巫金娜黃莉文

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姜黃素對(duì)HIV-1 gp120多肽誘導(dǎo)的大鼠神經(jīng)元HSP70 mRNA表達(dá)的影響*

巫金娜①黃莉文①

【摘要】目的：初步闡明姜黃素對(duì)HIV-1 gp120多肽誘導(dǎo)的大鼠神經(jīng)元HSP70 mRNA表達(dá)的影響。方法：采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)HIV-1 gp120多肽誘導(dǎo)大鼠神經(jīng)元凋亡情況；采用實(shí)時(shí)定量PCR（Realtime PCR）檢測(cè)熱休克蛋白70（HSP70）的表達(dá)情況，分析姜黃素對(duì)大鼠神經(jīng)元HSP70 mRNA的影響。結(jié)果：HIV-1 gp120多肽可誘導(dǎo)大鼠神經(jīng)元凋亡。姜黃素可緩解HIV-1 gp120 V3區(qū)多肽誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡。HIV-1 gp120多肽可降低大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元HSP70 mRNA的表達(dá)。姜黃素能提高大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元HSP70 mRNA表達(dá)，減輕HIV-1 gp120多肽誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡。結(jié)論：姜黃素可調(diào)節(jié)HSP70 mRNA表達(dá)，減輕HIV-1 gp120多肽誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡。

【關(guān)鍵詞】姜黃素； 人類免疫缺陷病毒1型； 糖蛋白120； 熱休克蛋白70； 細(xì)胞凋亡

①?gòu)V州醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院 廣東 廣州 510140

20世紀(jì)80年代，首例獲得性免疫缺陷綜合癥（AIDS）病例被報(bào)道。AIDS由人類免疫缺陷病毒1型（HIV-1）所致，病毒可通過(guò)其包膜糖蛋白gp120，引發(fā)中樞神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞功能障礙［1-2］，進(jìn)而導(dǎo)致神經(jīng)退行性病變或神經(jīng)認(rèn)知障礙。但HIV-1導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的具體機(jī)制仍不清楚。雖然高效抗逆轉(zhuǎn)錄病毒療法（HAART）有效地降低了艾滋病患者的死亡率和全身性機(jī)會(huì)性感染的發(fā)生率，但由于血腦屏障的存在，抗病毒藥物很難進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)。因此迫切需要開(kāi)發(fā)新的抗HIV-1腦病的藥物。熱休克蛋白70（HSP70）是一個(gè)分子量為70kDa的熱休克蛋白應(yīng)激誘導(dǎo)分子，研究發(fā)現(xiàn)，HSP70對(duì)神經(jīng)變性疾病具有神經(jīng)保護(hù)功能［4］。姜黃素是從草本植物姜黃根莖中提取的疏水多酚，能改善HIV-1 gp120引起的記憶障礙［5］。在本研究中，我們旨在闡明姜黃素對(duì)HIV-1 gp120多肽誘導(dǎo)的大鼠神經(jīng)元HSP70 mRNA表達(dá)的影響。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SD大鼠30只用于取大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元［License No.SCXK（yue）（2006-0015）］購(gòu)自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。其中正常組5只、對(duì)照組5只、模型組5只、0.5 μg/mL多肽組5只、1 μg/mL多肽組5只、0.5 μg/mL姜黃素處理組5只、1 μg/mL姜黃素處理組5只，所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)行協(xié)議均通過(guò)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)方法 原代大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元均參照早前的報(bào)道研究［6］，并做了輕微的調(diào)整。具體為：處死大鼠，將新鮮皮質(zhì)組織分為約1 mm的切片，放置在15 mL離心管（D-Hanks 溶液與0.25%胰蛋白酶體積比為2∶1）中，37 ℃消化10 min，離心5 min，懸浮沉淀，過(guò)篩，將神經(jīng)元接種在6孔培養(yǎng)板（含聚-L-賴氨酸）上，37 ℃，5% CO2培養(yǎng)4 h，更換含2% B27的neurobasal培養(yǎng)基（Life Technologies-Gibco，Grand Island，NY，USA）培養(yǎng)，以確保神經(jīng)元構(gòu)成大于95%。

