趙　晶,　王澤建,　郭美錦,　儲(chǔ)　炬,　張嗣良,　樓覺(jué)人

(1.華東理工大學(xué)生物反應(yīng)器工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,上海 200237;2.上海生物制品研究所有限責(zé)任公司,上海 200052)

重組畢赤酵母發(fā)酵表達(dá)人乳頭瘤病毒病毒樣顆粒培養(yǎng)工藝條件的優(yōu)化

趙晶1,王澤建1,郭美錦1,儲(chǔ)炬1,張嗣良1,樓覺(jué)人2

(1.華東理工大學(xué)生物反應(yīng)器工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,上海 200237;2.上海生物制品研究所有限責(zé)任公司,上海 200052)

摘要：對(duì)重組畢赤酵母表達(dá)人乳頭瘤病毒病毒樣顆粒發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化。在全合成搖瓶培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上,考察了誘導(dǎo)過(guò)程中培養(yǎng)液pH、溫度、銨離子、油酸對(duì)人乳頭瘤病毒病毒樣顆粒發(fā)酵的影響。研究表明發(fā)酵過(guò)程中單體蛋白16 L1的表達(dá)條件與組裝條件不同:pH=4.5最適于單體L1表達(dá),而pH=3.5則最適于VLPs組裝;28 ℃利于單體L1表達(dá),而30 ℃則促進(jìn)VLPs組裝;發(fā)酵指數(shù)生長(zhǎng)期誘導(dǎo)時(shí)銨離子濃度為0.26～0.30 mol/L,利于菌體生長(zhǎng)、單體L1表達(dá)與組裝;生長(zhǎng)穩(wěn)定期時(shí)銨離子濃度為0.34～0.42 mol/L,最有利于單體的合成與組裝。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),誘導(dǎo)初期添加油酸,會(huì)抑制單體L1表達(dá),而在誘導(dǎo)中期添加φ=5%油酸則能夠極大地促進(jìn)L1自組裝。畢赤酵母發(fā)酵過(guò)程中胞內(nèi)單體L1表達(dá)與自組裝的最優(yōu)化工藝條件的考察,為工業(yè)發(fā)酵優(yōu)化表達(dá)人乳頭瘤病毒病毒樣顆粒提供了應(yīng)用基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：重組畢赤酵母; 人乳頭瘤病毒病毒樣顆粒; 發(fā)酵條件優(yōu)化; 自組裝

宮頸癌對(duì)女性的危害極大,人乳頭瘤病毒(human papillomavirus,HPV)是宮頸癌的主要致病因子。全球?qū)m頸癌感染者之中,發(fā)展中國(guó)家占80%[1]。近年來(lái),一些大的臨床試驗(yàn)表明,基于基因工程重組技術(shù)表達(dá)的人乳頭瘤病毒病毒樣顆粒(Human Papillomavirus Virus-Like Particles,HPV VLPs)制備而成的預(yù)防性疫苗能夠持續(xù)免疫感染的HPV 病毒。有效地開(kāi)發(fā)這種安全、高效的疫苗,通過(guò)免疫青春期女孩,可以減少全球70%的宮頸癌疾病。

研究發(fā)現(xiàn),HPV衣殼由主要衣殼蛋白 L1(約占衣殼蛋白總量的80%以上)和次要衣殼蛋白L2組成[2-3],L1單體蛋白能夠在真核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)并能夠自組裝形成病毒樣顆粒[4-9]。由于L1單體蛋白具有很強(qiáng)的疏水性,單體蛋白之間依靠α螺旋、β折疊、β環(huán)形成的疏水區(qū)域相互作用而結(jié)合,形成五聚體,五聚體之間依靠相互間的二硫鍵結(jié)合,72個(gè)五聚體相互作用形成一個(gè)完整的高度對(duì)稱的二十面體,即人乳頭瘤病毒病毒樣顆粒[10-11]。這種自組裝成的病毒樣顆粒(VLPs)在一定程度上能夠替代天然病毒,這也是疫苗開(kāi)發(fā)過(guò)程中關(guān)鍵的一步。

