余祖華，丁　軻，，侯　奎，李元曉，李　旺

(河南科技大學a.動物疫病與公共衛(wèi)生重點實驗室；b.宏翔生物飼料實驗室，河南 洛陽 471003)

?

產纖維素酶地衣芽孢桿菌B.LY02搖瓶發(fā)酵條件優(yōu)化

余祖華a，丁軻a，b，侯奎b，李元曉b，李旺b

(河南科技大學a.動物疫病與公共衛(wèi)生重點實驗室；b.宏翔生物飼料實驗室，河南 洛陽 471003)

摘要：為了提高產纖維素酶地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis LY02，B.LY02)的產酶能力，采用單因素試驗對該菌株產酶的搖瓶發(fā)酵條件進行了優(yōu)化。優(yōu)化結果顯示：菌株B.LY02發(fā)酵培養(yǎng)基的最適碳源為麥芽糖，氮源為酵母膏，初始pH值為5.0，培養(yǎng)溫度為37 ℃，培養(yǎng)時間為30 h，裝液量為60 mL(250 mL三角瓶)，接種量(體積分數)為2%，搖床轉速180～200 r/min 。通過優(yōu)化發(fā)酵條件，菌株B.LY02的產酶活性達到了0.683 5 U/mL，比優(yōu)化前提高了約27.73%。

關鍵詞：纖維素酶；地衣芽孢桿菌；發(fā)酵條件；酶活

0引言

纖維素是地球上最豐富的可再生資源之一[1]，但由于其較難降解，所以尚未得到充分利用。學者們一直在探尋降解纖維素的有效方法，比如酸、堿和蒸汽加熱等，但這些方法存在降解產物回收率低和二次污染等問題，限制了其應用[2]。目前，利用產纖維素酶的微生物來降解秸稈成為一種更接近自然的纖維素降解方法[3]。地衣芽孢桿菌是目前應用較多的益生菌之一，它自身能合成蛋白酶、纖維素酶、淀粉酶和脂肪酶等消化性酶類[4-7]。因此，利用產纖維素酶的地衣芽孢桿菌對秸稈進行生物降解是處理和利用秸稈最具前景的方法。但自然存在的纖維素酶產率往往較低[8]，對纖維素的降解能力有限。近年來的研究發(fā)現：從自然界中篩選產纖維素酶的菌株后，對其發(fā)酵條件進行優(yōu)化以及對菌株進行誘變或改造，可提高菌株產纖維素酶的能力。文獻[9]利用紫外線對出發(fā)菌株進行誘變后，獲得的綠色木霉菌(Trichodermavride)菌株K6產纖維素酶的酶活性是出發(fā)菌株的1.39倍。文獻[10]從書虱伴生菌中篩選得到5株產纖維素酶的菌株，分別使用單因素分析法和響應面分析法，對纖維素酶活性最高的S2菌株的產酶發(fā)酵條件進行了優(yōu)化，在優(yōu)化后的發(fā)酵條件下，S2菌株的纖維素酶活力比優(yōu)化前提高了45%。

文獻[11]從土壤中分離得到了一株產纖維素酶的地衣芽孢桿菌(BacilluslicheniformisLY02，B.LY02)，但其在新鮮培養(yǎng)液中的產酶活性最高僅為0.535 1 U/mL。為了提高B.LY02的產酶活性，本文對菌株B.LY02進行了發(fā)酵條件的優(yōu)化，以摸索最佳產酶發(fā)酵條件，為其進一步的工業(yè)化應用奠定基礎。

1材料與方法

1.1材料

地衣芽孢桿菌B.LY02由河南科技大學宏翔生物飼料實驗室分離保存。

種子培養(yǎng)基：蛋白胨10.0 g/L，牛肉膏5.0 g/L，氯化鈉5.0 g/L，pH值7.0～7.2。121 ℃高壓滅菌20 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基：牛肉膏5.0 g/L，氯化鈉5.0 g/L，蛋白胨10.0 g/L，羧甲基纖維素鈉10.0 g/L，pH值7.0～7.2。121 ℃高壓滅菌20 min。