1.3多肽序列及合成 多肽序列：Asn-Asn-Thr-Arg-Lys-Ser-Ile-Arg-Ile-Gln-Arg-Gly-Pro-Gly-Arg-Ala-Phe-Val-Thr-Ile-Gly-Lys-Ile-Gly（分子式：C114H199N41O31；分子量：2，640.06），由上海生工合成。

1.4細(xì)胞凋亡分析 采用FITC標(biāo)記的膜聯(lián)蛋白V 和PI法分析細(xì)胞凋亡情況。HIV-1 gp120 V3區(qū)多肽成功誘導(dǎo)大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元凋亡后，將大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元與終濃度為0.5 μg/mL及1 μg/mL的姜黃素分別共同孵育。首先將大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元接種在6孔板，5 d后加入HIV-1 gp120多肽（0.5μg/mL、1μg/mL）處理48 h，用預(yù)冷PBS洗滌細(xì)胞，用1X結(jié)合緩沖液懸浮細(xì)胞。將懸浮液轉(zhuǎn)移到含有FITC膜聯(lián)蛋白V和PI的培養(yǎng)管中，輕輕渦旋并孵育15 min；加入1X結(jié)合緩沖液。利用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡情況。隨后，分別沉默及過(guò)表達(dá)大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元HSP70基因，觀察姜黃素對(duì)HIV-1 gp120多肽所致大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元凋亡率的影響。

1.5構(gòu)建腺病毒載體 按照以往方法進(jìn)行［7］。利用Adeasy系統(tǒng)，將HSP70連接到pShuttle載體上，用T4連接酶連接；感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化，涂平板（卡拉霉素），37 ℃過(guò)夜。挑取30個(gè)克隆，提取DNA并用PacI篩選，瓊脂糖電泳（0.8%），并測(cè)序鑒定。

1.6實(shí)時(shí)定量PCR 提取細(xì)胞RNA，并逆轉(zhuǎn)錄至cDNA。所有試劑均自ABI（Applied Biosystems）。所得產(chǎn)物保存于4 ℃。利用使用說(shuō)明書優(yōu)化Realtime PCR反應(yīng)條件。采用ABI 7500 Real-time PCR儀進(jìn)行反應(yīng)。數(shù)值由2Ct（calibrator）-Ct （test）計(jì)算得出。利用Real-time PCR檢測(cè)gp120多肽處理的大鼠皮層神經(jīng)元中HSP70 mRNA的表達(dá)情況，分析姜黃素對(duì)大鼠皮層神經(jīng)元HSP70的影響。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用PEMS 3.1統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以（±s）表示，比較采用t檢驗(yàn)或方差分析，計(jì)數(shù)資料以百分比表示，比較采用 X2檢驗(yàn)，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1HIV-1 gp120多肽對(duì)大鼠皮層神經(jīng)元的作用 采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)HIV-1 gp120多肽所致的神經(jīng)元凋亡率可發(fā)現(xiàn)，經(jīng)（0.5 μg/mL及1 μg/mL）多肽處理后，神經(jīng)元凋亡比例為17.4%（圖1），HIV-1 gp120多肽可誘導(dǎo)大鼠皮層神經(jīng)元凋亡。

圖1　HIV-1 gp120多肽誘導(dǎo)大鼠皮層神經(jīng)元凋亡

2.2HIV-1 gp120多肽對(duì)大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元HSP70 mRNA表達(dá)的影響 采用Real-time PCR檢測(cè)HIV-1 gp120多肽處理的大鼠皮層神經(jīng)元中HSP70 mRNA的表達(dá)情況發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，0.5 μg/mL多肽組的HSP70 mRNA表達(dá)水平為（0.56±0.06），而1 μg/mL多肽組HSP70 mRNA表達(dá)水平為（0.38±0.03），多肽處理可下調(diào)大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元HSP70 mRNA表達(dá)。