目前,關(guān)于發(fā)酵優(yōu)化表達(dá)人乳頭瘤病毒病毒樣顆粒鮮有報(bào)道。李巍巍等[12]發(fā)現(xiàn)用漢遜酵母發(fā)酵表達(dá)HPV 16 VLPs時(shí),甲醇的誘導(dǎo)濃度、發(fā)酵液pH、初始接種量等因素影響HPV16 L1蛋白的表達(dá)和細(xì)胞生長(zhǎng)。其他大部分為體外試驗(yàn),改變pH、離子強(qiáng)度、氧化還原電位可導(dǎo)致HPV L1生產(chǎn)所獲得的VLPs解聚以及重新組裝[13-15]。

本文根據(jù)畢赤酵母發(fā)酵的一般性質(zhì)以及影響單體L1表達(dá)的因素和VLP自組裝特性,從發(fā)酵液初始pH、誘導(dǎo)溫度、添加物等因素對(duì)誘導(dǎo)條件進(jìn)行優(yōu)化,取得了較好的研究結(jié)果。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株構(gòu)建畢赤酵母GS115/HPV16L1muts型[16]。

1.1.2培養(yǎng)基平板培養(yǎng)基為YPD 培養(yǎng)基;種子培養(yǎng)基為酵母浸出粉胨葡萄糖培養(yǎng)基YPD 培養(yǎng)基;發(fā)酵罐培養(yǎng)基是用 FM21 基礎(chǔ)鹽配成,含甘油0.04 kg/L，PTM1 微量元素4 mL/L;補(bǔ)料生長(zhǎng)培養(yǎng)基為0.5 kg/L甘油(含12 mL/L PTM1) 補(bǔ)料液;發(fā)酵誘導(dǎo)培養(yǎng)基為甲醇(含12 mL/L PTM1)誘導(dǎo)液。

1.2方法

1.2.1畢赤酵母表達(dá)HPV 16 VLPs發(fā)酵培養(yǎng)方法

(1)搖瓶發(fā)酵條件。從新鮮YPD平板上挑單一菌落到種子培養(yǎng)基中,在28 ℃,220 r/min下培養(yǎng)20～ 25 h 后,按10%接種量接入到裝15 L分批發(fā)酵培養(yǎng)基的30 L發(fā)酵罐中進(jìn)行分批培養(yǎng)(用氨水調(diào)pH至5.0 左右),為了保持菌體生理特性的一致性,當(dāng)30 L發(fā)酵罐細(xì)胞光密度達(dá)到200左右,取出部分發(fā)酵液,放入500 mL三角瓶中，裝液量為50 mL。設(shè)置溫度28 ℃、轉(zhuǎn)速220 r/min進(jìn)行培養(yǎng)。饑餓處理2 h,待甘油完全消耗完,補(bǔ)加甲醇進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng),根據(jù)搖瓶中殘存的甲醇濃度補(bǔ)加甲醇。

(2)發(fā)酵罐培養(yǎng)條件。從新鮮YPD平板上挑單一菌落到種子培養(yǎng)基中,28 ℃、220 r/min下培養(yǎng)20～ 25 h 后,按10%接種量接入到裝有15 L分批發(fā)酵培養(yǎng)基的30 L發(fā)酵罐中進(jìn)行分批培養(yǎng)(用氨水調(diào)pH至5.0 左右),當(dāng)30 L發(fā)酵罐細(xì)胞光密度達(dá)到380左右,饑餓處理2 h,待甘油完全消耗完,補(bǔ)加甲醇進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng),根據(jù)發(fā)酵罐中殘存的甲醇濃度補(bǔ)加甲醇。

1.2.2pH測(cè)定使用pH電極(METTLER TOLEDO 公司產(chǎn)品 405-DPAS-SC-K8S/120)在線檢測(cè)。

1.2.3溶氧(Dissolved Oxygen)溶氧電極(瑞士Ingold公司產(chǎn)品CD951-06) 在線檢測(cè)。

1.2.4細(xì)胞光密度(OD600)分析發(fā)酵液稀釋后于波長(zhǎng)600 nm 處以去離子水為對(duì)照進(jìn)行比色測(cè)定，OD600為OD讀數(shù)乘以稀釋倍數(shù)。