發(fā)酵產酶培養(yǎng)基：蛋白胨10.0 g/L，酵母膏10.0 g/L，羧甲基纖維素鈉10.0 g/L，氯化鈉5.0 g/L，磷酸二氫鉀1.0 g/L，pH值7.0～7.2。121 ℃高壓滅菌20 min。

3,5-二硝基水楊酸(3,5-dinitrosalicylic acid，DNS)試劑：稱取200.0 g酒石酸鉀鈉，溶于一定量水中，加熱溶解，添加3,5-二硝基水楊酸10.0 g，氫氧化鈉10.0 g，溶解后加入苯酚2.0 g，無水亞硫酸鈉0.5 g。全部加熱溶解后，冷卻至室溫，定容至1 000 mL。用前一周配制。

1.2方法

1.2.1培養(yǎng)基碳源的優(yōu)化

在發(fā)酵產酶培養(yǎng)基中用不同的碳源(葡萄糖、蔗糖、乳糖、麥芽糖、果糖和淀粉)，質量濃度為10 g/L，按2.0%(體積分數)接種種子液，37 ℃、轉速180 r/min振蕩培養(yǎng)24 h，離心取上清液。采用3,5-二硝基水楊酸法[5,12]測定上清液中的纖維素酶酶活(下同)，確定培養(yǎng)基的最佳碳源。

1.2.2培養(yǎng)基氮源的優(yōu)化

在最佳碳源的基礎上，培養(yǎng)基中用不同的氮源(蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、硫酸銨、氯化銨、硝酸銨和硝酸鉀)，質量濃度均為10 g/L，按2.0%(體積分數)接種種子液，37 ℃、轉速180 r/min振蕩培養(yǎng)24 h，離心取上清，測定纖維素酶酶活，確定培養(yǎng)基的最佳氮源。

1.2.3接種量的優(yōu)化

將種子液按體積分數分別為0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%和4.0%接種于100 mL優(yōu)化的產酶培養(yǎng)基，于37 ℃、轉速180 r/min振蕩培養(yǎng)24 h，離心取上清，測定纖維素酶酶活，確定最佳接種量。

1.2.4搖床轉速的優(yōu)化

取10個250 mL三角瓶，各加入50 mL優(yōu)化的產酶培養(yǎng)基，按1.2.3篩選的最佳接種量接種，分別于120 r/min、140 r/min、160 r/min、180 r/min、200 r/min、220 r/min、240 r/min和260 r/min的轉速下，37 ℃振蕩培養(yǎng)24 h。離心取上清，測定纖維素酶酶活，確定最佳搖床轉速。

1.2.5培養(yǎng)基裝液量的優(yōu)化

取10個250 mL三角瓶，分別加入20 mL、40 mL、50 mL、60 mL、70 mL、80 mL、90 mL和100 mL優(yōu)化的產酶培養(yǎng)基，按1.2.3篩選的最佳接種量接種，于37 ℃、轉速180 r/min振蕩培養(yǎng)24 h。離心取上清，測定纖維素酶酶活，確定最佳裝液量。

1.2.6培養(yǎng)溫度的優(yōu)化

采用上述最佳條件，將菌液分別于25 ℃、28 ℃、31 ℃、34 ℃、37 ℃、40 ℃、43 ℃和46 ℃條件下培養(yǎng)24 h，每瓶取樣5 mL,離心取上清，測定纖維素酶酶活，確定最適培養(yǎng)溫度。

1.2.7培養(yǎng)時間的優(yōu)化

采用上述最佳條件，將菌液分別培養(yǎng)12 h、18 h、24 h、30 h、36 h、42 h、48 h和54 h，每瓶取樣5 mL,離心取上清，測定纖維素酶酶活，確定最適培養(yǎng)時間。

