yàn)，選擇合適的水平組合進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)，以確定最佳的粗多糖提取工藝。油茶籽餅粕多糖提取的Box-Behnken試驗(yàn)方案及結(jié)果見表2。

表2　Box-Behnken試驗(yàn)方案及結(jié)果

Design-Expert軟件對(duì)所得試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行擬合二次多項(xiàng)式模型的方差分析，獲得酶解溫度(A)、酶解時(shí)間(B)、酶添加量(C)的二次多項(xiàng)回歸方程為：Y=0.23-0.034A+0.013B+0.03C-0.011AB-0.024AC+0.008BC+0.027A2+0.003 375B2+0.007 625C2。由方差分析可知，模型P<0.000 1，模型顯著，失擬項(xiàng)P=0.193 1，失擬項(xiàng)不顯著。由F值可以看出，影響多糖得率的因素按主次順序排列依次為A(酶解溫度)、C(酶添加量)、B(酶解時(shí)間)。其中A(酶解溫度)和C(酶添加量)達(dá)到極顯著水平，A(酶解溫度)與C(酶添加量)、A(酶解溫度)與B(酶解時(shí)間)交互作用較明顯，達(dá)到顯著水平。綜上所述，該模型擬合程度較好，模型成立。

2.4驗(yàn)證試驗(yàn)通過(guò)求解回歸模型方程，得油茶籽餅粕多糖酶解的最佳工藝為酶解溫度42.285 7 ℃，酶解時(shí)間118.851 2 min，酶添加量2.074 7%?？紤]到實(shí)際操作的可行性，將各因素水平歸整并進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，酶解溫度40 ℃，酶解時(shí)間120 min，酶添加量2.0%，在此工藝條件下，油茶籽餅粕多糖得率為15.66%，是優(yōu)化前得率7.65%的2.05倍，顯著提高了多糖得率。因此，該優(yōu)化工藝合理，具有可操作性，適宜用于油茶籽餅粕粗多糖的提取。

3結(jié)論與討論

該試驗(yàn)通過(guò)酶法輔助熱水浸提油茶籽餅粕多糖，發(fā)現(xiàn)采用中性蛋白酶提取效果最佳，可能是因?yàn)槎嗵且着c餅粕中蛋白結(jié)合形成糖蛋白，中性蛋白酶能有效降解與多糖結(jié)合在一起的蛋白質(zhì)，從而釋放出更多的多糖，提高了多糖的得率，且更有助于粗多糖脫蛋白，進(jìn)一步提高了多糖的純度。針對(duì)此，通過(guò)驗(yàn)證試驗(yàn)表明，優(yōu)選的酶法與傳統(tǒng)熱水浸提相結(jié)合工藝合理、提取率高、安全可靠，重復(fù)性好，適宜用于油茶籽餅粕粗多糖的提取。

該試驗(yàn)在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，通過(guò)響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以多糖得率為考察指標(biāo)，對(duì)油茶籽餅粕多糖的提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化。影響多糖得率的因素按主次順序排列依次為A(酶解溫度)、C(酶添加量)、B(酶解時(shí)間)。確定油茶籽餅粕多糖提取最佳工藝為酶解溫度40 ℃，酶解時(shí)間120 min，酶添加量2.0%，此條件下多糖得率為15.66%，是優(yōu)化前得率的2.05倍，顯著提高了多糖得率。因此，該優(yōu)化工藝合理，具有可操作性。

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Optimization of Extraction of Polysaccharides from Camellia Seed Cake by Neutral Protease Using Response Surface Methodology

JIN Ri-sheng1,2, XU Bing-yan1, YUAN Chuan-xun1*

(1. Engineering Research Center of Bioprocess ministry of Education, Hefei University of Technology, Hefei, Anhui 230009; 2. Institute of Chemical Industry of Forest Products, Chinese Academy of Forestry Sciences, Nanjing, Jiangsu 210042)

Abstract[Objective] To improve the extraction rate of the polysaccharides from camellia seed cake. [Method] With camellia seed cake after oil manufacture as the research material, polysaccharides were extracted by pectinase hydrolysis combined with traditional hot water extraction. Effects of neutral protease, cellulase, hemicellulase and pectinas on the polysaccharide extraction rate were researched. Single factor test was carried out to research the effects of three factors (enzymolysis temperature, enzymolysis time and enzyme dosage) on the polysaccharides extraction rate. Response surface methodology was applied to optimize the optimal conditions. [Result] The optimal extraction technology was as follows:40 ℃ enzymolysis temperature, 120 min enzymolysis time and 2.0% enzyme dosage. Under these conditions, the average extraction rate of polysaccharides was 15.66%, which was 2.05 times before optimization (7.65%). [Conclusion] This method has high extraction rate of polysaccaride, and is a kind of effective method for polysaccharide extraction.

Key wordsCamellia seed cake; Polysaccharides; Enzyme method; Single factor test; Response surface methodology

作者簡(jiǎn)介金日生(1982- )，男，安徽桐城人，助理研究員，博士，從事天然活性物質(zhì)研究與開發(fā)工作。

收稿日期2016-03-28

中圖分類號(hào)S 789.7

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A

文章編號(hào)0517-6611(2016)11-107-03