1.2.5甘油濃度分析采用高碘酸鈉氧化滴定法[17]分析甘油濃度。

1.2.6甲醇濃度分析氣相色譜(GC)分析[18]甲醇濃度。

1.2.7半定量法測(cè)定HPV 16 L1蛋白含量?jī)龃娴募?xì)胞團(tuán)反復(fù)凍融后,采用玻璃珠機(jī)械破碎法,取裂解液上清進(jìn)行 SDS-PAGE 電泳[19],同時(shí)用已知濃度的HPV 16 VLPs作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白、未經(jīng)甲醇誘導(dǎo)的細(xì)胞裂解液上清作為陰性對(duì)照,蛋白marker作為參照,western blotting蛋白泳道中分別用字母S、N、M表示。電泳結(jié)束后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜,一抗采用HPV16 L1 單克隆抗體(Purified Mouse Anti-L1 protein of human papillome virus,BD),二抗采用堿性磷酸酶標(biāo)記羊抗小鼠抗體(Goat anti-Mouse IgG(H+L) Human serum Adsorbed,MILLIPORE,USA)。利用ECL顯色試劑顯色后,使用chemi Doc XRC (Bio-Rad,USA) 設(shè)備凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行拍照并通過(guò)檢測(cè)蛋白條帶的熒光強(qiáng)度,計(jì)算單體蛋白L1的相對(duì)濃度。另外,使用該軟件計(jì)算每一蛋白泳道中,單體蛋白L1占該蛋白泳道所有蛋白的百分比(wL1)作為衡量單體蛋白L1的降解指標(biāo)。

1.2.8HPV 16 VLPs含量測(cè)定(ELISA)將待檢測(cè)樣品用1% BSA稀釋,加入到抗原單抗(SHS004,SIBP),包被酶聯(lián)板微孔中,每孔加樣品100 μL,同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照,用封板膜封板后置37 ℃溫育60 min,去除各孔內(nèi)液體,用洗滌液洗滌,重復(fù)3次,最后一次洗板完成后拍干。每孔加酶結(jié)合物工作液100 μL,用封板膜封板后置37 ℃溫育45 min。去除孔內(nèi)液體,用洗滌液洗滌,重復(fù)5次,最后一次洗板完成后拍干。每孔加底物顯色液A 50 μL,底物顯色液B 50 μL,輕微震蕩混勻后置室溫暗處顯色5～10 min。每孔加終止液 50 μL,輕微混勻。選擇酶標(biāo)儀波長(zhǎng)450 nm,參考波長(zhǎng)630 nm,測(cè)定各孔吸光值(OD)。所得結(jié)果采用lgX-lgY的擬合方式進(jìn)行線性擬合及計(jì)算。

2結(jié)果

2.1pH對(duì)重組畢赤酵母表達(dá)HPV 16 VLPs的影響

當(dāng)15 L發(fā)酵罐菌液OD60達(dá)到280左右時(shí),從發(fā)酵罐中無(wú)菌取出適量發(fā)酵液,分裝于不同的搖瓶,分別用φ=10%稀硫酸和1 mol/L KOH溶液調(diào)節(jié)pH為3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0,每12 h 添加甲醇至終濃度體積分?jǐn)?shù)為0.5%,誘導(dǎo)培養(yǎng)48 h后,對(duì)細(xì)胞光密度和蛋白含量等進(jìn)行分析。

當(dāng)pH=4.5時(shí),單體蛋白L1(55 kDu)表達(dá)量最高,幾乎是pH=7.0條件下表達(dá)量的1.5倍；pH=4.0～4.5 時(shí),單體蛋白L1表達(dá)量穩(wěn)定并明顯高于其他pH條件。顆粒蛋白VLPs含量隨著pH由3.5升至7.0而逐漸降低(圖1和圖2),說(shuō)明pH低至3.5時(shí),最適合胞內(nèi)單體蛋白L1組裝生成VLPs。整體上看,8種pH條件下,細(xì)胞光密度差異較大,pH=4.0時(shí),細(xì)胞濃度達(dá)到最高。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,在生長(zhǎng)和單體表達(dá)階段，通過(guò)控制pH為4.0來(lái)促進(jìn)目的蛋白L1表達(dá)量,通過(guò)改變pH到3.5來(lái)促進(jìn)顆粒蛋白VLPs的組裝,這是最優(yōu)化的pH控制條件。