1.2.8培養(yǎng)基初始pH值的優(yōu)化

取6個200 mL三角瓶，采用上述最佳條件進行配制，將各瓶培養(yǎng)基 pH值分別調至4.0、5.0、6.0、7.0、8.0和9.0，按照上述最佳條件培養(yǎng)，離心取上清，測定纖維素酶酶活，確定最佳初始pH值。

1.2.9優(yōu)化前后酶活對比

采用最佳培養(yǎng)基及最佳發(fā)酵條件對B.LY02菌株進行發(fā)酵培養(yǎng)，測定纖維素酶酶活，同時以優(yōu)化前發(fā)酵條件為對照，對比優(yōu)化后和優(yōu)化前菌株纖維素酶酶活的變化。

2結果與分析

2.1培養(yǎng)基碳源對酶活的影響

在發(fā)酵產酶培養(yǎng)基的基礎上，研究不同碳源對B.LY02菌株產纖維素酶酶活的影響，結果見表1。由表1可以看出：當以麥芽糖為碳源時酶活最高，而以葡萄糖為碳源時酶活最低。

表1　培養(yǎng)基碳源對菌株產纖維素酶酶活的影響

2.2培養(yǎng)基氮源對酶活的影響

在發(fā)酵產酶培養(yǎng)基的基礎上，研究不同氮源對B.LY02菌株產纖維素酶酶活的影響，結果見表2。由表2可以看出：該菌株對有機氮源的利用顯著優(yōu)于無機氮源，其中，以酵母膏為氮源時菌株的酶活最高，其次是蛋白胨和牛肉膏。

表2　培養(yǎng)基氮源對菌株產纖維素酶酶活的影響

2.3接種量對酶活的影響

不同接種量對菌株產纖維素酶酶活的影響結果見表3。由表3可以看出：在接種量為0.5%～2.0%時，菌株產酶活性基本與接種量呈正相關，隨著接種量的增加而增加；接種量為2.0%時酶活最高，然后隨著接種量的增加，酶活呈逐漸下降趨勢。

表3　接種量對菌株產纖維素酶酶活的影響

2.4搖床轉速對酶活的影響

搖床轉速對產纖維素酶酶活的影響結果見表4。由表4可知：轉速在180～200 r/min時酶活最高；但當轉速超過200 r/min時，酶活呈下降趨勢。

表4　搖床轉速對菌株產纖維素酶酶活的影響

2.5培養(yǎng)基裝液量對酶活的影響

培養(yǎng)基裝液量對產纖維素酶酶活的影響結果見表5。由表5可知：裝液量在20～60 mL時，隨著裝液量的增加，菌株酶活也在增加；在裝液量為60 mL時，菌株酶活最大，但超過60 mL后，酶活呈下降趨勢。

表5　培養(yǎng)基裝液量對菌株產纖維素酶酶活的影響

2.6培養(yǎng)溫度對酶活的影響

使用上述優(yōu)化后的培養(yǎng)基，在最佳培養(yǎng)條件下，選擇不同溫度進行搖瓶培養(yǎng)，研究培養(yǎng)溫度對菌株產纖維素酶酶活的影響，結果見表6。由表6可知：在37 ℃時酶活最高；當溫度低于34 ℃或高于40 ℃時，酶活都會顯著下降。

表6　培養(yǎng)溫度對菌株產纖維素酶酶活的影響

2.7培養(yǎng)時間對酶活的影響

在上述優(yōu)化條件的基礎上，研究培養(yǎng)時間對菌株產纖維素酶酶活的影響，結果見表7。由表7可知：當培養(yǎng)至30 h時，粗酶液的酶活最高，并且在24～36 h均可保持較高的酶活；當培養(yǎng)時間低于18 h時，酶活呈直線下降趨勢，而高于42 h時酶活則緩慢下降。

