王齊瑋，劉盛全，李曉平，吳 寧，候 慶（.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué) 林學(xué)與園林學(xué)院，安徽 合肥 30036；.云南省木材膠黏劑及膠合制品重點實驗室，云南 昆明 6504）

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果膠酶液體發(fā)酵條件優(yōu)化與酶學(xué)特性研究

王齊瑋1，2，劉盛全1，李曉平2，吳 寧2，候 慶2
（1.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué) 林學(xué)與園林學(xué)院，安徽 合肥 230036；2.云南省木材膠黏劑及膠合制品重點實驗室，云南 昆明 650224）

摘 要：本文通過液體搖瓶發(fā)酵，采用DNS法測定酶活性，研究不同條件對果膠酶活性的影響以及果膠酶的酶學(xué)特性。結(jié)果表明對于HS021號菌，適宜的發(fā)酵條件為初始發(fā)酵液pH 6.0，菌齡和發(fā)酵時間24 h，加入0.05% Na+，果膠酶活性可達17.67 U/mL，最適溫度為50℃，最適pH 5.0。對于HS047號菌，適宜的發(fā)酵條件為初始發(fā)酵液pH 6.0，菌齡和發(fā)酵時間24 h，果膠酶活性可達15.66 U/mL，最適溫度為45℃，最適pH 5.0。對于HS053號菌，適宜的發(fā)酵條件為初始發(fā)酵液pH 6.0，菌齡24 h，發(fā)酵時間48 h，加入0.05% 的Na+，果膠酶活性可達11.32 U/mL，最適溫度為55℃，最適pH5.0。對于HS053號菌木粉發(fā)酵液可以替代果膠底物發(fā)酵液。紫外誘導(dǎo)后，酶活均下降。

關(guān)鍵詞：果膠酶；芽孢桿菌；液體發(fā)酵；條件優(yōu)化；酶學(xué)特性

果膠是一種多糖類物質(zhì)，其化學(xué)結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜，在植物中含量較少但非常重要，起到對植物細胞的物質(zhì)支持作用，是植物細胞壁和胞間層的主要成分。果膠在植物細胞組織中與纖維素、半纖維素、木質(zhì)素和蛋白質(zhì)等相互交聯(lián)，使相鄰纖維細胞緊密的粘結(jié)在一起，表現(xiàn)出固有的形態(tài)［1-2］，因此利用果膠酶對原料進行預(yù)處理，降解胞間層中的一部分果膠質(zhì)，可以起到纖維分離的目的。纖維分離是纖維板制造、制漿造紙和紡織生產(chǎn)中的關(guān)鍵技術(shù)，傳統(tǒng)的纖維分離通常采用酸堿處理法、機械法、熱磨法和傳統(tǒng)微生物法等，這些分離方法不僅需要專門的設(shè)備、耗時耗能、還會形成二次污染，而利用果膠酶法分離纖維則是一種綠色、環(huán)保的生產(chǎn)工藝。利用果膠酶對原料進行預(yù)處理后再進行纖維分離可以大大降低纖維分離的能耗，同時降低纖維分離對環(huán)境造成的污染等［3-6］。

