黃天臣　肖建安　王青兵　王雁軍 　張勇 　白東曉　邱新光

1)河南安陽市腫瘤醫(yī)院外四科　安陽　455000　2)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院普通外科　鄭州　450052

Ki-67的表達(dá)與胃癌患者臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系

黃天臣1)肖建安1)王青兵1)王雁軍1)張勇1)白東曉1)邱新光2)*

1)河南安陽市腫瘤醫(yī)院外四科安陽4550002)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院普通外科鄭州450052

【摘要】目的探討Ki-67在胃癌組織中的表達(dá)及其臨床意義。方法采用免疫組化技術(shù)，檢測(cè)326例胃腺癌組織及相應(yīng)326例正常胃黏膜組織中Ki-67蛋白的表達(dá)情況。采用半定量RT-PCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)，隨機(jī)選取10例胃腺癌組織和相對(duì)應(yīng)的正常胃黏膜組織中Ki-67mRNA的表達(dá)情況，應(yīng)用χ2檢驗(yàn)、Kaplan-Meier生存分析及COX 回歸分析與患者臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系。結(jié)果胃癌組織中Ki-67蛋白和mRNA明顯高于正常胃黏膜組織(P<0.05 )。Kaplan-Meier生存分析顯示Ki-67蛋白表達(dá)與胃癌患者的預(yù)后密切相關(guān) (χ2=8.086, P=0.005)，COX 回歸分析顯示Ki-67為胃癌患者預(yù)后的獨(dú)立因素 (P=0.002 )。結(jié)論Ki-67的表達(dá)與胃癌預(yù)后密切相關(guān)，為胃癌患者預(yù)后的獨(dú)立因素。

【關(guān)鍵詞】胃癌；Ki-67；臨床病理特征；預(yù)后

胃癌為消化道腫瘤中發(fā)病率最高的惡性腫瘤。我國(guó)是胃癌發(fā)病率和病死率最高的國(guó)家之一。因此，對(duì)于胃癌相關(guān)基因及分子標(biāo)記物的研究對(duì)胃癌的早期診斷、治療、預(yù)后評(píng)定具有重要的臨床意義。Ki-67 是較為肯定的與細(xì)胞周期相關(guān)的核增殖標(biāo)志物，僅僅存在于增殖細(xì)胞的細(xì)胞核內(nèi)[1]，其表達(dá)隨細(xì)胞周期的進(jìn)展而增加[2]，為反應(yīng)細(xì)胞增殖活性的重要指標(biāo)，廣泛用于腫瘤細(xì)胞的增殖評(píng)估。研究表明[3-4]，Ki-67在肺癌、肝癌、乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌等多種腫瘤中均有過表達(dá)，并且與腫瘤的發(fā)生發(fā)展、浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移及預(yù)后相關(guān)。研究 ki-67 在胃癌組織中的表達(dá)，對(duì)評(píng)估胃癌細(xì)胞的增殖活性及判定預(yù)后具有重要意義。

1資料與方法

1.1組織標(biāo)本來源收集2005-03—2010-03間于安陽市腫瘤醫(yī)院接受胃癌根治術(shù)的326例胃癌患者的手術(shù)標(biāo)本。均排除遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，均未接受放化療、免疫治療，術(shù)后均經(jīng)過病理確診。標(biāo)本應(yīng)用多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，連續(xù)切片，分別用于HE染色及免疫組織化學(xué)染色。新鮮實(shí)驗(yàn)標(biāo)本保存于液氮中，用于半定量RT-PCR實(shí)驗(yàn)。正常胃黏膜組織取自手術(shù)標(biāo)本中距癌組織邊緣5 cm以上的手術(shù)切緣，均經(jīng)病理學(xué)證實(shí)為正常的胃黏膜組織。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1免疫組化(1)方法：免疫組織化學(xué)方法采用鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結(jié)法技術(shù)(streptavidin-perosidase, SP技術(shù))，染色步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。(2)結(jié)果判定：采用雙評(píng)分半定量積分法對(duì)Ki-67的免疫組化結(jié)果分析。以出現(xiàn)棕黃色或棕色顆粒的細(xì)胞作為陽性細(xì)胞，Ki-67抗原陽性表達(dá)為細(xì)胞核呈棕褐色顆粒，在高倍鏡下(400倍高倍鏡下視野)，隨機(jī)選取5個(gè)視野(每個(gè)視野計(jì)數(shù)的細(xì)胞數(shù)不少于200個(gè))。評(píng)分：陽性細(xì)胞<5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分。陽性強(qiáng)度評(píng)分：細(xì)胞無染色為0分，淺黃色為1分，黃色為2分，棕褐色為3分。將陽性細(xì)胞百分比和陽性強(qiáng)度兩項(xiàng)相乘，0分為(-)，1～4分為(+)，5～8分為(++)，≥9分為(+++)，將(++)和(+++)樣本認(rèn)為陽性表達(dá)，(-)和 (+)樣本認(rèn)為陰性表達(dá)。

