柳昭明，馮 紅

(天津體育學(xué)院 天津300381)

ATP合酶的研究進(jìn)展

柳昭明，馮 紅*

(天津體育學(xué)院 天津300381)

ATP合酶又稱F0F1-ATP酶，是一個多亞基復(fù)合體，廣泛存在于生物界，包括細(xì)菌的質(zhì)膜、線粒體內(nèi)膜和類囊體膜，可以催化能源物質(zhì)ATP的合成。這種酶在生物能學(xué)、生物化學(xué)、物理學(xué)和納米學(xué)領(lǐng)域受到重要關(guān)注。ATP合酶主要由兩部分組成：一是水溶性的蛋白復(fù)合體F1，另外一個是疏水部分F0，兩者都是轉(zhuǎn)動馬達(dá)。其中F1亞基由核基因編碼，F(xiàn)0亞基由線粒體ATP6和ATP8基因以及核基因共同編碼。該酶利用線粒體內(nèi)膜兩側(cè)質(zhì)子梯度差形成的勢能，通過結(jié)合改變機理旋轉(zhuǎn)合成ATP，也可逆水解ATP形成梯度差，達(dá)到了很高的能量轉(zhuǎn)化效率。研究其對于能量代謝具有重要價值，國內(nèi)外學(xué)者一直在對其進(jìn)行探索。綜合國內(nèi)外文獻(xiàn)對ATP合酶的功能、結(jié)構(gòu)、研究歷史和影響因素進(jìn)行了闡述。

ATP合酶 功能 結(jié)構(gòu) 歷史 影響因素

0 引 言

三磷酸腺苷(ATP)是細(xì)胞的能量貨幣。人體ATP含量通過水解與合成的動態(tài)平衡保持在50,g左右。人體1天基礎(chǔ)代謝條件下產(chǎn)生50～75,kg ATP，用于各種耗能反應(yīng)。在有氧情況下，ATP合成的主要途徑是氧化磷酸化，而氧化磷酸化的末端反應(yīng)是F0F1-ATP合酶催化的。

如圖1所示，電子通過輔酶Q、細(xì)胞色素bc1復(fù)合體和細(xì)胞色素c從NADH脫氫酶轉(zhuǎn)移到細(xì)胞色素c氧化酶。建立的質(zhì)子梯度穿過線粒體內(nèi)膜驅(qū)動ATP合酶里的質(zhì)子流并伴隨ATP合成。ATP合酶通過質(zhì)子跨膜的電化學(xué)勢催化二磷酸腺苷(ADP)和無機磷酸鹽(Pi)合成ATP，也就是說，它將電化學(xué)勢轉(zhuǎn)化為化學(xué)形態(tài)。相反，當(dāng)電化學(xué)勢不足的時候，它催化質(zhì)子泵形成電化學(xué)勢水解ATP產(chǎn)生ADP和Pi。

圖1 呼吸鏈和ATP合酶Fig.1 The respiratory chain and ATP synthase

1 歷 史

ATP合酶的分子學(xué)研究始于1960年，Efraim Racker和他的同事報道了牛心線粒體中可溶因子的離析。這種F1因子有ATP水解功能，還具有使失去ATP合成功能的膜碎片恢復(fù)ATP的合成能力。[1]Efraim等人還從葉綠體中離析出相似的因子，其顯示在線粒體和葉綠體ATP合酶的基本特征是一樣的。在此之后，在ATP合酶的研究上至少出現(xiàn)了兩場著名的革命。[2]

1961年，Peter Mitchell(1978年諾貝爾獎獲得者)提出了化學(xué)滲透假說，聲明以前尋找的一種能將氧化呼吸原料和ATP合成聯(lián)系起來的高能化學(xué)中間體的觀念是錯誤的。他提出質(zhì)子跨膜的電化學(xué)勢ΔμH+假說，于是，假定的ATP合酶被預(yù)測為一種具有質(zhì)子轉(zhuǎn)移功能的ATP合成酶或水解酶。這種假說不被當(dāng)時的生化學(xué)家所接受。[3]1966年，Andre Jagendorf的“酸-堿轉(zhuǎn)換”實驗改變了這種形勢。他在葉綠體膜兩側(cè)加酸堿梯度并觀察無光條件下的ATP合酶。化學(xué)滲透機制最終由Yasuo Kagawa通過囊泡重建方法確立：在人為施加電化學(xué)勢的驅(qū)動下，含有純凈ATP合酶的囊泡催化了ATP的合成。[4]

