黎春彤，何世榮，劉皈陽(yáng)*，李　翔，馮春景

高效液相色譜法測(cè)定腎復(fù)康膠囊中丹酚酸B的含量

黎春彤1，何世榮2，劉皈陽(yáng)1*，李翔1，馮春景1

[摘要]目的采用高效液相色譜法測(cè)定腎復(fù)康膠囊中丹酚酸B的含量。方法采用Agilent Zorbax SB C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)色譜柱，乙腈-0.2% 磷酸溶液(24∶76)為流動(dòng)相，流速為1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為286 nm，柱溫為25 ℃，進(jìn)樣量10 μL，運(yùn)行時(shí)間為20 min。結(jié)果丹酚酸B在5.00～100 μg/mL范圍線性關(guān)系良好，r=0.999 6(n=6)，平均回收率為100.3%，RSD=0.85%。結(jié)論本方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確，靈敏度高，重現(xiàn)性良好，可用于腎復(fù)康膠囊中丹酚酸B的質(zhì)量控制。

[關(guān)鍵詞]腎復(fù)康膠囊；高效液相色譜法；丹酚酸B

0引言

腎復(fù)康膠囊為沈陽(yáng)軍區(qū)聯(lián)勤部門診部軍隊(duì)非標(biāo)準(zhǔn)制劑，由當(dāng)歸、黃芪、全蝎、丹參、大黃、山藥、山茱萸、何首烏、杜仲、豬苓、肉蓯蓉、川牛膝、芡實(shí)、川芎共14味藥材組成，具有滋補(bǔ)脾腎、行氣活血、溫陽(yáng)利水等功效，主要用于腎炎、蛋白尿、腎病綜合征、尿毒癥等癥，其中丹參具有活血化瘀、保肝消痛等功效，藥理研究表明，其主要活性成分丹酚酸B有明確的抗氧化作用，對(duì)心血管系統(tǒng)、肝臟、腎臟和肺均具有保護(hù)作用[1-4]。目前其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中僅對(duì)其中阿魏酸進(jìn)行含量測(cè)定。為了更好地控制產(chǎn)品質(zhì)量，完善和提高質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，本研究對(duì)該制劑中丹參藥材所含丹酚酸B的含量進(jìn)行測(cè)定，為有效控制該制劑的質(zhì)量提供了簡(jiǎn)便、快捷、結(jié)果準(zhǔn)確、重復(fù)性好、實(shí)用性強(qiáng)的方法。

1儀器與試藥

Agilent 1200高效液相色譜儀，Agilent 1200系列四元泵，VWD檢測(cè)器，PuXiang MODEL 320柱溫箱，Agilent 1200 色譜工作站；梅特勒-托利多AE200電子天平；KQ3200DB型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。丹酚酸B對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：111562-201313，純度：97%)。乙腈為色譜純，磷酸為分析純，水為娃哈哈純凈水。腎復(fù)康膠囊及陰性對(duì)照均為中國(guó)人民解放軍沈陽(yáng)軍區(qū)聯(lián)勤部門診部制備(規(guī)格：0.33 g/粒，100粒/瓶，批號(hào)：20140103、20140601、20150101)。

2方法與結(jié)果

2.1色譜條件色譜柱：Agilent Zorbax SB C18(4.6 mm×150 mm，5 μm)；流動(dòng)相：乙腈-0.2%磷酸溶液(24∶76)；柱溫：25 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：286 nm；進(jìn)樣量：10 μL，運(yùn)行時(shí)間：20 min。

2.2溶液制備

2.2.1對(duì)照品溶液制備精密稱定在60 ℃減壓干燥4 h的丹酚酸B對(duì)照品10.0 mg，置100 mL容量瓶中，加75%甲醇至刻度，搖勻，制成每1 mL含100 μg丹酚酸B的對(duì)照品儲(chǔ)備液。

2.2.2供試品溶液制備精密稱量同一批號(hào)腎復(fù)康膠囊1.0 g，置25 mL容量瓶中，加75%甲醇至刻度，稱定重量，超聲處理25 min，放冷，再稱定重量，用75%甲醇補(bǔ)足減失的重量，用0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.2.3陰性對(duì)照溶液制備按照腎復(fù)康膠囊的處方比例和制法，制備缺丹參的陰性對(duì)照樣品，按照“2.2.2”項(xiàng)下方法制備成陰性對(duì)照溶液。

2.3系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)分別取上述對(duì)照品溶液、供試品溶液及陰性樣品溶液，在上述色譜條件下，各進(jìn)樣10 μL，測(cè)得HPLC圖譜(圖1)，理論塔板數(shù)按丹酚酸B計(jì)算不低于2 500。

圖1　對(duì)照品(A)、供試品(B)、陰性對(duì)照(C)的HPLC圖

2.4線性關(guān)系的考察精密吸取丹酚酸B對(duì)照品溶液0.5、1.0、2.0、5.0、7.5、10.0 mL，分別置于10 mL量瓶中，加75%甲醇稀釋至刻度，搖勻。上述溶液依次進(jìn)樣，進(jìn)樣量10 μL，記錄峰面積。以峰面積(Y)為縱坐標(biāo)、丹酚酸B濃度(X)為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，丹酚酸B在5.00～100 μg/mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好，回歸方程：Y=13.725 X-11.361，r=0.999 6(n=6)。