N—Sample without methanol induction；M—Protein

圖2　pH 對(duì)畢赤酵母生長(zhǎng)和蛋白表達(dá)的影響

2.2不同誘導(dǎo)溫度對(duì)重組畢赤酵母表達(dá)HPV 16 VLPs的影響

為了更好地考察溫度對(duì)HPV 16 VLPs表達(dá)的影響,對(duì)發(fā)酵罐中培養(yǎng)到一定階段的菌液(生長(zhǎng)培養(yǎng)基為BMGY)進(jìn)行離心,重懸于誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，制備濃縮5倍的誘導(dǎo)菌液(誘導(dǎo)培養(yǎng)基為BMMY),然后,分別考察25、28、30 ℃下畢赤酵母HPV 16 VLPs合成表達(dá)的影響，結(jié)果如圖3和圖4所示?？刂萍状俭w積分?jǐn)?shù)為0.5%。3個(gè)誘導(dǎo)溫度培養(yǎng)下,搖瓶?jī)?nèi)菌體濃度差異不顯著,但單體L1的表達(dá)量受溫度的影響顯著,28 ℃培養(yǎng)下,單體L1的產(chǎn)量比25 ℃和30 ℃下分別高出了65%和61%,可見(jiàn)28 ℃對(duì)于細(xì)胞內(nèi)合成L1單體非常有利。但顆粒蛋白VLPs組裝的最適溫度與單體合成的溫度差異明顯,在30 ℃誘導(dǎo)下VLPs的含量最高,分別比25 ℃和28 ℃下高出了45.8%和88.4%?？梢?jiàn),28 ℃有利于單體L1的高水平表達(dá),而30 ℃更利于顆粒蛋白VLPs的組裝。此外,25 ℃和28 ℃溫度下wL1明顯高于30 ℃對(duì)應(yīng)的wL1,可見(jiàn),30 ℃條件下,L1降解較多。

N—Sample without methanol induction;M—Protein marker;S—HPV 16 VLPs

圖4　溫度對(duì)畢赤酵母生長(zhǎng)和蛋白表達(dá)的影響

在發(fā)酵過(guò)程中應(yīng)采取階段性的變溫措施來(lái)獲得最大量的單體和顆粒蛋白VLPs表達(dá)量。發(fā)酵培養(yǎng)時(shí),菌體生長(zhǎng)期溫度應(yīng)控制在30 ℃以利于細(xì)胞生長(zhǎng),提高細(xì)胞濃度;誘導(dǎo)初期,則可以選擇28 ℃加快單體蛋白L1的表達(dá)與積累,誘導(dǎo)后期提高溫度至30 ℃來(lái)高效促進(jìn)VLPs的組裝。

2.3銨離子對(duì)菌體生長(zhǎng)和HPV 16 VLPs表達(dá)的影響

2.3.1概述畢赤酵母菌體生長(zhǎng)和目的蛋白的表達(dá)過(guò)程中,氮源起著非常關(guān)鍵的作用,將30 L發(fā)酵罐中培養(yǎng)到誘導(dǎo)期的一定量菌液無(wú)菌取出，分裝到搖瓶中考察不同誘導(dǎo)時(shí)期和銨離子誘導(dǎo)濃度對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和蛋白表達(dá)的影響,誘導(dǎo)培養(yǎng)分別選擇指數(shù)期細(xì)胞和穩(wěn)定期細(xì)胞。初始銨離子添加濃度見(jiàn)表1。取發(fā)酵罐中相同誘導(dǎo)時(shí)間的發(fā)酵液進(jìn)行對(duì)比分析(G1、G2)。不同初始銨離子濃度下指數(shù)生長(zhǎng)期與穩(wěn)定生長(zhǎng)期啟動(dòng)誘導(dǎo)對(duì)HPV 16 L1表達(dá)的影響如圖5所示。