1.2.2半定量RT-PCR用Primer 6.0軟件輔助設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增引物(由上海生工生物技術(shù)有限公司合成)，序列如下：人Ki-67引物：上游引物為：5'- GTGAGGGAATACCTTTGA-3'，下游引物為：5'-CCTGATGGTTGAGGCTGT-3'，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度191 bp。內(nèi)參人GAPDH引物：上游引物為：5'-AATCCCATCACCATCTTCC-3'，下游引物為：5' -CCTGCTTCACCACCTTCTT-3'，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度580bp。使用Trizol法提取組織細(xì)胞中總RNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)量總RNA的濃度和純度，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總RNA完整性。逆轉(zhuǎn)錄合成c DNA，取2μl逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃ 5min(預(yù)變性)一個(gè)循環(huán)；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，共35個(gè)循環(huán)。72 ℃ 10 min，4 ℃ 2 min。擴(kuò)增結(jié)束后，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)，最后在紫外燈下觀察結(jié)果和拍照。

2結(jié)果

2.1Ki-67蛋白在胃癌組織與正常胃黏膜組織中的表達(dá)應(yīng)用SP檢測(cè)326例胃癌及相應(yīng)的正常胃黏膜組織中Ki-67蛋白的表達(dá)。結(jié)果顯示，Ki-67蛋白主要表達(dá)于癌細(xì)胞胞核，呈棕黃色顆粒。在326例胃癌組織中，有204例Ki-67 表達(dá)陽性，陽性表達(dá)率為62.57%。顯著高于正常胃黏膜組織(11.96%)，胃癌組與正常胃黏膜組Ki-67 的陽性表達(dá)率比較有顯著性差異 (χ2=178.602,P=0.000)，見表1。

表1　胃癌與正常胃黏膜組織中ki67蛋白表達(dá)比較

2.2RT-PCR檢測(cè)胃癌和正常胃黏膜組織中Ki-67 mRNA的表達(dá)為了進(jìn)一步證實(shí)免疫組化的結(jié)果，我們采用半定量RT-PCR分析隨機(jī)選取的10例胃癌組織和相對(duì)應(yīng)的正常胃組織Ki-67 mRNA表達(dá)。結(jié)果表明，隨機(jī)選取的10例胃癌組織中Ki-67 mRNA的表達(dá)顯著高于相對(duì)應(yīng)的正常胃黏膜組織，比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表 2

表2　胃癌和正常胃黏膜組織中Ki-67 mRNA的表達(dá)

*：與胃癌組織相比，P<0.05

2.3Ki-67與胃癌臨床病理學(xué)的關(guān)系應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件分別從性別、年齡、TNM分期、組織分化程度和有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等方面分析Ki-67蛋白表達(dá)與胃癌臨床病理學(xué)之間的關(guān)系，進(jìn)一步研究Ki-67蛋白在胃癌發(fā)生發(fā)展過程中的可能作用。結(jié)果顯示，Ki-67蛋白的表達(dá)與胃癌患者的性別、年齡、TNM分期無關(guān)(P>0.05)，但與胃癌患者的組組織分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均密切相關(guān)(P<0.05)，見表3。