果膠酶是指可以分解果膠的一類酶的總稱，果膠酶廣泛存在于動物、植物和微生物中，但動、植物等天然來源的果膠酶產(chǎn)量低且提取十分困難，不能滿足生產(chǎn)和實驗的需要。許多霉菌及少量的細菌和酵母菌等都可產(chǎn)生果膠酶，主要以曲霉和桿菌為主［7-9］。果膠酶被研究應(yīng)用于纖維分離［4-6］、紡織［10-11］、造紙［12］（尤其是利用麻類纖維包括亞麻、黃麻、大麻等原料）等領(lǐng)域，僅在實驗室內(nèi)取得了成功，因為目前市售的食品級果膠酶主要來源于黑曲霉，其最適pH值一般在3.5～4.0范圍，而木質(zhì)材料自然酸堿性一般為5.5～5.8范圍，同時木質(zhì)材料復(fù)雜的化學(xué)成分，也導(dǎo)致果膠酶不能很好的發(fā)揮作用。課題組從工業(yè)大麻籽內(nèi)生菌中篩選到5株產(chǎn)果膠酶菌株，通過掃描電鏡觀察自制果膠酶溶液處理工業(yè)大麻桿效果，并與市購的4種果膠酶處理效果對比，結(jié)果表明自制果膠酶可以完全適應(yīng)生物質(zhì)材料的自身酸堿環(huán)境，工業(yè)大麻桿樣品纖維的剝離程度最高，能有效的用于生物質(zhì)材料中果膠質(zhì)的分解［13］。但果膠酶的酶活力低，生產(chǎn)成本高，限制了該酶的廣泛應(yīng)用，本文主要研究影響果膠酶發(fā)酵的所有因素，同時進行了酶學(xué)特性的研究，以制備出高活性的新型果膠酶。

1 實驗

1.1 菌種

實驗中采用了5株來自工業(yè)大麻籽的內(nèi)生菌，分別為 Bacillus s iamensis （HS017）、Brevibacillus agri （HS021）、Bacillus subtilis subsp （HS036）、Bacillus methylotrophicus （HS047）、Brevibacillus parabrevis （HS053）。

1.2 發(fā)酵液

實驗中共采用了5種發(fā)酵液，用于優(yōu)化果膠酶的發(fā)酵條件和確定發(fā)酵液對果膠酶活性的影響，發(fā)酵液的配方分別如下：1）液體發(fā)酵液：酵母粉4 g，果膠0.4 g，葡萄糖3.6 g，麥芽粉3 g，蒸餾水1 000 mL；2）麩皮發(fā)酵液：麩皮粉11 g，蒸餾水1 000 mL；3）柚子粉發(fā)酵液：柚子粉11 g，蒸餾水1 000 mL；4）工業(yè)大麻桿發(fā)酵液：工業(yè)大麻桿粉11 g，蒸餾水1 000 mL；5）木粉發(fā)酵液：木粉11 g，蒸餾水1 000 mL。將發(fā)酵液配制好后在121℃的滅菌鍋中滅菌15 min，待發(fā)酵液冷卻后接菌，并置于搖床中進行發(fā)酵。

1.3 方法

1.3.1 液態(tài)發(fā)酵

用無菌竹簽將一個火柴頭大小的菌體挑入裝有100 mL液體發(fā)酵液的250 mL搖瓶中，放入搖床振蕩一定時間，設(shè)定溫度37℃，轉(zhuǎn)數(shù)200 r/min。

1.3.2 酶活測定［14］

1）半乳糖醛酸標準曲線繪制

分別取濃度為1.000 0 g/L半乳糖醛酸標準溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6mL，用蒸餾水全部補至5 mL，加3 mL DNS試劑，沸水浴5 min，冷卻后，用蒸餾水定容至25.0 mL，以空白參比調(diào)零，用分光光度計在540 nm波長下測吸光值。將上述測得的數(shù)據(jù)，以吸光度為縱坐標，半乳糖醛酸含量為橫坐標，繪制半乳糖醛酸標準曲線，如圖1所示。其直線回歸方程為y=0.196 x－0.057 3，相關(guān)系數(shù)0.97，標準曲線斜率K=0.196。

圖1 半乳糖醛酸標準曲線

2）果膠酶活性測定

向甲乙試管中分別加入1%濃度果膠溶液5 mL，在50℃水浴鍋中水浴5 min。接著分別向甲乙兩管中加入相應(yīng)pH的檸檬酸―檸檬酸鈉緩沖液4 mL，向甲管加1 mL稀釋酶液，立即搖勻，在50℃水浴鍋中水浴30 min，同時立即給乙管加1 mL稀釋酶液，放入沸水浴中煮沸5 min，終止反應(yīng)，冷卻。最后分別取甲乙兩管中2 mL于兩支25 mL比色管中，分別給甲乙兩管加蒸餾水2 mL和3 mL DNS試劑，充分混合，于沸水浴煮沸5 min，取出，立即冷卻。最后加蒸餾水定容到25 mL。以標準空白為基準調(diào)零。在540 nm處測吸光值。