表1　初始銨離子的添加濃度

2.3.2指數(shù)生長(zhǎng)期控制不同濃度銨離子對(duì)發(fā)酵表達(dá)的影響當(dāng)細(xì)胞光密度OD600達(dá)到280左右時(shí)啟動(dòng)誘導(dǎo)表達(dá),考察不同濃度的銨離子對(duì)表達(dá)的影響。結(jié)果表明,菌體密度差異受銨離子濃度影響不顯著(見(jiàn)圖6),但對(duì)單體蛋白L1的表達(dá)影響較大。當(dāng)銨離子濃度為0.26 mol/L時(shí)最有利于蛋白L1的表達(dá),高于發(fā)酵罐中L1的同期表達(dá)含量(G1)。過(guò)高或過(guò)低的銨離子添加濃度,均不利于單體蛋白L1的表達(dá)(圖5)。原因在于過(guò)低的銨離子濃度下,氮源首先滿足于細(xì)胞生長(zhǎng)的需要,而限制了蛋白L1的表達(dá),在過(guò)低的銨離子濃度下蛋白L1降解比較嚴(yán)重；而過(guò)高的銨離子濃度,同樣也會(huì)抑制蛋白的表達(dá),可能原因是導(dǎo)致競(jìng)爭(zhēng)性抑制,或是過(guò)高的銨離子濃度使得菌體生長(zhǎng)轉(zhuǎn)向初級(jí)代謝,不利于蛋白單體的表達(dá)。由L1濃度變化可以看出,當(dāng)銨離子濃度高于0.30 mol/L時(shí),單體L1降解現(xiàn)象緩解。銨離子濃度同樣也影響單體L1的自組裝。如圖6所示,隨著銨離子濃度增加,蛋白VLPs含量逐步降低。而低濃度的銨離子(小于0.30 mol/L)對(duì)VLPs的組裝影響不大。綜上所述,當(dāng)細(xì)胞處于指數(shù)生長(zhǎng)期時(shí),維持發(fā)酵液中氮元素濃度為0.26～0.30 mol/L,既能促進(jìn)菌體生長(zhǎng),促進(jìn)單體L1表達(dá),還有利于單體L1自組裝形成VLPs。

N10～N14—Exponential phase samples concentration;G1—Synchronous induction samples in fermentation tank as N10～N14;N20～N24—Stable growth period samples;G2—Synchronous induction samples in fermentation tank as N20～N24;M—Protein marker;S—HPV 16 VLPs

圖5不同初始銨離子濃度下指數(shù)生長(zhǎng)期與穩(wěn)定生長(zhǎng)期啟動(dòng)誘導(dǎo)對(duì)HPV 16 L1表達(dá)的影響

Fig.5Effect of ammonium ion concentration on HPV 16 L1 expression at exponential growth phase and stationary phase

圖6指數(shù)生長(zhǎng)期控制銨離子對(duì)HPV 16 L1發(fā)酵的影響

Fig.6Effect of ammonium ion at exponential growth phase on HPV 16 L1 fermentation

2.3.3生長(zhǎng)穩(wěn)定期不同濃度銨離子對(duì)發(fā)酵的影響同樣,在細(xì)胞光密度OD600達(dá)到370左右時(shí)對(duì)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo),并考察不同銨離子濃度對(duì)發(fā)酵的影響,結(jié)果如圖7所示。不同濃度的銨離子對(duì)酵母細(xì)胞生長(zhǎng)影響不大,0.42 mol/L的銨離子濃度下,菌體生長(zhǎng)最佳。0.38 mol/L的銨離子濃度下,單體蛋白L1含量最高,并且,提高銨離子濃度,單體L1降解呈增強(qiáng)趨勢(shì)。銨離子濃度低于0.42 mol/L更有利于單體L1組裝成VLPs,當(dāng)銨離子濃度為0.34 mol/L時(shí)，單體L1組裝成VLPs效果最佳。可以看出,低濃度的銨離子既有利于單體L1積累,減少L1降解,還能促進(jìn)單體L1組裝成VLPs。因此,利用穩(wěn)定期細(xì)胞進(jìn)行畢赤酵母誘導(dǎo)發(fā)酵表達(dá)VLPs時(shí),維持銨離子濃度為0.34～0.42 mol/L,有利于單體L1表達(dá)及組裝。