2.5精密度試驗(yàn)精密吸取上述對(duì)照品溶液10 μL，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄丹酚酸B峰面積，其RSD為1.13%，表明儀器精密度良好。

2.6重復(fù)性試驗(yàn)精密稱取同一批次供試品(批號(hào)：20140103)6份，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣10 μL，記錄峰面積，測(cè)得丹酚酸B的平均含量為0.946 mg/g，RSD為1.08%。

2.7穩(wěn)定性試驗(yàn)精密吸取上述同一供試品溶液(批號(hào)：20140103)，分別在0、2、4、8、10、12 h，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣10 μL，記錄峰面積，其RSD為0.78%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8加樣回收率試驗(yàn)分別精密稱取0.25 g含0.946 mg/g丹酚酸B的腎復(fù)康膠囊內(nèi)容物6份，分別加入對(duì)照品儲(chǔ)備液5 mL，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制得供試品溶液，測(cè)定丹酚酸B的含量，計(jì)算得丹酚酸B平均加樣回收率為100.3%，RSD為0.85%。結(jié)果見表1。

2.9樣品測(cè)定分別取3批供試品各3份，按“2.2.3”項(xiàng)下方法，制備供試品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)方法進(jìn)樣10 μL，記錄峰面積并計(jì)算3批丹酚酸B的含量，結(jié)果見表2。

表1　加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

表2　樣品測(cè)定結(jié)果

3討論

3.1提取溶劑的選擇由于丹酚酸B的穩(wěn)定性差，經(jīng)過反復(fù)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，供試品溶液提取效率穩(wěn)定性差。為解決此問題，本試驗(yàn)對(duì)供試品的提取條件進(jìn)行了多因素考察[5-7]。首先分別對(duì)比甲醇、乙醇和乙腈3種溶劑對(duì)丹酚酸B的提取效果和效率，發(fā)現(xiàn)甲醇和乙醇的提取效率優(yōu)于乙腈，而乙醇提取液中提取出的物質(zhì)種類更多，對(duì)丹酚酸B的干擾更多，因此最終選擇了甲醇作為提取溶劑。

進(jìn)一步對(duì)甲醇的比例進(jìn)行考察，分別采用50%、75%、95%、100%的甲醇提取供試品，結(jié)果顯示，75%的甲醇提取效果、效率明顯高于其他3個(gè)比例，50%甲醇提取的雜質(zhì)成分最多，95%甲醇提取效率最低。因此最終選擇了75%的甲醇作為提取溶劑。

由于丹酚酸B的穩(wěn)定性差，不宜采用加熱的方式提取，因此選擇超聲提取的方法，而超聲時(shí)間對(duì)供試品溫度影響較大，因此本試驗(yàn)考察了5、15、25、35 min 4個(gè)時(shí)間長(zhǎng)度，最終發(fā)現(xiàn)提取5、15 min不能使丹酚酸B完全提取，而提取35 min由于水溫升高，丹酚酸B提取率反而降低，因此最終確定25 min為最優(yōu)提取時(shí)間。

3.2色譜柱的選擇丹酚酸B在非酸性的流動(dòng)相中易解離，峰拖尾且測(cè)定含量偏低不準(zhǔn)確，因此在藥典和多篇文獻(xiàn)中均采用不同的酸性流動(dòng)相，如：甲醇-乙腈-甲酸-水、甲醇-甲酸-水、乙腈-0.1%甲酸、乙腈-0.2%磷酸等[7-9]。本試驗(yàn)中采用了乙腈-0.2%磷酸的流動(dòng)相，并在此條件下，篩選了Eclipse XDB-C18、Zorbax XDB-C18、Zorbax SB-C183種不同填料的色譜柱，結(jié)果發(fā)現(xiàn)三者差別不大，考慮到酸性的流動(dòng)相，最終選用耐酸性的Zorbax SB-C18色譜柱。

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Determination of salvianolic acid B in shenfukang capsule by HPLC

LI Chun-tong1,HE Shi-rong2,LIU Gui-yang1*,LI Xiang1,FENG Chun-jing1

(1.Department of Pharmacy,First Affiliated Hospital of PLA General Hospital,Beijing 100048,China;2.Clinic of Joint-Logistics Department of Shenyang Command,Shenyang 110005,China)

[Abstract]ObjectiveTo determine the content of salvianolic acid B in shenfukang capsule by HPLC.MethodsAn Agilent Zorbax Eclipse SB C18(4.6 mm×250 mm,5 μm) column was used.The mobile phase consisted of acetonitrile and 0.2% phosphoric acid (24∶76).The flow rate was 1.0 mL/min.The detection wavelength was 286 nm.The column temperature was 25 ℃.The injection volume was 10 μL.The running time was 20 min.ResultsThere was good linear relationship between the area and the content of salvianolic acid B within the range of 5.00～100 μg/mL (r=0.999 3),and the average recovery rate was 99.98% with RSD=1.32%.ConclusionThe method is simple and accurate,and it can be used for the quality control of salvianolic acid B in shenfukang capsule.

Key words：Shenfukang capsule;HPLC;Salvianolic acid B