3）酶活力計算

式中，A甲為酶樣吸光度，A乙為酶空白吸光度，K為標準曲線斜率，5為測定酶活力時取了反應(yīng)液的1/5，t為反應(yīng)時間（h），A甲、A乙吸光度應(yīng)在建立標準曲線的吸光值內(nèi)。

酶活力定義：1.0 mL酶液在50℃、一定pH條件下，1 h分解果膠產(chǎn)生1.0 mg D-半乳糖醛酸為一個酶活力單位，即1U。

1.3.3 發(fā)酵條件優(yōu)化分別研究了發(fā)酵液pH值、菌齡、發(fā)酵時間、替代果膠底物、金屬離子和紫外誘導(dǎo)對果膠酶活性的影響。1）發(fā)酵液pH值對果膠酶活性的影響

將5株菌分別在發(fā)酵液pH值5.5、6.0、6.5、7.0下進行發(fā)酵，在pH5.5環(huán)境下測定發(fā)酵所得的果膠酶酶液活性，確定最佳發(fā)酵液pH值，同時篩選三株酶活比較高的菌株進行后期的試驗。

2）菌齡和發(fā)酵時間對果膠酶活性的影響

分別測得菌齡24、48、72 h，發(fā)酵時間24、48、72、96、120 h下發(fā)酵制備的果膠酶活性。獲得最佳菌齡和最佳發(fā)酵時間。

3）替代果膠底物發(fā)酵液對果膠酶活性的影響

在生產(chǎn)果膠酶時，果膠物質(zhì)既是碳源，又是酶的誘導(dǎo)物，對產(chǎn)酶影響較大。考慮到純果膠價格昂貴，本實驗分別利用麩皮、柚子粉、工業(yè)大麻桿、木粉四種發(fā)酵液，在最佳菌齡和最佳發(fā)酵時間下，發(fā)酵生產(chǎn)果膠酶，并測其果膠酶活性，試圖找到合適的替代發(fā)酵液。

4）金屬離子對果膠酶活性的影響

精確稱取一定量的含Mg2+、Na+、K+、Ca+氯化鹽及含Cu2+、Ge2+的硫酸鹽。按照0.01%、0.05%、0.1%加入發(fā)酵液中，進行果膠酶的發(fā)酵制備，然后在最佳菌齡和最佳發(fā)酵時間下測定各金屬離子處理液的酶活力。計算其相對酶活，以此來評價金屬離子對果膠酶活性的影響。

5）紫外誘導(dǎo)

微生物是發(fā)酵的原動力。在發(fā)酵工業(yè)中要取得生產(chǎn)的高效益，就要有優(yōu)良的生產(chǎn)菌株。紫外誘導(dǎo)是誘變育種最常用的一種方式，采用15 W紫外線殺菌燈，照射距20～30 cm。設(shè)定紫外誘導(dǎo)時間15、30、45、60 min，誘導(dǎo)后的菌體進行發(fā)酵制備果膠酶液，并測定其酶活性。

1.3.4 酶學(xué)特性研究

研究了果膠酶的最適溫度和最適pH值，具體實驗方案如下：

1）酶的最適溫度

在30 ℃、35℃、40 ℃、45℃、50 ℃、55℃、60 ℃，pH 5.5的條件下，反應(yīng)30 min，測定果膠酶酶活。將最大的酶活力記為100%，其他的酶活力以它的百分比來計。

2）酶的最適pH

在最適溫度條件下，設(shè)定pH 3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5和7.0分別反應(yīng)30 min，測定果膠酶酶活。將最大的酶活力記為100%，其他的酶活力以它的百分比來計。