發(fā)現(xiàn)ATP合酶在F0內(nèi)質(zhì)子流與F1內(nèi)ATP合成/水解兩者間的能量交換中的作用則是另一次變革。1997年，Paul Boyer(1997年諾貝爾獎獲得者)提出構(gòu)象變化假說。氧化所釋放的能量可能通過ATP合酶的3種具有催化功能的β亞基的構(gòu)象變化合成ATP。3種β亞基根據(jù)與核苷酸的親和力不同，依次發(fā)揮作用。每個β亞基具有松弛狀態(tài)(1oose)、緊密結(jié)合狀態(tài)(tight)和無底物與之結(jié)合狀態(tài)(open)，且3個β亞基的構(gòu)象總是互不相同，每個β催化亞基經(jīng)過幾次伴隨構(gòu)象改變而發(fā)生結(jié)合變化，最后形成1個ATP分子。該過程反復(fù)進(jìn)行以不斷合成ATP。這種由于親和力的改變而不是ATP合成或水解的化學(xué)轉(zhuǎn)化，且伴隨著能量的輸入或輸出的構(gòu)象變化假說后來也被稱為“結(jié)合變構(gòu)機理”(binding change mechanism)。Boyer隨后假設(shè)造成這種順序改變的原因是γ亞基中心的物理旋轉(zhuǎn)。[5]

1996年，Junge等還提出了一個旋轉(zhuǎn)催化的模型。這個旋轉(zhuǎn)運動假設(shè)的實質(zhì)就是c亞基圓環(huán)的周圍是必不可少的羧基。部分c亞基的外部環(huán)形表面與a亞基相互作用，在羧基部位是負(fù)電荷。假設(shè)a亞基在線粒體內(nèi)膜外側(cè)表面有1個進(jìn)口，允許1個質(zhì)子中和羧基的1個負(fù)電荷。這樣使未電離的羧基利用熱震動尋求與磷脂雙分子層接觸的環(huán)境。羧基在圓周某一點的中和伴隨c亞基環(huán)周圍其他羧基的進(jìn)一步重新電離。在內(nèi)膜內(nèi)側(cè)a亞基出口點上進(jìn)行質(zhì)子的釋放，并在c亞基環(huán)與a分界處使負(fù)電荷再生。這些加速質(zhì)子或減速質(zhì)子會促成c亞基環(huán)產(chǎn)生旋轉(zhuǎn)移動，使另一個負(fù)電荷移向入口點與另一個質(zhì)子中和，其他質(zhì)子在出口點的釋放產(chǎn)生了進(jìn)一步的旋轉(zhuǎn)。這個旋轉(zhuǎn)的設(shè)想就是直接與γ亞基結(jié)合。每個ATP的合成都要求γ亞基旋轉(zhuǎn) 120 °，因此γ亞基完成1次旋轉(zhuǎn)將產(chǎn)生3個ATP分子。在質(zhì)子運動的假設(shè)中，c亞基環(huán)包含12個c亞基，這與質(zhì)子中和4個羧基的假設(shè)相符。另外，在F0部分中，如果ATP與H+的比值是4，那么它應(yīng)與12個c亞基相對應(yīng)；同樣，如果ATP與H+的比值是3，在F0部分中就要求有9個c亞基。[6]

