王　瑩　彭　偉

(湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬太和醫(yī)院門診服務(wù)中心，湖北　十堰　442000)

針刺對頸椎間盤退變大鼠頸椎軟骨終板結(jié)構(gòu)及交界面血管芽的影響

王瑩彭偉△

(湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬太和醫(yī)院門診服務(wù)中心，湖北十堰442000)

【摘要】目的觀察針刺對頸椎間盤退變大鼠頸椎軟骨終板結(jié)構(gòu)及交界面血管芽的影響。方法將60只SD雄性大鼠隨機(jī)分為3組，空白組、模型組及針刺組，每組各20只。除空白組外，模型組及針刺組均建立頸椎間盤退變模型。針刺組采用電針治療，其余2組不做處理。治療3個(gè)療程后，處死全部大鼠，對大鼠進(jìn)行組織學(xué)觀察，并觀察軟骨終板鈣化層、非鈣化層厚度，以及交界面血管芽數(shù)量。結(jié)果模型組軟骨終板交界面血管芽數(shù)量較空白組減少(P<0.01)，說明造模成功；針刺組軟骨終板交界面血管芽數(shù)量較模型組增加(P<0.05)。模型組大鼠軟骨終板鈣化層厚度高于空白組(P<0.05)，非鈣化層厚度低于空白組(P<0.05)，說明造模成功。針刺組大鼠軟骨終板鈣化層厚度低于模型組(P<0.05)，非鈣化層厚度高于模型組(P<0.01)。結(jié)論針刺可延緩頸椎間盤退變大鼠頸椎軟骨終板鈣化，減輕軟骨終板鈣化程度，增加血管芽數(shù)量，提高髓核營養(yǎng)供應(yīng)，起到緩解疼痛、延緩椎間盤退變的作用。

【關(guān)鍵詞】頸椎；病理學(xué)；椎間盤；動物，實(shí)驗(yàn)；針刺；軟骨細(xì)胞

隨著現(xiàn)代社會生活節(jié)奏的加快，電腦、空調(diào)和汽車的廣泛使用，低頭工作方式人群增多，人們受風(fēng)寒濕邪侵襲、屈頸及頸部外傷的可能性均大幅度增加，造成頸椎病的患病率不斷上升，且發(fā)病年齡不斷提前[1]。一旦患有頸椎病，往往纏綿難愈，癥狀呈多元化，影響頸部神經(jīng)根、血管、脊髓，出現(xiàn)頭暈、頭痛、頸肩背痠痛、上肢放射痛、下肢無力等癥狀，特別是脊髓型頸椎病患者，輕則四肢痿廢，重則發(fā)生癱瘓，不僅長期折磨患者本人，也給整個(gè)家庭、社會帶來沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。頸椎病將成為與現(xiàn)代社會相伴隨的一種常見病、多發(fā)病，在整個(gè)脊柱病的發(fā)病譜中，頸椎病已上升為主要位置。本實(shí)驗(yàn)主要研究針刺對頸椎間盤退變大鼠頸椎軟骨終板結(jié)構(gòu)及交界面血管芽的影響，以期為針刺治療頸椎病提供一定的依據(jù)。

1動物與方法

1.1動物 選擇3個(gè)月齡清潔級SD雄性大鼠60 只，體質(zhì)量(300±20) g，由湖北醫(yī)藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供，動物質(zhì)量合格證號：滬動合證字152號。動物實(shí)驗(yàn)環(huán)境等級：清潔級，環(huán)境設(shè)施合格證號：醫(yī)動字第02-24號。正常飼養(yǎng)，溫度為(23±2) ℃,濕度為(50±5) %，自由攝食飲水，每日光照12 h。

1.2方法

1.2.1選擇分組將60只SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)2周后，隨機(jī)分為3組，空白組、模型組及針刺組，每組各20只，編號后分籠飼養(yǎng)。

