李佑生,　廖水玉,2,　李董平,2,　陳玲玲

(1.暨南大學第二臨床醫(yī)學院，深圳市人民醫(yī)院,廣東 深圳 518020;2.暨南大學醫(yī)學院,廣州 510632)

知柏地黃湯對大鼠膜性腎病大劑量激素治療中的增效減毒作用

李佑生1,廖水玉1,2,李董平1,2,陳玲玲1

(1.暨南大學第二臨床醫(yī)學院，深圳市人民醫(yī)院,廣東 深圳 518020;2.暨南大學醫(yī)學院,廣州 510632)

摘要：探討了知柏地黃湯對大鼠膜性腎病(Membranous Nephropathy,MN)大劑量激素治療中的增效減毒作用。針對7周齡SPF級雄性SD大鼠45只,將其分為空白組(C)、模型組(MG)、知柏地黃湯組(ZDD),每組各15只,采用陽離子牛血清白蛋白(C-BSA)、甲潑尼龍琥珀酸鈉(MPSS)制備大鼠MN伴激素性骨損傷復(fù)合模型,藥物干預(yù)4周后觀察24 h尿蛋白、血清白蛋白(ALB)、總蛋白(TP)、甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)及腎臟、股骨頭病理及其半定量分析。結(jié)果表明:與MG組比較,ZDD組24 h尿蛋白、血清TC、TG水平顯著降低(P<0.01),血清TP、ALB水平顯著升高(P<0.01),腎組織病理損害較輕,免疫復(fù)合物IgG、補體C3熒光染色較弱,骨組織病理損害較輕。ZDD在對大鼠MN大劑量激素治療中,可能具有緩解蛋白尿、調(diào)節(jié)血脂代謝、改善腎臟病理改變的作用,以及改善激素性骨損傷的作用。

關(guān)鍵詞：膜性腎病; 骨損傷; 激素; 知柏地黃湯

膜性腎病(MN)是原發(fā)性腎小球疾病中常見的病理類型之一,其70%～80%表現(xiàn)為腎病綜合征。目前常用的治療方法是利用糖皮質(zhì)激素(簡稱激素)，但激素治療面臨的一個難題是MN多對激素不敏感,難以完全緩解，且95%的MN表現(xiàn)為激素耐藥。激素的耐藥機制研究表明,耐藥主要與糖皮質(zhì)激素受體功能及基因多態(tài)性、免疫因素、脂類因素及腎素血管緊張素系統(tǒng)等有關(guān)[1]。對于耐藥的治療,常配合免疫抑制劑治療,但帶來的毒副作用更大[2]。激素治療面臨的另一個難題是毒副作用,其中一個重要的毒副作用是骨損傷問題。目前對激素導(dǎo)致骨損傷的機制認識尚處于研究階段,對激素導(dǎo)致骨損傷的防治措施主要是應(yīng)用影響鈣磷代謝的藥物,如骨化三醇、阿侖磷酸等[3]。這類藥物的效果尚不確定,且價格昂貴,不利于長期服用,因此缺乏有效的防治手段?，F(xiàn)有研究表明,中西醫(yī)結(jié)合治療腎病綜合征可達到減毒增效的作用,但具體如何結(jié)合,仍存在爭議[4]。中西醫(yī)結(jié)合對MN提高療效的同時減輕激素性骨損傷副作用鮮有報道，同時中醫(yī)藥對激素性骨損傷的研究也鮮見提及腎病綜合征。在腎病綜合征發(fā)病的初期,應(yīng)用大劑量激素的同時,以滋陰降火為主,藥用知母、黃柏、生地、丹皮、甘草等,或許可以提高臨床療效[5]。此外,苦味藥黃連黃柏的主要有效成分小檗堿對去卵巢大鼠骨質(zhì)疏松癥可能具有防治作用[6]。有研究提出“苦堅腎”理論,以苦味為主組成的復(fù)方黃萸方,或許能很好地改善糖尿病腎病蛋白尿,并減輕導(dǎo)致蛋白尿的關(guān)鍵因素之一——足細胞的損傷[7]。因此,本實驗擬建立膜性腎病伴有大劑量激素治療而合并骨損傷的動物模型,從而能更好地觀察中藥增效減毒的功效。且含治療上采用含苦味藥的知柏地黃湯,擬在動物實驗中研究探討知柏地黃湯對膜性腎病伴激素骨損傷復(fù)分模型大鼠的增效減毒作用,以期探索有效的中西醫(yī)結(jié)合治療MN的方案。