2.4Ki-67蛋白表達(dá)與胃癌病人預(yù)后之間的關(guān)系

2.4.1預(yù)后單因素分析應(yīng)用Kaplan-Meier生存曲線分析Ki-67蛋白表達(dá)與胃癌患者存活時(shí)間之間的關(guān)系。入組的326例胃癌患者均具有完整的隨訪資料，術(shù)后第1年每3個(gè)月隨訪1次，以后每6個(gè)月隨訪1次。隨訪形式以門診復(fù)查為主，其次為電話方式。隨訪時(shí)間3～87個(gè)月，中位隨訪時(shí)間為36.5個(gè)月。將326例胃癌患者的腫瘤分化、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及Ki-67蛋白表達(dá)情況進(jìn)行單因素分析，結(jié)果顯示，Ki-67蛋白表達(dá)與胃癌患者的預(yù)后密切相關(guān)(χ2=8.086,P=0.005 )(圖 1)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤分化程度對(duì)胃癌患者的預(yù)后具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.05)。

表3　Ki-67蛋白表達(dá)與胃癌臨床病理學(xué)參數(shù)之間的關(guān)系

圖1　Ki-67與胃癌患者生存關(guān)系

2.4.2預(yù)后多因素分析為進(jìn)一步明確Ki-67蛋白表達(dá)的獨(dú)立性預(yù)后價(jià)值，應(yīng)用COX模型對(duì)單因素分析中有顯著意義的4個(gè)變量進(jìn)行多因素分析，COX 回歸分析顯示Ki-67、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM 分期為胃癌患者預(yù)后的獨(dú)立因素 (P<0.05)，而腫瘤分化程度雖然在單因素分析中與胃癌患者預(yù)后相關(guān)，但經(jīng)COX回歸分析，無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，并非影響胃癌患者預(yù)后的獨(dú)立因素，見表4。

表4　胃癌患者術(shù)后生存多因素 COX 回歸分析

3討論

Ki-67是較為肯定的與細(xì)胞周期相關(guān)的核增值標(biāo)志物，僅僅存在于增值細(xì)胞的細(xì)胞核內(nèi)[1]，所編碼的基因位于第10號(hào)染色體上，其表達(dá)隨細(xì)胞周期的進(jìn)展而增加，細(xì)胞分裂周期中，G0期不表達(dá)，G1后期開始表達(dá)，S和G2逐漸升高，M期達(dá)到高峰，細(xì)胞分裂結(jié)束后迅速降解消失[2]，為反應(yīng)細(xì)胞增值活性的重要指標(biāo)，廣泛用于腫瘤細(xì)胞的增殖評(píng)估。研究表明[3-4]，Ki-67在肺癌、肝癌、乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌等多種腫瘤中均有過表達(dá)，并且與腫瘤的發(fā)生發(fā)展、浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移及預(yù)后相關(guān)。

關(guān)于胃癌與Ki-67關(guān)系的研究已較多，但目前尚存在爭(zhēng)議。研究表明，Ki-67在胃癌組織中的表達(dá)與腫瘤的臨床病理及患者的預(yù)后密切相關(guān)[5]。Tsamandas等[6]研究認(rèn)為，Ki-67與胃癌患者預(yù)后相關(guān)。Kikuyama等[7]認(rèn)為Ki-67為評(píng)估胃癌患者預(yù)后的獨(dú)立的因子。而Oshima等[8]研究表明Ki-67與患者性別、年齡、腫瘤的臨床分期及患者預(yù)后均無明顯相關(guān)。Victorzon等[9]則認(rèn)為Ki-67對(duì)于胃癌患者的預(yù)后判定無預(yù)測(cè)價(jià)值。本研究結(jié)果顯示： Ki-67蛋白主要表達(dá)于癌細(xì)胞胞核，呈棕黃色顆粒，胃癌組織中Ki-67陽性表達(dá)率為62.57%，顯著高于正常胃黏膜組織(11.96%)，具有顯著性差異。應(yīng)用半定量RT-PCR實(shí)驗(yàn)隨機(jī)檢測(cè)10例胃腺癌組織和對(duì)應(yīng)的正常胃黏膜組織中Ki-67的表達(dá)情況，進(jìn)一步證實(shí)Ki-67在胃癌組織中表達(dá)明顯高于在正常胃黏膜組織中的表達(dá)。