雖然ATP合酶這種不尋常的協(xié)同動力學(xué)支持了構(gòu)象改變學(xué)說，但隨后很少有人去研究它。10年后，John Walker和他的同事展示了牛心的結(jié)構(gòu)。但是對于Boyer假說提供最有力支持的還是日本Noji的實驗。Noji等對于F1-ATP酶在催化ATP水解時的F1結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析，證明了Boyer的假設(shè)。[7]Noji等的實驗設(shè)計基于Walker對牛心線粒體Fl-ATP酶的晶體結(jié)構(gòu)分析，實驗結(jié)果直觀呈現(xiàn)了在水解ATP過程中γ亞基是在α3β3形成的圓筒式結(jié)構(gòu)中轉(zhuǎn)動的，這是對Boyer提出的轉(zhuǎn)動催化假說最有力的支持。[8]

2 結(jié) 構(gòu)

F0F1-ATP合酶分子量＞500,kDa，由兩個旋轉(zhuǎn)馬達(dá)組成，其中一個是F1(≈380,kDa)，是ATP合酶水溶性部分。當(dāng)被膜隔離的時候，它作為受ATP驅(qū)動的馬達(dá)，旋轉(zhuǎn)內(nèi)部亞基水解ATP，因此被稱為F1-ATP酶。ATP合酶的另一個旋轉(zhuǎn)馬達(dá)是F0(≈120,kDa)，它嵌入膜內(nèi)，受質(zhì)子電化學(xué)勢驅(qū)動，通過質(zhì)子轉(zhuǎn)移產(chǎn)生旋轉(zhuǎn)扭矩。[9]

細(xì)菌的F1由α3、β3、γ、δ和ε亞基組成。3種α亞基和3種β亞基交替排列，組成六聚環(huán)狀定子。轉(zhuǎn)軸是γ 亞基，它被容納在α3β3環(huán)的中央腔內(nèi)。ε 亞基與γ亞基突出的部分結(jié)合為F1與F0之間提供了連接。ε亞基是F1內(nèi)源性抑制器，它通過改變構(gòu)象從關(guān)閉狀態(tài)變?yōu)殚_放狀態(tài)造成了位阻現(xiàn)象從而封鎖了γ亞基。[10]這種抑制功能被認(rèn)為是生理上抑制ATP消耗的重要功能。

δ亞基作為F1和F0之間的連接者，負(fù)責(zé)連接定子部分。因此，F(xiàn)1最小的分子馬達(dá)復(fù)合體是α3β3γ子復(fù)合體。ATP水解或合成的催化中心就在α-β界面，它在β亞基的逆時針方向一側(cè)。沒有ATP催化功能的部分位于α-β界面另一側(cè)。起催化作用的部分主要由β亞基的氨基酸殘基形成，非催化部分主要在α亞基里。當(dāng)ATP水解的時候，從F0一面的方向看，F(xiàn)1的γ亞基逆時針方向旋轉(zhuǎn)。[11]

F0部分由a、b2、c10-15等3種亞基組成。不同物種之間的c亞基數(shù)量不同。例如，在牛心線粒體是8個，酵母菌、大腸桿菌和嗜熱桿菌PS3里是10個，產(chǎn)丙酸菌和梭狀芽胞桿菌里是11個，噬堿芽孢桿菌OF4里13個，菠菜葉綠體里14個，鈍頂螺旋藻里15個。[12]

ATP6和ATP8是編碼部分F0亞基的線粒體基因。所有生物都具有ATP6基因，但是細(xì)菌、植物的線粒體基因組不包含ATP8基因，這與一般后生動物有所不同。在人的線粒體基因中，ATP6與ATP8相鄰并重疊45,bp，ATP8基因長207,bp，編碼68個氨基酸，ATP6基因長681,bp，編碼226個氨基酸。[13]

c亞基圍成圈，形成一個環(huán)形復(fù)合體。普遍認(rèn)為這個環(huán)形復(fù)合體和α亞基形成一個質(zhì)子通道。當(dāng)下坡質(zhì)子流通過質(zhì)子通道時，C-環(huán)與F1的β亞基相反的方向旋轉(zhuǎn)。[14]因此，在F0F1復(fù)合體里，F(xiàn)0、F1推動彼此向相反的方向旋轉(zhuǎn)。當(dāng)質(zhì)子電化學(xué)勢大到超過ATP水解的自由能時，F(xiàn)0使γ亞基沿順時針方向旋轉(zhuǎn)，這時ATP合成是ATP合酶的主要生理功能。相反，當(dāng)電化學(xué)勢很小或降低時，F(xiàn)1迫使F0向相反的方向旋轉(zhuǎn)C-環(huán)泵質(zhì)子來對抗電化學(xué)勢。