1材料與方法

1.1主要試劑與儀器

牛血清白蛋白(BSA,美國Sigma);碳二亞胺鹽酸(EDC,美國Aladdin);無水乙二胺(EDA,美國Aladdin);佛氏完全佐劑(美國Sigma公司);總蛋白試劑盒(CSF-終點法,北京利德曼生化股份有限公司);總蛋白試劑盒(積水醫(yī)療株式會社);白蛋白試劑盒(積水醫(yī)療株式會社);血肌酐測定試劑盒(煙臺澳斯邦生物工程有限公司);總膽固醇試劑盒(浙江東甌診斷產(chǎn)品有限公司);甘油三酯試劑盒(廣州科方生物技術(shù)有限公司);血尿素氮測定試劑盒(四川麥克生物科技股份有限公司);羊抗大鼠IgG(英國Abcam公司);小鼠抗大鼠C3(英國Abcam公司);7600-020全自動生化分析儀(日本Hitachi);電動多功能直立熒光顯微鏡(德國 Leica)。

1.2實驗動物

SPF級雄性7周齡SD大鼠45只,(200±20) g(廣州中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供,許可證號為SCXK(粵)2013-0034)。

1.3實驗藥物及藥物制備

注射用甲潑尼龍琥珀酸鈉由輝瑞制藥比利時公司生產(chǎn),藥物劑量為20 mg/(kg·d)。知柏地黃湯(知母20 g、黃柏10 g、熟地黃10 g、山茱萸10 g、山藥15 g、丹皮10 g、茯苓10 g、澤瀉10 g)的大鼠給藥劑量為8.55 g/kg,知柏地黃湯免煎顆粒劑的大鼠劑量為1.325 g/kg,質(zhì)量濃度為0.265 g/mL。上述中藥免煎顆粒劑由深圳華潤三九醫(yī)藥股份有限公司生產(chǎn)。

1.4分組

檢測各組大鼠24 h尿蛋白定量小于10 mg的納入實驗。將45只大鼠隨機分為空白組(C)15只,模型組(MG)15只,知柏地黃湯組(ZDD)15只。

1.5模型制備

1.5.1MN模型制備參考經(jīng)典Border法以陽離子牛血清的蛋白(C-BSA)制備大鼠MN模型[8]。

預(yù)免疫:將等量完全弗氏佐劑和C-BSA乳化后于MG組和ZDD組大鼠皮下多點注射1次,每只0.5 mL。正式免疫:預(yù)免疫1周后隔天1次大鼠尾靜脈注射C-BSA16 mg/kg,連續(xù)4周。C組每日尾靜脈注射生理鹽水1次,連續(xù)4周。

1.5.2骨損傷模型的誘導(dǎo)MG和ZDD組MN造模后腹腔注射甲潑尼龍琥珀酸鈉20 mg/(kg·d),治療MN的同時誘導(dǎo)產(chǎn)生骨損傷,每日1次連續(xù)4周[9]。C組腹腔注射對應(yīng)劑量的超純水,每日1次,連續(xù)4周。

1.6藥物干預(yù)

ZDD組在甲潑尼龍琥珀酸鈉(MPSS)治療基礎(chǔ)上給予知柏地黃湯,每日1次灌胃,連續(xù)4周,C組和MG組給予相應(yīng)劑量的超純水灌胃,每日1次,連續(xù)4周。

1.7實驗指標及檢測方法

大鼠一般情況、24 h尿蛋白定量、血清白蛋白(ALB)、總蛋白(TP)、甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、尿素氮(BUN)、肌酐(Scr)由全自動生化儀檢測;免疫復(fù)合物IgG、補體C3用間接免疫熒光法檢測；腎臟病理用HE、Masson、PAS染色檢測；股骨頭病理用HE染色檢測。

1.8腎臟、股骨頭病理半定量分析

腎臟病理半定量法分別對腎小球病變、腎小管間質(zhì)病變進行評分,腎小球病變主要觀察系膜細胞和系膜基質(zhì)增生程度 (0～4分),積分評定標準為:無,0分;小于25%,1分;25%～50%,2分;51%～75%,3分;大于75%,4分。腎小管間質(zhì)病變包括間質(zhì)炎細胞浸潤 、間質(zhì)纖維化和腎小管萎縮(0～4分),依據(jù)腎小管間質(zhì)炎細胞浸潤 、間質(zhì)纖維化和腎小管萎縮面積所占百分比評分:0,0分;小于10%,1分;10%～25%,2分;25%～50%,3分;大于50%,4分。