1.2.2造模方法[1-2]除空白組外，模型組及針刺組大鼠均按0.1 g/ kg 體質(zhì)量進(jìn)行鹽酸氯氨酮注射液麻醉，麻醉成功后，將大鼠俯臥位于手術(shù)臺上，頸椎后方備皮，碘伏消毒，鋪巾。取頸后部正中縱向切口(從寰枕關(guān)節(jié)至第1胸椎棘突處)，長約2.5～3 cm，切開皮膚后，逐層分離筋膜、肌肉，逐層分離筋膜、頸闊肌、頸斜方肌及頸菱形肌，鈍性剝離兩側(cè)肌肉直至暴露深層肌群，橫向切斷頸夾肌，頭、頸、寰最長肌，頸髂肋肌和頭半棘肌，充分暴露頸椎，并切除1.2～1.5 cm 長一段，充分暴露頸椎后依次切除第2～7頸椎 (C2～7)棘上和棘間韌帶，徹底止血后縫合兩側(cè)骶棘肌和皮膚。造模成功后，單籠標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，室溫23～25 ℃。

1.2.3治療方法針刺組采用電針治療。選穴：天柱(雙側(cè))、大椎、大杼(雙側(cè))穴。操作：局部常規(guī)消毒，采用華佗牌32號0.5寸13 mm不銹鋼毫針(蘇州醫(yī)療用品廠有限公司)針刺1 cm，然后接青島鑫升G6805-Ⅱ型電針儀(青島鑫升實(shí)業(yè)有限公司)，疏密波，電流強(qiáng)度2 mA，每次電針時(shí)間25 min，每日1次，1周為1個(gè)療程，連續(xù)治療3個(gè)療程?？瞻捉M、模型組均不做任何處理。

1.3標(biāo)本采集及方法①治療3個(gè)療程后，處死全部大鼠，在4倍手術(shù)顯微鏡下沿上、下軟骨終板與椎體的交界面切下C4～5椎間盤，用10%中性甲醛室溫下固定24 h，10%EDT脫鈣2周，脫鈣處理后行蘇木精-伊紅(HE)染色，在光鏡×10倍下觀察頸椎間盤組織學(xué)變化。②采用Disector自動計(jì)數(shù)法和體視學(xué)分析法[3]，連續(xù)8 μm切片，各組20個(gè)標(biāo)本，采用Mias系列病理圖像分析系統(tǒng)[3]對采集圖像進(jìn)行分析，每張切片選擇在100倍顯微鏡下觀察軟骨終板交界面血管芽數(shù)量。③測定每組20個(gè)椎間盤正中矢狀面，關(guān)節(jié)軟骨與髓核中心交界處軟骨終板鈣化層、非鈣化層厚度，以潮標(biāo)為分界線，由于潮標(biāo)呈波浪形，取每個(gè)視野鈣化層與非鈣化層的最大值與最小值的平均值作為各層厚度。

2結(jié)果

2.1各組大鼠頸椎間盤組織學(xué)觀察空白組：頸椎間盤基本顯示正常結(jié)構(gòu)，外周由規(guī)則排列的纖維環(huán)和中央大的髓核組成；軟骨板分為生長軟骨層和關(guān)節(jié)軟骨層；關(guān)節(jié)軟骨層由一薄層透明軟骨組成，與繼發(fā)性骨化中心相連接的透明軟骨鈣化，潮標(biāo)清晰可見鈣化的關(guān)節(jié)軟骨極薄，鈣化軟骨與骨髓腔直接接觸或與一薄層骨板相鄰，鈣化的軟骨下分布有大量粗大血管(見圖1)。模型組：頸椎間盤已開始退行性變化，纖維環(huán)板層結(jié)構(gòu)紊亂，排列輕度不規(guī)則，部分髓核組織皺縮；關(guān)節(jié)軟骨鈣化層及非鈣化層均增厚，潮標(biāo)前移，關(guān)節(jié)軟骨鈣化厚度相當(dāng)，軟骨下骨板增厚，血管明顯減少(見圖2)。針刺組：頸椎間盤有退變，但較模型組形態(tài)稍微規(guī)則，纖維排列稍微整齊，髓核組織皺縮輕(見圖3)。

圖1空白組圖2模型組圖3針刺組

各組大鼠頸椎間盤組織學(xué)觀察(HE，×10)