圖7穩(wěn)定生長(zhǎng)期銨離子對(duì)HPV 16 L1發(fā)酵的影響

Fig.7Effect of ammonium ion at stationary phase on HPV 16 L1 fermentation

2.4油酸對(duì)畢赤酵母發(fā)酵表達(dá)人乳頭瘤病毒病毒樣顆粒的影響

2.4.1概述以AOX1為啟動(dòng)子的畢赤酵母發(fā)酵過(guò)程添加油酸(oleic acid)可以誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生過(guò)氧化物酶體(Peroxisome),影響甲醇代謝途徑,提高外源蛋白的產(chǎn)量。本實(shí)驗(yàn)考察了誘導(dǎo)初期和誘導(dǎo)中期添加不同濃度的油酸對(duì)單體L1表達(dá)和VLPs組裝的影響如圖8所示。初始油酸添加的體積分?jǐn)?shù)分別為1%、5%、20%、33.3%。取發(fā)酵罐中相同誘導(dǎo)時(shí)間的發(fā)酵液進(jìn)行對(duì)比分析(G1、G2)。

Y10～Y14—Initial induction phase samples,volume fractions of oleic acid added are 0,1%,5%,20%,33.3%,respectively;G1—Synchronous induction samples in fermentation tank as Y10～Y14;Y20～Y24—Mid-induction phase samples volume fraction of oleic acid added are 0,1%,5%,20%,33.3%,respectively;G2—Synchronous induction samples in fermentation tank as Y20～Y24;M—Protein marker;S—HPV 16 VLPs;N—Sample without methanol induction

圖8油酸添加量對(duì)HPV 16 L1發(fā)酵的影響

Fig.8Effect of addition of oleic acid on HPV 16 L1 production

2.4.2誘導(dǎo)初期添加油酸對(duì)發(fā)酵影響當(dāng)細(xì)胞光密度達(dá)到220左右時(shí),對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行誘導(dǎo),并添加油酸。結(jié)果表明(圖9),添加油酸能促進(jìn)畢赤酵母菌體生長(zhǎng),其中體積分?jǐn)?shù)為20%的油酸效果最佳,提高約10.8%。但與空白對(duì)照組相比,添加油酸的實(shí)驗(yàn)組單體L1含量明顯偏低。如圖9所示油酸體積分?jǐn)?shù)越高,單體L1含量越低,添加體積分?jǐn)?shù)為33.3%油酸的實(shí)驗(yàn)組幾乎無(wú)單體L1產(chǎn)生?？梢?jiàn),誘導(dǎo)初期,添加油酸對(duì)單體L1的表達(dá)具有嚴(yán)重的抑制作用。

φ(Oleic acid):1—0;2—1%;3—5%;4—20%;5—33.3%

2.4.3誘導(dǎo)中期添加油酸對(duì)發(fā)酵影響當(dāng)發(fā)酵罐誘導(dǎo)培養(yǎng)22 h時(shí),取出發(fā)酵液適量分裝于不同的搖瓶,添加油酸，結(jié)果如圖10所示。油酸對(duì)菌體生長(zhǎng)具有明顯的促進(jìn)作用,其中油酸體積分?jǐn)?shù)為20%時(shí)效果最佳。單體蛋白L1的含量在油酸的作用下,呈遞增趨勢(shì),在體積分?jǐn)?shù)為33.3%的油酸作用下單體蛋白L1的含量最高,明顯高于發(fā)酵罐中L1含量。而VLPs的含量隨著油酸濃度的增加,呈上升趨勢(shì),體積分?jǐn)?shù)為5%的油酸對(duì)應(yīng)的VLPs含量最高,油酸體積分?jǐn)?shù)高于5%,則VLPs含量明顯降低。加入油酸后,wL1有所增加,體積分?jǐn)?shù)為5%的油酸對(duì)應(yīng)的實(shí)驗(yàn)組中,單體降解現(xiàn)象最弱?？梢?jiàn),體積分?jǐn)?shù)為5%的油酸有利于單體自組裝形成VLPs,高濃度的油酸主要作用于單體VLPs解聚,可能原因是添加的油酸改變了發(fā)酵液內(nèi)環(huán)境,促進(jìn)VLPs解聚。

φ(Oleic acid):1—0;2—1%;3—5%;4—20%;5—33.3%

3結(jié)論

本文以工業(yè)上適合畢赤酵母高密度培養(yǎng)的全合成培養(yǎng)基為基礎(chǔ),考察了誘導(dǎo)過(guò)程中誘導(dǎo)溫度、pH,以及添加不同濃度的銨離子、油酸等因素對(duì)重組畢赤酵母發(fā)酵表達(dá)HPV 16 L1以及組裝形成HPV 16 VLPs的影響。