為了檢測c亞基的表達(dá)在ATP合酶合成中的作用，Tatiana[15]等制作了在褐色脂肪組織的特異蛋白UCP1的啟動子下表達(dá)c亞基P1型的轉(zhuǎn)基因小鼠，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在該小鼠褐色脂肪的線粒體中，c亞基和F1亞基的其他部分蛋白質(zhì)水平均明顯提高。這表明在所有的高級真核生物中，c亞基的水平可能是F0F1-ATP合酶含量的決定因素。

F0和F1部分之間還有OSCP(寡霉素敏感相關(guān)蛋白)亞單位，與F6、b、d亞基構(gòu)成外側(cè)柄，外側(cè)柄與α3β3亞基復(fù)合體以及a亞基和δ亞基組成“定子”部分。c亞基、γ 和ε 亞基組成“轉(zhuǎn)子”部分。OSCP是是一種213個氨基的酸性蛋白，定位于F1頂部，與大腸桿菌的δ亞基相似，在哺乳動物中高度保守。OSCP的C端區(qū)域是松散的，包含一個β折疊，精確定位與α和β亞基的界面，還包括兩個α螺旋，即H7和H8。H8形成1個3螺旋與F6的α螺旋以及b亞基一部分結(jié)合在一起。[16]OSCP可估量ATP合酶結(jié)構(gòu)的完整性，當(dāng)F1和F0分離的時候會導(dǎo)致寡霉素敏感性的ATP酶活性降低。[17]缺失或重構(gòu)實驗證明OSCP對于偶聯(lián)質(zhì)子轉(zhuǎn)運和ATP合成是必不可少的。[18]酵母菌里的電子追蹤實驗表明了OSCP是F1F0-ATP合酶組裝的最后一步，而且是獨立的。降低人類細(xì)胞的OSCP水平并沒有改變其他F0和F1亞基和呼吸鏈酶復(fù)合體的表達(dá)。[19]

3 影響ATP合酶發(fā)揮功能的因素

3.1 通過F0的亞單位影響ATP合酶功能的因素

線粒體是細(xì)胞內(nèi)最易受乙醇作用而損傷的細(xì)胞器，其中線粒體DNA(mtDNA)又是細(xì)胞內(nèi)乙醇相關(guān)氧化應(yīng)激的主要目標(biāo)。mtDNA ATP合成酶6和8的基因表達(dá)產(chǎn)物ATP合成酶6和8蛋白是ATP合成酶F0部分的兩個組分，通過調(diào)控質(zhì)子轉(zhuǎn)運而調(diào)節(jié)ATP合成，決定著細(xì)胞內(nèi)ATP的含量。胃粘膜丙二醛(MDA)作為氧自由基與細(xì)胞作用的產(chǎn)物，反映了氧自由基對細(xì)胞的損傷程度。何紹珍[20]等通過實驗測得不同濃度乙醇灌胃后，胃粘膜MDA含量均較正常對照組明顯升高。表明乙醇在胃內(nèi)代謝可產(chǎn)生大量氧自由基，且氧自由基生成量與乙醇濃度呈正相關(guān)。乙醇灌胃2,h后，胃粘膜ATP合成酶6和8,mRNA表達(dá)隨乙醇濃度升高而下降，且氧自由基含量越高，兩種基因mRNA的表達(dá)水平越低。JA Sánchez-Alcázar等[21]發(fā)現(xiàn)，氧自由基使mtDNA ATP合成酶6和8轉(zhuǎn)錄水平下降，ATP合成酶6翻譯產(chǎn)物ATP合成酶亞單位α減少。因此，乙醇通過代謝產(chǎn)生自由基使ATP合成酶6轉(zhuǎn)錄水平降低，進(jìn)而使其翻譯產(chǎn)物ATP合成酶α亞單位減少，影響了ATP的代謝。李生廣等[22]研究乙醇作用于ATP合酶復(fù)合體時，乙醇對復(fù)合體表現(xiàn)為非競爭性抑制行為。這表明乙醇并未直接與反應(yīng)底物競爭結(jié)合位點，但其很有可能作用于酶上的乙醇敏感部位，導(dǎo)致復(fù)合體中F1構(gòu)象的某些改變，從而使F1上催化位點與調(diào)節(jié)位點解聚，影響了活性部位，造成ATP的水解受到抑制。