2 結(jié)果與討論

2.1 果膠酶液體發(fā)酵條件的優(yōu)化

2.1.1 發(fā)酵液pH值對果膠酶活性的影響

圖2為發(fā)酵液pH對果膠酶活性的影響。由圖2可知，在發(fā)酵液pH為6.0時得到的果膠酶活性最高，固發(fā)酵液pH應(yīng)設(shè)定在6.0為最佳。HS017、HS036兩株菌的酶活相對較低，故后期試驗將不再進行研究。

圖2 發(fā)酵液pH對果膠酶活性的影響

圖3 菌齡24 h時不同發(fā)酵時間對酶活的影響

2.1.2 最佳菌齡和最佳發(fā)酵時間確定

圖3～5分別為菌齡24、48、72 h時不同發(fā)酵時間對酶活影響的折線圖。

圖4 菌齡48 h時不同發(fā)酵時間對酶活的影響

圖5 菌齡72 h時不同發(fā)酵時間對酶活的影響

由圖3～5分析可得，HS021、HS047號菌的最佳菌齡和最佳發(fā)酵時間都為24 h。HS053號菌的最佳菌齡為24 h，最佳發(fā)酵時間為48 h。

2.1.3 替代發(fā)酵液對果膠酶活性的影響

圖6～8分別是四種替代發(fā)酵液對HS021、HS047、HS053號菌酶活的影響。通過圖6～8柱狀圖的分析可知，麩皮和木粉替代發(fā)酵液對HS053號菌發(fā)酵液酶活有促進作用，相對酶活分別為106.9%和121.3%。木粉替代發(fā)酵液相對酶活較高可能是因為木粉中含有的金屬離子對粗酶液酶活起到了促進作用，其他替代發(fā)酵液均無促進作用。

圖6 四種替代發(fā)酵液對HS021號菌酶活的影響

圖7 四種替代發(fā)酵液對HS047號菌酶活的影響

圖8 四種替代發(fā)酵液對HS053號菌酶活的影響

2.1.4 金屬離子對粗酶液果膠酶活性的影響

由圖9～14可知，Mg2+、Na+促進了HS021粗酶液果膠酶活性。加入0.01%濃度的Mg2+酶液相對酶活力為106.3%，加入0.05%濃度的Mg2+酶液相對酶活力為132.2%，加入0.05%濃度的Na+酶液相對酶活力為192.0%。Na+對HS053號菌粗酶液果膠酶活性有促進作用，加入0.05%濃度的Na+酶液相對酶活力為123.0%。HS047號菌酶液沒有促進離子。說明粗酶液中添加不同的金屬離子對果膠酶活性有很大的影響。

圖9 不同濃度Mg2+對果膠酶活性的影響

圖10 不同濃度Na+對果膠酶活性的影響

圖11 不同濃度K+對果膠酶活性的影響

圖12 不同濃度Ca2+對果膠酶活性的影響

圖13 不同濃度Cu對果膠酶活性的影響

圖14 不同濃度Ge對果膠酶活性的影響

2.1.5 紫外誘導(dǎo)對果膠酶活性的影響

圖15說明紫外誘導(dǎo)后的菌體發(fā)酵制備的果膠酶酶活均出現(xiàn)了不同程度的降低甚至失活。HS021號菌誘導(dǎo)30 min活性降低，誘導(dǎo)超過30 min活性有一定升高。HS047、HS053號菌誘導(dǎo)30 min后均死亡。

圖15 紫外誘導(dǎo)對果膠酶活性的影響

圖16 不同反應(yīng)溫度下的相對酶活

2.1.6 酶的酶學(xué)特性

在pH 5.5的0.2 mol/L Na2HPO4-0.l mol/L 檸檬酸緩沖體系中，酶液在不同溫度下進行酶促反應(yīng)。如圖16所示。由圖16可知，HS021號菌果膠粗酶液最適反應(yīng)溫度范圍為45～55℃，最適溫度為50℃。HS047號菌果膠粗酶液最適反應(yīng)溫度范圍為40～50℃，最適溫度為45℃。HS053號菌果膠粗酶液最適反應(yīng)溫度范圍為50～60℃，最適溫度為55℃。