腎臟熒光染色病理切片在熒光顯微鏡下鏡檢觀察熒光的強度,標準為:低倍鏡下不能顯示,高倍鏡下似乎可見(±),0分;低倍鏡下似乎可見,高倍鏡下可見(+)，1分;低倍鏡下可見,高倍鏡下清晰可見(++)，2分;低倍鏡下清晰可見,高倍鏡下耀眼(+++),3分;低倍鏡下耀眼,高倍鏡下刺眼(++++),4分。

光鏡下觀察股骨頭的病理改變,并進行股骨頭病理損傷半定量分析。積分評定標準為:0分:骨組織結(jié)構(gòu)、骨骼肌結(jié)構(gòu)、軟骨結(jié)構(gòu)正常;骨小梁結(jié)構(gòu)正常;骨髓腔三系造血細胞形態(tài)、數(shù)量均正常;未見骨組織壞死;未見炎性細胞浸潤;未見出血。1分:骨結(jié)構(gòu)基本正常,骨髓腔內(nèi)造血細胞數(shù)量輕度增加,少許炎性細胞浸潤。2分:骨結(jié)構(gòu)基本正常,骨髓腔內(nèi)可見少量脂肪細胞、造血細胞數(shù)量增加,骨髓腔內(nèi)可見小灶性出血或陳舊性出血,炎性細胞浸潤。3分:軟骨區(qū)可見軟骨細胞壞死脫落,軟骨表面粗糙不平;骨小梁局灶性壞死,骨陷窩消失;骨髓腔內(nèi)造血細胞數(shù)量減少,形態(tài)改變,骨髓腔內(nèi)灶性出血;炎性細胞浸潤。

1.9統(tǒng)計方法

采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件分析。計量數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準差(SD)表示,兩組樣本間對比采用t檢驗,非正態(tài)分布資料或方差不齊,采用秩和檢驗,多組比較采用單因素方差分析,多組之間兩兩比較采用Bonferroni檢測,重復(fù)測量數(shù)據(jù)采用重復(fù)測量方差分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2結(jié)果

2.1大鼠一般情況

MN造模后大鼠出現(xiàn)精神狀態(tài)差、飲食飲水欠佳、毛發(fā)脫落欠光澤、大便溏等癥狀。藥物治療4周后,ZDD組大鼠精神狀態(tài)可,飲食飲水量逐漸恢復(fù),毛發(fā)脫落緩解,便溏癥狀明顯改善,MG組大鼠用藥后精神狀態(tài)、毛發(fā)脫落等癥狀改善不明顯。

2.224 h尿蛋白以及血清TP、ALB、TC、TG、BUN、Scr測定

各組大鼠24 h尿蛋白以及血清ALB、TP、TC、TG、BUN、Scr水平比較如圖1所示。MN造模后,MG組、ZDD組24 h尿蛋白超過10 mg,與C組比較,有統(tǒng)計學差異(P<0.01),提示大鼠MN造模成功;ZDD及MPSS治療第4周末,與C組比較,MG組、ZDD組血清BUN、Scr升高不明顯,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05);與MG組比較,ZDD組24 h尿蛋白定量,血清TC、TG水平顯著降低(P<0.01),血清TP、ALB水平顯著升高(P<0.01)。

2.3腎臟病理及其半定量分析

腎臟病理結(jié)果如圖2所示。圖中的HE、MASSON、PAS分別指蘇木精-伊紅染色、馬松三色染色和糖原染色。C組大鼠腎組織結(jié)構(gòu)未見異常;ZDD組大鼠腎小球輕度腫大,腎小球囊腔輕度擴張,腎小球囊腔輕度擴張,局部區(qū)域腎小管中度擴張伴腎小管上皮細胞輕度脫落,腎間質(zhì)未見明顯淋巴細胞浸潤,未見纖維化病變,腎小球毛細血管中度擴張充血,腎小球基底膜輕度增厚;MG組大鼠腎小球中度增大或萎縮,腎小球可見輕度分葉現(xiàn)象,腎小球囊腔中度擴張,局部可見腎小管間質(zhì)中度纖維化,伴腎小管萎縮,部分腎小管上皮細胞刷狀緣脫落,局部區(qū)域腎小管間質(zhì)見少量淋巴細胞浸潤,可見腎間質(zhì)纖維化病變;部分腎小球可見局部壁層上皮細胞輕度增生,腎小球系膜細胞中度增生,腎小球基底膜中度增厚。