2.2各組大鼠軟骨終板交界面血管芽數(shù)量比較見表1。

表1　各組大鼠軟骨終板交界面血管芽數(shù)量比較　個(gè)，±s

與空白組比較，*P<0.01；與模型組比較，△P<0.05

由表1可見，模型組軟骨終板交界面血管芽數(shù)量較空白組減少(P<0.01)，說明造模成功；針刺組軟骨終板交界面血管芽數(shù)量較模型組增加(P<0.05)。

2.3各組大鼠軟骨終板鈣化層、非鈣化層厚度比較見表2。

表2　各組大鼠軟骨終板鈣化層、非鈣化層厚度比較　±s

與空白組比較，*P<0.05；與模型組比較，△P<0.05，△△P<0.01

由表2可見，模型組大鼠軟骨終板鈣化層厚度高于空白組(P<0.05)，非鈣化層厚度低于空白組(P<0.05)，說明造模成功。針刺組大鼠軟骨終板鈣化層厚度低于模型組(P<0.05)，非鈣化層厚度高于模型組(P<0.01)。

3討論

椎間盤包括纖維環(huán)、髓核和軟骨終板，它是一個(gè)完整的充有液體的彈性系統(tǒng)，有液壓減震功能，幼年時(shí)含水量達(dá)80%以上，隨年齡或退變增加，椎間盤漸萎縮而水分遞減至60%～70%。頸椎間盤退變被認(rèn)為是頸椎病發(fā)生和發(fā)展的根本原因，早期頸椎間盤退變可能是頸椎間盤突出的先決條件。日常生活中，頸椎間盤始終處于不同的肌肉收縮力和韌帶張力作用下，各種應(yīng)力可影響頸椎間盤的代謝。頸椎間盤的營養(yǎng)是通過椎體—軟骨終板—椎間盤界面的通透作用，該通透作用的大小取決于軟骨終板與椎體交界面血管的多少。椎體內(nèi)血管的營養(yǎng)物質(zhì)經(jīng)軟骨終板進(jìn)入椎間盤，營養(yǎng)髓核和內(nèi)層纖維環(huán)。髓核的營養(yǎng)供應(yīng)依靠終板中區(qū)域血管的彌散作用，而且通過終板到髓核的營養(yǎng)通路取決于與軟骨血管芽的直接接觸聯(lián)系。Roberts S等[3]對人類不同年齡椎體軟骨終板下血管分布的研究顯示，終板的中心區(qū)域血管粗而致密，分布較多，而周邊部位則細(xì)而稀疏，分布較少。

呂剛等[4]通過灌注椎體終板血管鑄型標(biāo)本發(fā)現(xiàn)，終板血管在髓核區(qū)域分布密集，在內(nèi)層纖維環(huán)區(qū)域分布稀疏，這一結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了上述研究結(jié)論。Nerlich AG等[5]認(rèn)為，軟骨終板鈣化、增厚將導(dǎo)致椎間盤有氧血液的供應(yīng)減少，同時(shí)妨礙廢物的排出，使乳酸濃度升高，pH降低，加速細(xì)胞凋亡或死亡，并形成惡性循環(huán)，導(dǎo)致椎間盤不斷退變。Silberberg R[6]報(bào)道動物椎間盤突出可見到椎體干骺端軟骨下骨質(zhì)不規(guī)則，椎體骨小梁明顯缺乏。Tolonen J等[7]認(rèn)為，椎間盤退變的重要標(biāo)志是軟骨終板退變后導(dǎo)致血管侵入椎間盤。本研究進(jìn)一步證實(shí)了上述結(jié)論，并發(fā)現(xiàn)中心與周邊部位的血管分布差異在大鼠出生早期不甚明顯，但隨著大鼠生長發(fā)育，這種差別加劇，至發(fā)育成熟后則不再發(fā)生改變。血管芽的存在對軟骨終板的滲透性十分重要，而血管芽形態(tài)學(xué)差異與不同部位軟骨終板的滲透性高低密切相關(guān)。髓核營養(yǎng)主要來自終板中心區(qū)域的血管，除此之外，中央髓核很少再有其他的營養(yǎng)來源，若該營養(yǎng)通路發(fā)生障礙，將直接影響髓核的細(xì)胞代謝。