不同pH下的相對酶活如圖17所示。由圖17可知，pH對菌株產(chǎn)果膠酶酶活的影響很大，HS021號菌最適pH范圍4.5～5.5，在pH5.0時候酶活達到最高值。HS047號菌最適pH范圍4.0～5.0，在pH4.5時候酶活達到最高值。HS053號菌最適pH范圍4.5～5.5，在pH5.0時候酶活達到最高值。

圖17 不同pH下的相對酶活

3 結(jié)論

利用液體發(fā)酵果膠酶受到多種因素影響，經(jīng)過分析研究得出對于HS021號菌，適宜的發(fā)酵條件為初始發(fā)酵液pH值6.0，菌齡和發(fā)酵時間24 h，加入0.05%濃度的Na+，果膠酶活性可以達到17.67 U/mL，最適溫度為50℃，最適pH 5.0。對于HS047號菌，適宜的發(fā)酵條件為初始發(fā)酵液pH值6.0，菌齡和發(fā)酵時間24 h，果膠酶活性可以達到15.66 U/mL，最適溫度為45℃，最適pH 5.0。對于HS053號菌，適宜的發(fā)酵條件為初始發(fā)酵液pH值6.0，菌齡24 h，發(fā)酵時間48 h，加入0.05%濃度的Na+，果膠酶活性可以達到11.32 U/mL，最適溫度為55℃，最適pH 5.0。對于HS053號菌木粉發(fā)酵液可以替代果膠底物發(fā)酵液。紫外誘導(dǎo)后，酶活均下降。

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Study of Liquid Fermentation and Characteristics of Pectinase

WANG Qi-wei1,2, LIU Sheng-quan1, LI Xiao-ping2, WU Ning2, HOU Qing2

（1.Forestry and Landscape Architecture, Anhui Agricultural University, Hefei 230036, China; 2.Yunnan Key Laboratory of Wood Adhesives and Glue Products, Kunming 650224, China）

Abstract:Pectinase is widely used in industrial production, mainly by microbial fermentation.The pectinase was produced via flask culture and its activity was determined by DNS.The effect of different conditions of pectinase activity and enzymatic properties of pectinase was studied.The results showed that for HS021 bacteria, the optimum fermentation conditions were initial pH6.0, bacteria age and fermentation time 24 h, added 0.05% Na+, pectinase activity reached 17.67 U/mL, the optimum temperature 50℃, the optimum pH 5.0.For HS047 bacteria, the optimum fermentation conditions were initial pH6.0, bacteria age and fermentation time 24 h, pectinase activity reached 15.66 U/mL, the optimum temperature 45℃, the optimum pH 5.0.For HS053 bacteria, the optimum fermentation conditions were initial pH6.0, bacteria age 24 h, fermentation time 48 h, added 0.05% Na+, pectinase activity reached 11.32 U/mL, the optimal temperature 55℃, the optimum pH 5.0.For HS053 bacteria broth flour could replace pectin substrate fermentation broth.After UV induction, enzyme activity decreased.

Key words:pectinase, bacillus, liquid fermentation, condition optimization, enzymatic characteristics

中圖分類號：TQ920.1

文獻標識碼：A

文章編號：1004-8405（2016）01-0014-08

DOI:10.16561/j.cnki.xws.2016.01.08

收稿日期：2015-11-11

基金項目：國家林業(yè)局行業(yè)公益項目（201404515）；云南省中青年學(xué)術(shù)帶頭人后備人才項目（2015HB048）。

作者簡介：王齊瑋（1991～），博士研究生；研究方向：生物質(zhì)復(fù)合材料。

* 通訊作者：李曉平（1980～），博士，副教授；研究方向：生物質(zhì)復(fù)合材料。lxp810525@163.com