圖1　各組大鼠 24 h 尿蛋白定量以及血清 ALB、 TP、 TC、 TG、 BUN、 Scr 水平比較

圖2　各組大鼠腎臟鏡下結(jié)構(gòu)觀察結(jié)果

腎小球病理積分結(jié)果表明,與MG組相比,ZDD組大鼠腎小球病理積分明顯降低(P<0.01)。腎小管間質(zhì)病理積分結(jié)果表明,與MG組相比,ZDD組大鼠腎小管間質(zhì)病理積分明顯降低(P<0.05),結(jié)果見表1。

間接免疫熒光結(jié)果如圖3所示，較C組大鼠腎小球毛細血管袢,MG組可見IgG和補體C3呈較為粗大顆粒狀,沿腎小球毛細血管袢呈彌漫性分布,染色呈強陽性(+++);ZDD組大鼠可見IgG和C3呈較小顆粒狀,沿腎小球毛細血管袢分布,染色呈陽性(++)。

表1　不同分組大鼠腎臟病變半定量評分情況

N=14

圖3　各組大鼠腎臟免疫熒光觀察結(jié)果

腎臟免疫熒光積分結(jié)果見表2,與MG組相比,ZDD組大鼠腎臟免疫熒光積分明顯降低(P<0.01)。

表2　不同分組大鼠腎臟免疫熒光定量評分情況

N=14

2.4股骨頭病理及其半定量分析

股骨骨頭病理結(jié)果如圖4所示。C組大鼠關(guān)節(jié)部位骨組織結(jié)構(gòu)未見異常;ZDD組大鼠骨小梁結(jié)構(gòu)正常,未見壞死,未見炎性細胞浸潤;骨髓腔內(nèi)可見少量脂肪細胞,骨髓腔內(nèi)可見少量紅細胞,為小灶性出血,部分骨髓腔內(nèi)造血細胞數(shù)量輕度增加;MG組大鼠關(guān)節(jié)軟骨區(qū)可見軟骨細胞壞死脫落,伴炎性細胞灶性浸潤,軟骨表面粗糙不平。部分骨髓腔內(nèi)造血細胞數(shù)量減少,形態(tài)改變。

股骨頭病理損傷積分結(jié)果見表3,與MG組相比,ZDD組大鼠股骨頭病理積分明顯降低(P<0.01)。

圖4　各組大鼠股骨頭鏡下結(jié)構(gòu)觀察結(jié)果

GroupPathologicalfeatureintegraloffemoralheadMG34ZDD14F/χ20.684P0.009

N=14

3討論

目前MN的主要治療方法有藥物治療(如ACEI、ARB)、激素和免疫抑制劑，以及一些對癥治療等[10]，其中激素法仍是目前最主要的治療方法與手段。在MN的治療中,激素治療的緩解率低,尤其是長期激素治療還存在諸多毒副作用。骨損傷是激素長期應(yīng)用中的一個重要副作用,對中老年患者尤顯突出。現(xiàn)有的腎臟病治療指南推薦在超過3個月的大劑量類固醇治療的患者中,應(yīng)預(yù)防骨質(zhì)疏松,但現(xiàn)有研究報道激素性骨損傷防治措施的療效待進一步考察[11]。

本實驗采用中西醫(yī)結(jié)合治療MN,即在大劑量激素治療MN的同時,給予知柏地黃湯,觀察知柏地黃湯對MN的增效減毒作用。

從中醫(yī)理論分析,蛋白作為精微物質(zhì)從體內(nèi)流失,當屬腎之封藏失司,固攝無權(quán)所致,即《諸病源候論》中論述“勞傷腎虛,不能藏于精,故因小便而精微出也”。因此對于蛋白尿的治療,固腎當屬重要的治療法則。一般臨床補腎固澀多用酸收之品,但用其療效并不理想?！端貑枴げ貧夥〞r論》明確指出“腎欲堅,急食苦以堅之,以苦補之,咸寫之”?！翱鄨阅I”可以理解為苦味藥具有藏精固腎的功效。知柏地黃湯在補腎方的基礎(chǔ)上,加以知母黃柏“苦堅腎”以固腎。

激素為溫熱陽燥、純陽之品,長期大量使用必然會耗傷機體陰精,陰不制陽,機體陰陽平衡被破壞,則出現(xiàn)陰虛火旺的癥候,因此可在MN大劑量激素治療階段采取滋陰降火的治療法則,知柏地黃湯為滋陰降火良方。