表7　培養(yǎng)時間對菌株產纖維素酶酶活的影響

2.8培養(yǎng)基初始pH值對酶活的影響

分別配制不同初始pH值的培養(yǎng)基，其他條件按照上述最佳條件進行，培養(yǎng)合適時間后，研究初始pH值對菌株產纖維素酶酶活的影響，結果見表8。由表8可知：pH值在5.0時酶活最高；而pH值低于5.0或高于7.0時，纖維素酶酶活均快速下降。

表8　培養(yǎng)基初始pH值對菌株產纖維素酶酶活的影響

2.9優(yōu)化前后酶活對比

采用優(yōu)化前和優(yōu)化后的培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件，同時對B.LY02菌株進行發(fā)酵培養(yǎng)，測定其產纖維素酶酶活，優(yōu)化結果顯示：優(yōu)化后所得的纖維素酶酶活可達0.683 5 U/mL，較優(yōu)化前的0.535 1 U/mL提高了約27.73%。

3討論

與其他微生物一樣，地衣芽孢桿菌所產酶的酶活受培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件的影響，如培養(yǎng)基的碳源、氮源、初始pH值、培養(yǎng)溫度、時間以及搖床轉速等[7，13]。因此，本文主要對這些產酶條件進行了優(yōu)化。接種量會影響菌株的生長速度，從而影響其代謝產物的水平[14]。接種量的優(yōu)化結果表明：在接種量高于2.0%時，菌株產酶活性隨著接種量的增加呈逐漸下降趨勢。這是因為隨著接種量的增加，培養(yǎng)基中的營養(yǎng)消耗得太快，增殖的細菌量減少，菌株的產酶活性也隨之下降。本文研究結果顯示：隨著搖床轉速的提高，菌株產酶活性也在逐漸增加。這是因為B.LY02菌株是一種完全需氧菌[5]，轉速提高，不僅會增加培養(yǎng)基的溶氧量，而且還有利于菌體與培養(yǎng)基的充分均質，以利于菌株的生長，菌株產酶活性自然就增加。但當轉速超過200 r/min時，酶活呈下降趨勢，這是因為轉速過快會加速菌體的裂解，或加速菌株孢子體的形成，從而影響酶的產生。裝液量可影響培養(yǎng)液的溶氧量，因此也直接影響菌株的生長速度。裝液量少會加速菌株的生長，因此菌株產酶活性增加；裝液量過多，影響菌液的溶氧量和上下層培養(yǎng)液的均勻性，從而影響酶的快速產生。因此，在裝液量為60 mL時，菌株的產酶活性達到最大，隨后產酶活性下降。從研究結果看出：培養(yǎng)溫度和pH值對B.LY02菌株產纖維素酶的能力具有較大影響。在最佳pH值和最佳培養(yǎng)溫度前后，菌株的產酶活性下降都較快，這與文獻[15]試驗結果相似。因此，在利用該菌株發(fā)酵產纖維素酶時要控制好培養(yǎng)溫度，并實時監(jiān)測和調節(jié)培養(yǎng)液的pH值，以最大限度地發(fā)揮菌株的產酶潛能。培養(yǎng)時間優(yōu)化結果表明：B.LY02菌株需要培養(yǎng)到一定時間后，才開始快速分泌纖維素酶，培養(yǎng)36 h以后，菌株產酶活性緩慢下降。這是由于隨著培養(yǎng)時間的延長，菌株生長緩慢或停止生長，產酶也隨之下降或停止，而已產生的酶可能會被多余的底物消耗或被離子螯合。采用優(yōu)化后的發(fā)酵條件對B.LY02菌株進行培養(yǎng)后，其纖維素酶酶活達0.683 5 U/mL，雖然較出發(fā)菌株提高了約27.73%，但其產酶活性還不是很理想，期望通過對菌株進行誘變選育可進一步提高該菌株的產酶活性[16]。

本研究結果表明：按照2.0%的接種量將B. LY02菌株接種至60 mL(250 mL三角瓶)、碳源為麥芽糖、氮源為酵母膏、初始pH值為5.0的發(fā)酵產酶培養(yǎng)基中，在37 ℃、轉速為180～200 r/min條件下培養(yǎng)30 h，菌株所產纖維素酶酶活達0.683 5 U/mL，較優(yōu)化前提高了約27.73%。

參考文獻：

[1]BHAT M K,BHAT S.Cellulose degrading enzymes and their potential industrial applications[J].Biotechnology advances,1997,15(3):583-620.