亞基6和亞基9是F0部分的亞單位。酵母菌亞基6是線粒體編碼的含蛋白脂質(zhì)，有5個疏水性跨膜螺旋。其中疏水螺旋4和5在不同物種間保守并與質(zhì)子轉(zhuǎn)移相關(guān)。亞基9是與DCCD捆綁的含蛋白脂質(zhì)，當(dāng)亞基6的疏水螺旋4和5以及亞基9的疏水螺旋1和2發(fā)生突變時表現(xiàn)出寡霉素抵抗，表明寡霉素結(jié)合位點同時包含亞基6和亞基9，抑制了質(zhì)子轉(zhuǎn)運。[23]在只有F1的情況下，ATP水解也會發(fā)生，但是ATP水解不再與質(zhì)子轉(zhuǎn)移偶聯(lián)，寡霉素敏感性也會消失。這證明寡霉素抑制了F0中的質(zhì)子轉(zhuǎn)運，進(jìn)而影響了ATP水解的最大速度。[24]

N,N-二環(huán)己基碳二亞胺(N,N-dicyclohecarbodiimide，DCCD)是F0F1-ATP合酶的一種經(jīng)典抑制劑，與F0的c亞基的高度保守羰基共價結(jié)合。DCCD通過形成一種穩(wěn)定的N-?；蛩嘏cc亞基上的、H+結(jié)合的羧基殘基反應(yīng)，阻斷了F0與F1的偶聯(lián)反應(yīng)。據(jù)報道，1個F0結(jié)合1個單DCCD分子就足夠抑制ATP酶活性。經(jīng)DCCD修飾的c環(huán)晶體結(jié)構(gòu)顯示環(huán)己基部分太大，不能通過c環(huán)的質(zhì)子結(jié)合口袋而暴露在疏水環(huán)境中，暗示N?；蛩嘏ca亞基的空間位阻關(guān)閉了c環(huán)的旋轉(zhuǎn)。[25]

3.2 通過F1的亞單位影響ATP合酶功能的因素

腺苷二磷酸(MgADP)不僅是ATP合成的底物，還通過非競爭性的方式抑制ATP酶活性。這種抑制被稱作“ADP抑制”。它的調(diào)節(jié)位點在F1的催化中心。芽孢桿菌PS3的α3β3γ復(fù)合體的單分子實驗顯示“ADP抑制”導(dǎo)致了由ATP驅(qū)動旋轉(zhuǎn)的γ亞基發(fā)生了長時間的停頓。[26]

IF1是ATP合酶的天然抑制蛋白，它是一種含84個殘基的堿性非競爭性抑制蛋白。當(dāng)線粒體電化學(xué)梯度低而沒有質(zhì)子動勢發(fā)生ATP水解時，IF1與F1的β亞單位1∶1可逆結(jié)合抑制ATP酶的活性。[27]IF1的中心區(qū)域(殘基42～58)與F1的α和β亞基結(jié)合，C端區(qū)域與F0的OSCP亞基結(jié)合，這種結(jié)合使得IF1綁定在ATP合酶上。這一反應(yīng)由酸堿度決定，在酸性環(huán)境下IF1以二聚體形式存在，有效抑制F1的ATP酶活性。在堿性環(huán)境下，IF1形成沒有抑制作用的四聚體。這種酸堿度依賴為在解偶聯(lián)或者低氧狀態(tài)下保護(hù)線粒體ATP提供了一種反饋機制。當(dāng)糖酵解成為細(xì)胞ATP的唯一來源時，細(xì)胞基質(zhì)酸堿度降低，促進(jìn)了IF1對ATP水解的抑制。[28]