2.3姜黃素對(duì)大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元HSP70 mRNA表達(dá)的影響 采用Real-time PCR分析姜黃素對(duì)大鼠皮層神經(jīng)元HSP70 mRNA的影響發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元經(jīng)不同濃度的姜黃素（0.5 μg/mL及1 μg/mL）處理后，HSP70 mRNA表達(dá)顯著提高，分別為（1.59±0.16）、（2.38±0.23），姜黃素可以增加HSP70 mRNA表達(dá)。

2.4姜黃素對(duì)HIV-1 gp120多肽誘導(dǎo)的大鼠皮層神經(jīng)元的影響 與模型組相比，0.5 μg/mL姜黃素處理組HSP70 mRNA的表達(dá)為（1.18±0.13），1 μg/mL 姜黃素處理組HSP70 mRNA的表達(dá)為（1.22±0.15）；姜黃素可以增加大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元中HSP70 mRNA的表達(dá)。與HIV-1 gp120多肽處理組對(duì)比，沉默HSP70基因后，0.5 μg/mL姜黃素處理組cleaved caspase-3 mRNA表達(dá)為（1.16±0.15），1 μg/mL姜黃素處理組表達(dá)為（1.23±0.13）；姜黃素處理組中凋亡特異性蛋白cleaved caspase-3 mRNA表達(dá)更高。

3　討論

研究表明，HIV-1可致神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙，其重要特征是神經(jīng)元凋亡［8］。HIV-1包膜糖蛋白HIV-1 gp120能夠在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)出類似HIV-1相關(guān)性癡呆患者的神經(jīng)病理變化［9］。此外，HIV-1 gp120可通過(guò)caspase-3途徑，產(chǎn)生神經(jīng)毒性［10］。HSP70是分子量為70kDa的具有較高的神經(jīng)保護(hù)能力熱休克蛋白［11］。研究結(jié)果表明，在神經(jīng)退行性疾病帕金森綜合癥中，HSP70可作為分子伴侶產(chǎn)生神經(jīng)保護(hù)作用［12］。并且，HSP70能調(diào)節(jié)Apaf-1和AIF信號(hào)通路，減輕并抑制原代皮質(zhì)神經(jīng)元和SH-SY5Y細(xì)胞凋亡［13］。姜黃素是從姜科、天南星科的植物根莖中提取的一種能夠穿過(guò)血腦屏障化學(xué)物質(zhì)［14］。以往的研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素與HIV-1核苷酸序列的長(zhǎng)末端重復(fù)序列（LTR）結(jié)合，抑制后者活性。姜黃素還可抑制HIV-1復(fù)制所需的蛋白酶、整合酶以及與HAD相關(guān)的一些細(xì)胞因子（TNF-α，IL-1β等）以及一氧化氮、自由基等［15］。

本研究表明，HIV-1 gp120多肽可降低HSP70 mRNA表達(dá)。姜黃素可調(diào)節(jié)HSP70 mRNA表達(dá)，降低HIV-1 gp120多肽所致的大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元凋亡。這些結(jié)果表明，姜黃素可通過(guò)調(diào)節(jié)HSP70 mRNA表達(dá)情況，降低大腦皮質(zhì)神經(jīng)元凋亡率。這使姜黃素有望開(kāi)發(fā)成為新的治療HIV相關(guān)性癡呆的藥物。但由于HIV-1相關(guān)性腦病的復(fù)雜性，姜黃素對(duì)HIV-1相關(guān)性腦病的干預(yù)作用仍需進(jìn)行大規(guī)模的實(shí)驗(yàn)來(lái)證實(shí)。

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doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2016.11.008

*基金項(xiàng)目：廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)技術(shù)研究基金項(xiàng)目（A2015335）

通信作者：巫金娜

收稿日期：（2015-12-08） （本文編輯：蔡元元）