[2]REGINA V,ALGIMANTAS P,VITA R.Cellulose degradation in rye straw by micromycetes and their complexes[J].Ekologija,2008,54(1):29-31.

[3]方詡,秦玉琪,李雪芝,等.纖維素酶與木質纖維素生物降解轉化的研究進展[J].生物工程學報,2010,26(7):864-869.

[4]潘進權,鐘德廣.固定化地衣芽孢桿菌產彈性蛋白酶的研究[J].食品科學,2014,23:176-181.

[5]董鶴娟,丁軻,恒子鈐,等.一株土壤源高產纖維素酶芽孢桿菌的分離與鑒定[J].家畜生態(tài)學報,2013,34(6):48-52.

[6]劉洋,王一琰,白黎婧,等.一株酸性淀粉酶產生菌的分離鑒定及其酶學性質研究[J].食品工業(yè)科技,2014,35(4):174-178.

[7]吳程雨.地衣芽孢桿菌脂肪酶發(fā)酵條件優(yōu)化及固定化研究[D].杭州:浙江理工大學,2015.

[8]LI W,HUAN X J,ZHOU Y,et al.Simultaneous cloning and expression of two cellulase genes fromBacillussubtilisnewly isolated from Golden Takin (BudorcastaxicolorBedfordi)[J].Biochemical and biophysical research communications,2009,383(4):397-400.

[9]屈二軍,謝展,馬孟星,等.高產纖維素酶的綠色木霉菌種的誘變和篩選[J].農業(yè)與生物技術學報,2011,12(10):1411-1412,1416.

[10]鄭豪盈,樊永欣,張林,等.書虱伴生菌中纖維素酶產生菌的篩選、鑒定及最佳產酶發(fā)酵條件的優(yōu)化[J].環(huán)境工程學報,2015,9(8):4090-4096.

[11]董鶴娟,丁軻,恒子鈐,等.一株土壤源高產纖維素酶芽孢桿菌的分離與鑒定[J].家畜生態(tài)學報,2013,34(6):48-52.

[12]羅艷青,張丹,馮?，|,等.DNS法檢測灰略紅鏈霉菌JSD-1產纖維素酶的CMC酶活條件的優(yōu)化[J].食品工業(yè)科技,2015,36(3):156-162.

[13]龔勁松,李恒,劉恒霞,等.碳氮源對枯草芽孢桿菌發(fā)酵產β-甘露聚糖酶的影響[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2015,41(10):34-39.

[14]張謙,賈佳,林智,等.產脂肪酶黑曲霉搖瓶發(fā)酵條件優(yōu)化研究[J].生物技術通報,2015,31(12):1-6.

[15]付星,閆巧娟,江正強,等.高產幾丁質酶巴倫葛茲類芽孢桿菌的篩選和發(fā)酵條件優(yōu)化[J].微生物學通報,2015,42(4):625-633.

[16]方芳,李相前,趙玉萍,等.紫外-微波復合誘變選育高產纖維素酶的Trichodermaasperelloides菌株[J].中國飼料,2015(2):27-30.

基金項目：河南省科技廳重大科技攻關基金項目(131100110300)；河南省教育廳重點基金項目(13B230987)

作者簡介：余祖華(1977-)，女，河南商城人，講師，博士，主要從事動物微生態(tài)學和動物免疫學方面的研究.

收稿日期：2016-01-24

文章編號：1672-6871(2016)04-0076-05

DOI:10.15926/j.cnki.issn1672-6871.2016.04.016

中圖分類號：S816.3

文獻標志碼：A