3.3 通過連接柄影響ATP合酶功能的因素

ε 亞基是ATP合酶天然內(nèi)源性抑制劑。在細(xì)菌和葉綠體中，ε 亞基一方面偶聯(lián)F0的質(zhì)子傳遞和F1的ATP合成與水解，另一方面還抑制ATP合酶的活性。這兩種功能是分開的，ε 亞基的N端行使偶聯(lián)功能，C端的α螺旋區(qū)域行使抑制ATP水解功能。ε 亞基在不同物種間的抑制作用是不一樣的。[28]

BZ-423是一種1,4-苯二氮，它通過選擇性殺死致病性淋巴細(xì)胞來抑制小鼠狼瘡，毒性比現(xiàn)在的狼瘡藥物小。為了證實OSCP是調(diào)節(jié)BZ-423誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的細(xì)胞內(nèi)靶點，Kathryn M.Johnson等[24]通過RNA干擾實驗降低OSCP水平并監(jiān)測細(xì)胞對BZ-423的敏感性證實了BZ-423與OSCP的結(jié)合。將細(xì)胞暴露于BZ-423，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的線粒體中迅速產(chǎn)生了雙原子氣態(tài)氧，這種活性氧可以作為引發(fā)細(xì)胞程序性死亡的信號，從而引起細(xì)胞程序性死亡。同時發(fā)現(xiàn)BZ-423和線粒體ATP合酶中的OSCP相結(jié)合，從而抑制線粒體ATP合酶，即OSCP作為BZ-423結(jié)合的分子靶點，引起線粒體ATP合酶及細(xì)胞的一系列變化，進(jìn)而達(dá)到治療狼瘡疾病的作用。BZ-423既抑制ATP合酶的合成活動，也抑制其水解活動。

4 結(jié) 語

如何提高能量轉(zhuǎn)化率，改善機能運動水平一直是科學(xué)家們的研究目標(biāo)。本文通過綜合國內(nèi)外研究進(jìn)展，系統(tǒng)闡述了ATP合酶的結(jié)構(gòu)與作用機制，對在分子水平上研究ATP合酶影響能量代謝具有意義。

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The Advancement of ATP Synthase

LIU Zhaoming，F(xiàn)ENG Hong*
(Tianjin University of Sport，Tianjin 300381，China)

ATP synthase is also called F0F1-ATPase.It is a complex with several subunits and is found widely existing in the biological world，including the plasma membrane of bacteria，inner membrane of mitochondria and thylakoid membrane of chloroplasts，catalyzing the synthetic of ATP.This enzyme has attracted significant attention in a wide variety of fields from bioenergetics and biophysics to chemistry，physics and nanoscience.ATP synthase is composed of two parts：a watersoluble protein complex of F1and a hydrophobic part F0.Both are rotary motors.The F1subunit is encoded by the nuclear gene，and the F0subunit is encoded by the mitochondrial ATP6 and ATP8 genes as well as the nuclear genes.Many factors affect the function of these two parts.The enzyme uses the potential energy which is formed by the proton gradient difference between the two sides of the inner membrane of the mitochondria，and by combining the change mechanism of the rotation of the synthesis of ATP，the reversible hydrolysis of ATP gradient difference，to achieve a high energy conversion efficiency，so it is of great value to the study of energy metabolism and domestic and foreign scholars have been exploring it.This paper reviews the structure，function，research history and factors that affect its function through analyzing both domestic and foreign literatures.

ATP synthase；function；structure；history；influence factor

Q55

：A

：1006-8945(2016)05-0034-06

*

國家自然科學(xué)基金面上項目Prohibitin 1 在運動能量代謝中的作用及調(diào)控F0F1-ATP合酶機制(31470061)。

2016-04-01