應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件分別從性別、年齡、TNM 分期、組織分化程度和有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等方面分析Ki-67蛋白表達(dá)與胃癌臨床病理特征的關(guān)系，進(jìn)一步研究Ki-67蛋白在胃癌發(fā)生發(fā)展過程中的可能作用。結(jié)果顯示，Ki-67蛋白的表達(dá)與胃癌患者的性別、年齡、TNM分期無關(guān)，但與胃癌患者的組組織分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均密切相關(guān)。

進(jìn)一步分析Ki-67蛋白表達(dá)與胃癌患者預(yù)后的關(guān)系。應(yīng)用Kaplan-Meier生存曲線分析Ki-67蛋白表達(dá)與胃癌患者存活時(shí)間之間的關(guān)系。將326例胃癌患者的病理學(xué)資料：腫瘤分化、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及Ki-67蛋白表達(dá)情況進(jìn)行單因素分析，結(jié)果顯示，Ki-67蛋白表達(dá)與胃癌患者的預(yù)后密切相關(guān)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤分化程度對(duì)胃癌患者的預(yù)后具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。為進(jìn)一步明確Ki-67蛋白表達(dá)的獨(dú)立性預(yù)后價(jià)值，應(yīng)用COX模型對(duì)單因素分析中有顯著意義的4個(gè)變量進(jìn)行多因素分析，COX 回歸分析顯示Ki-67、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM 分期為胃癌患者預(yù)后的獨(dú)立因素。

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(收稿2015-12-24)

Association of Ki-67expression with clinicopathologic features and prognosis in gastric cancer

HuangTianchen,XiaoJianan,WangQingbing,WangYanjun,ZhangYong,BaiDongxiao，QiuXinguang.

Thefourthdepartmentofgeneralsurgery,AnyangtumorHospital,Anyang455000 2.DepartmentofGeneralSurgery,theFirstAffiliatedHospitalofZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052，China

【Abstract】ObjectiveTo investigate the Ki-67 expression and its clinical significance in gastric cancer. MethodsThe expressions of Ki-67protein in 326 adenocarcinoma of gastric structures and in the corresponding 326 normal gastric mucosa structures will be tested by applying Immunohistochemical Technique.The expressions of Ki-67mRNA in 10 random chosen cases of adenocarcinoma of gastric structures and its corresponding normal gastric mucosa structures will be tested by semi-quantitative RT-PCR. The associationof Ki-67 expression with clinicopathologic features and prognosis in gastric cancer patients were analyzed with various statistical methods，such as χ2 -test，Kaplan-Meier method and COX proportional hazard model.ResultsKi-67 protein and Ki-67 mRNA in the gastric cancer structure clearly is more than that in normal gastric mucosa structure(P<0.05 ). The gastric cancer patient’s survival rate with high expression of Ki-67 is dramatically lower than that with low expression of Ki-67. The expression of Ki-67 is closely related to stomach cancer patient’s prognosis(χ2=8.086, P=0.005). The result of COX proportional hazard model shows that Ki-67 is the independent prognostic factor of stomach cancer patient(P=0.002).ConclusionThe expression of Ki-67 is closely related to the prognosis; Ki-67 is the independent prognostic factor of gastric cancer.

【Key words】Gastric cancer;Ki-67; Clinicopathologic features;Prognosis

*通訊作者：邱新光，Email：15836387568@163.com

【中圖分類號(hào)】R392.31

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】B

【文章編號(hào)】1077-8991(2016)03-0008-04