在機(jī)體生長發(fā)育和老化過程中,椎間盤中央部位細(xì)胞和基質(zhì)最關(guān)鍵的變化是營養(yǎng)供應(yīng)減少。椎間盤細(xì)胞的營養(yǎng)物質(zhì)依賴?yán)w維環(huán)外周和椎體內(nèi)血管通過基質(zhì)彌散供應(yīng)。在生長過程中，椎間盤體積增大、機(jī)體老化過程中供應(yīng)椎間盤周圍的動脈數(shù)量減少、軟骨終板逐漸鈣化，這些改變妨礙了營養(yǎng)物質(zhì)的供應(yīng)和廢物的排出[8]。生長發(fā)育階段的椎間盤和椎體軟骨生長需要大量營養(yǎng)供應(yīng)，此時(shí)終板下的豐富血管分布是保證其快速生長發(fā)育的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。生長停止后，椎間盤和軟骨終板代謝相對穩(wěn)定，終板下血管數(shù)目相應(yīng)減少并趨于穩(wěn)定。在不斷退變過程中，終板下血管數(shù)目逐漸減少，血管結(jié)構(gòu)功能的降低，隨著椎體骨內(nèi)壓的明顯升高，導(dǎo)致血管芽及血竇內(nèi)血流動力學(xué)可能發(fā)生異常改變，出現(xiàn)靜脈回流障礙、血液黏稠度增加等血液淤阻表現(xiàn)，并進(jìn)而造成血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷和血管栓塞。退變出現(xiàn)的終板下血管分布明顯減少，既與其生長發(fā)育的逐漸停止有關(guān)，又與椎體骨內(nèi)血液循環(huán)障礙形成的血液淤阻有關(guān)。這種變化的結(jié)果將是終板下血管分布進(jìn)行性減少和椎間盤營養(yǎng)障礙，所以椎間盤軟骨終板血管芽數(shù)量減少，引起血液灌流量減少，便形成“淤”的表現(xiàn)。

在上述變化中，軟骨終板鈣化的影響尤為重要，因?yàn)樽甸g盤營養(yǎng)通過軟骨終板中央部位的彌散是其主要供應(yīng)途徑。Roberts S等[9]通過研究狨猴和人不同年齡的椎體軟骨終板后發(fā)現(xiàn)，從成年后隨年齡增加，椎體關(guān)節(jié)軟骨層逐漸鈣化。Oda J等[10]認(rèn)為，營養(yǎng)物質(zhì)與代謝廢物通過終板轉(zhuǎn)運(yùn)的最重要因素是鈣化軟骨的厚度和完整性，以及軟骨下血管數(shù)量、大小和與終板直接毗鄰的骨髓腔多少。彭寶淦等[11]研究了從新生至老年的人類頸椎間盤后發(fā)現(xiàn)，髓核與終板交界處的細(xì)胞活力最強(qiáng)，進(jìn)而推測髓核細(xì)胞起源于終板軟骨細(xì)胞表層。只要軟骨終板保持良好狀態(tài)，髓核就可再生，終板的退變最終導(dǎo)致髓核的退變，而終板退變的標(biāo)志是軟骨內(nèi)鈣化。我們通過比較椎間盤退變程度與鈣化關(guān)節(jié)軟骨厚度發(fā)現(xiàn)，兩者呈高度一致性，即關(guān)節(jié)軟骨鈣化層越厚，椎間盤退變越嚴(yán)重。關(guān)節(jié)軟骨的不斷鈣化和骨化導(dǎo)致椎間盤營養(yǎng)發(fā)生障礙可能是啟動椎間盤退變的關(guān)鍵因素。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為頸椎病的成因，主要是由于風(fēng)寒濕邪客于膀胱經(jīng)，使寒邪凝于太陽膀胱之血脈，使經(jīng)脈拘攣，血液凝滯不暢，久而成瘀。頸部的外傷必然導(dǎo)致局部經(jīng)脈氣血的瘀滯不通；慢性勞損由于長久的積累性損傷，會導(dǎo)致氣血失和，經(jīng)脈不通。日久血瘀痰聚，累及肝、腎經(jīng)督脈，則病根深入，纏綿難愈。頸椎病從經(jīng)脈辨證來看，為膀胱經(jīng)所主病，因此在選穴上根據(jù)“循經(jīng)取穴”及“經(jīng)脈所過，主治所及”的原則，應(yīng)取膀胱經(jīng)穴或相近的穴位為主。天柱為足太陽膀胱經(jīng)脈氣之所發(fā)，功能清頭散風(fēng)，通經(jīng)活絡(luò)，為治頸項(xiàng)病要穴。大椎為手足三陽經(jīng)與督脈之會，總領(lǐng)諸陽經(jīng)，針刺之可振奮督脈陽氣，緩解痙攣。大杼位于項(xiàng)部，為骨會，手足太陽經(jīng)交會穴。諸穴活血化瘀，疏經(jīng)通絡(luò)止痛。電針能加強(qiáng)針刺得氣感，促進(jìn)局部血液循環(huán)，調(diào)整肌張力，改善組織營養(yǎng)[12]。