激素導(dǎo)致的骨損傷從中醫(yī)理論認識來講也與腎相關(guān),腎的功能不僅主藏精,還主骨,也就是說,骨的病變多從腎虛來認識與治療。因此,“苦堅腎”的科學內(nèi)涵不僅體現(xiàn)在固腎,還體現(xiàn)對骨的作用,即間接補腎、壯骨。知柏地黃湯中知柏、地黃即有“苦堅腎”之意。

本實驗在大劑量激素使用階段配合應(yīng)用知柏地黃湯方進行治療,實驗結(jié)果表明,ZDD結(jié)合MPSS治療MN可能可以緩解蛋白尿、調(diào)節(jié)血脂代謝及進一步改善腎臟病理改變,并能同時起到減輕激素性骨損傷的減毒作用。知柏地黃湯可能通過增強機體的抗氧化能力,加速自由基及其代謝產(chǎn)物的消除,減輕體內(nèi)的脂質(zhì)過氧化反應(yīng),促進蛋白質(zhì)的合成,從而改善高脂血癥和低蛋白血癥[12]。研究表明苦味藥黃柏中所含小檗堿可能通過調(diào)節(jié)黏附因子的表達,改善足細胞黏附功能,從而降低蛋白尿,延緩腎病的進展[13]。黃柏還可能通過影響骨髓間充質(zhì)干細胞成骨分化來減輕激素的副作用[14]?？梢奪DD在MN大鼠大劑量激素治療中,可以在一定程度上提高療效,減輕激素性骨損傷的不良反應(yīng)。但本實驗僅觀察到了短期副作用骨損傷的出現(xiàn),對部分長期副作用,特別是骨質(zhì)疏松,可在激素應(yīng)用甚至停用后數(shù)年乃至數(shù)十年后出現(xiàn),因此需延長干預(yù)時間和擴大大鼠樣本量來進行深入研究。苦味藥對激素性骨損傷的作用機理也有待進一步的研究。尋求有效的最佳治療方法,從而最大限度地減少激素的不良反應(yīng),提高臨床療效,提高患者的生活質(zhì)量,仍是今后MN治療方案的一個重大課題,值得進一步研究、探索。

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Efficacy Enhancing and Toxicity Reducing Effect of Zhibai Dihuang Decoction on Membranous Nephropathy Rats Treating with a Large Dose of Glucocorticoids

LI You-sheng1,LIAO Shui-yu1,2,LI Dong-ping1,2,CHEN Ling-ling1

(1.Second Clinical College of Jinan University,Shenzhen People’s Hospital,Shenzhen 518020,Guangdong,China; 2.Medical College of Jinan University,Guangzhou 510632,China)

Abstract:The efficacy enhancing and toxicity reducing effect of Zhibai Dihuang Decoction in treating rats with membranous nephropathy (MN) with a large dose of glucocorticoids were studied,aiming at 45 SPF grade male SD rats aged 7 weeks,which were divided into control group (C),model group (MG) and Zhibai Dihuang Decoction group (ZDD),with 15 rats in each group.The MN model with steroid induced bone damage of rats was established with the cationic bovine serum albumin(C-BSA)and methylprednisolone sodium succinate (MPSS).24 h Urinary protein,serum albumin (ALB),total protein (TP),triglyceride (TG),total cholesterol (TC),creatinine (Scr),blood urea nitrogen (BUN),and the pathology of kidney and femoral head and its semiquantitative analysis were observed after the drug intervention for 4 weeks.Compared with these of the MG group,in the ZDD group,the levels of 24 h urine protein,serum TC and TG decreased significantly (P<0.01),the levels of serum TP and ALB increased significantly (P<0.01),the renal tissue was less damaged in pathology,the fluorescent staining of the immune complexes IgG and complement C3 was weaker,and the bone tissue was less damaged in pathology.Conclusion in the treatment with a large dose of glucocorticoids on rats with MN:ZDD may have the effect of alleviating proteinuria,regulating blood lipid metabolism,improving renal pathological changes and improving the steroid induced bone damage.

Key words:membranous nephropathy; steroid induced bone damage; glucocorticords; Zhibai Dihuang Decoction

收稿日期：2015-12-14

基金項目：深圳市科技創(chuàng)新委員會項目(JCYJ20130402092657779)

作者簡介：李佑生(1964-),男,湖南長沙人,主任醫(yī)師,博士,研究方向為中西醫(yī)結(jié)合臨床(腎病、代謝病方向)。 通信聯(lián)系人：廖水玉,E-mail:907336509@qq.com

文章編號：1006-3080(2016)02-0187-07

DOI:10.14135/j.cnki.1006-3080.2016.02.006

中圖分類號：R259

文獻標志碼：A