結(jié)果表明酸性環(huán)境比較有利于蛋白表達(dá)以及組裝,誘導(dǎo)過(guò)程維持pH=4.0左右最佳。28 ℃下單體表達(dá)量較高,而30 ℃培養(yǎng)條件下,顆粒蛋白VLPs較高。誘導(dǎo)過(guò)程中添加一些營(yíng)養(yǎng)元素能有效提高蛋白表達(dá)量。對(duì)指數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng),維持發(fā)酵液中銨離子濃度0.26～0.30 mol/L,既能促進(jìn)菌體生長(zhǎng)和單體L1表達(dá),還有利于單體L1自組裝形成VLPs。對(duì)穩(wěn)定生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng),維持銨離子濃度在0.34～0.42 mol/L,有利于單體L1表達(dá)及組裝。分別在誘導(dǎo)初期和誘導(dǎo)中期添加油酸,初期添加油酸嚴(yán)重抑制單體蛋白L1的表達(dá),而誘導(dǎo)中期添加體積分?jǐn)?shù)為5%的油酸可有效促進(jìn)單體自組裝,并防止單體降解,高濃度的油酸則促進(jìn)VLPs解聚。

總而言之,HPV 16 L1的表達(dá)條件和組裝條件不同。在發(fā)酵生產(chǎn)中,可根據(jù)實(shí)際情況科學(xué)處理好單體HPV L1與VLPs的關(guān)系,最大限度地提高HPV 16 VLPs的產(chǎn)量。本實(shí)驗(yàn)優(yōu)化的條件可以作為發(fā)酵罐上發(fā)酵培養(yǎng)HPV 16 VLPs的基礎(chǔ)。

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Optimization of Culture Conditions for Expression of Human Papillomavirus Virus-Like Particles by Recombinant Pichia pastoris

ZHAO Jing1,WANG Ze-jian1,GUO Mei-jin1,CHU Ju1,ZHANG Si-liang1,LOU Jue-ren2

(1.State Key Laboratory of Bioreactor Engineering,East China University of Science and Technology,Shanghai 200237,China; 2.Shanghai Institute of Biological Products Co. Ltd,Shanghai 200052,China)

Abstract:The recombinant Pichia pastoris GS115/HPV16L1 (muts) fermentation conditions for human papillomavirus the virus-like particles (HPV VLPs) were optimized.Based on the defined shaking flask medium,effects of pH of the culture medium,temperature,ammonium sulfate,and oleic acid were investigated during the induction period in human papillomavirus virus-like particles fermentation.The results showed that the monomeric protein L1 expression conditions were remarkably different from the conditions for assembly.During HPV L1 fermentation process,the optimized conditions for L1 expression are those:pH=4.5,temperature 28 ℃,and ammonium ion concentration 0.26-0.30 mol/L at the exponential growth phase.However,for VLPs production,the culture conditions are as follows:pH=3.5,temperature 30 ℃,and the ammonium ion concentration 0.34-0.42 mol/L controlled at the exponential phase.In addition,the monomer L1 expression was inhibited with the addition of oleic acid at the initial induction period.Oleic acid (φ=5%) could promote the monomer L1 self assembly at the middle induction phase.The relationship between the intracellular monomer L1 expression and its self assembly can be applied for the expression of the human papillomavirus virus-like particles by recombinant Pichia pastoris in industrial production.

Key words:recombinant Pichia pastoris; human papillomavirus virus-like particles; culture condition optimization; self assembly

收稿日期：2015-08-25

基金項(xiàng)目：國(guó)家“863”計(jì)劃(2012AA02A401);衛(wèi)生部“重大新藥創(chuàng)制”(2013ZS09402302-220)

作者簡(jiǎn)介：趙晶(1988-),女,安徽蚌埠人，碩士生,研究方向?yàn)槲⑸锇l(fā)酵。E-mail:zjww1510@163.com 通信聯(lián)系人：張嗣良,E-mail:siliangz@ecust.edu.cn

文章編號(hào)：1006-3080(2016)02-0180-07

DOI:10.14135/j.cnki.1006-3080.2016.02.005

中圖分類號(hào)：Q815

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A