通過本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，針刺可延緩頸椎間盤的退變，防止髓核組織的皺縮。針刺組大鼠軟骨終板鈣化層厚度低于模型組(P<0.05)，非鈣化層厚度高于模型組(P<0.05，P<0.01)，說明針刺可延緩軟骨終板鈣化，增加非鈣化層厚度。針刺組軟骨終板交界面血管芽數(shù)量較模型組增加(P<0.05)，說明針刺可以增加退變椎間盤血管芽數(shù)量。從而進(jìn)一步證實(shí)了針刺可延緩軟骨終板鈣化，減輕軟骨終板鈣化程度，增加血管芽數(shù)量，提高髓核營養(yǎng)供應(yīng)，起到緩解疼痛、延緩頸椎間盤退變的作用。

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(本文編輯：習(xí)沙)

Effects of acupuncture on the cartilage end-plate structure and interface blood buds in rats with cervical intervertebral disc degeneratio

WANGYing,PENGWei.

CenterofClinicalService,TaiheHospitalAffiliatedtoHubeiUniversityofMedicine,Hubei,Shiyan442000

【Abstract】ObjectiveTo observe the effects of acupuncture on the cartilage end-plate structure and interface blood buds in rats with cervical intervertebral disc degeneration. Methods 60 Male SD rats were randomly divided into blank, model and acupuncture group, 20 rats in each group. The model of cervical intervertebral disc degeneration was established in model and acupuncture group. The rats in acupuncture group received electrical acupuncture, and the rest two groups did not be disposed. After three courses, all rats were sacrificed. The histological examination was performed, including the calcified and un-calcified layer in cartilage end-plate and the number of vascular bud was observed. Results The number of vascular bud of cartilage end-plate in model group was decreased as compared with that in blank group (P<0.01), proved successful model. The number of vascular bud in acupuncture group was higher than that in model group (P<0.05). The thickness of calcified layer in model group was higher than that in blank group (P<0.05), and the thickness of un-calcified layer was lower (P<0.05), proved successful model. The thickness of calcified layer acupuncture group was lower than that in model group (P<0.05), and the thickness of un-calcified layer was higher than that in blank group (P<0.05). Conclusion Acupuncture can prevent the calcification of cartilage end-plate in rats with cervical intervertebral disc degeneration, reduce degree of calcification, and increase blood bud, enhance nutrient supplement of nucleus pulposus, has the effects of relieve pain and slow the degenerative process of cervical intervertebral disc.

【Key words】Cervical vertebra; Pathology; Intervertebral disc; Animals; Experiment; Acupuncture; Chondrocyte

doi:10.3969/j.issn.1002-2619.2016.05.025

通訊作者：△湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬太和醫(yī)院保衛(wèi)處，湖北十堰442000

作者簡介：王瑩(1978—)，女，主管護(hù)師，學(xué)士。從事針灸康復(fù)疾病的研究工作。

【中圖分類號】R744.202.5；R-332；R329.24；R35

【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A

【文章編號】1002-2619(2016)05-0729-04

(收稿日期：2014-12-25)