陳萬(wàn)勇　張文韜　周晨浩　沈英皓　劉彬彬　任　寧

(復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院肝外科　上海　200032)

CSMD1基因rs1613815基因型與肝細(xì)胞肝癌臨床病理特征的關(guān)系

陳萬(wàn)勇▲張文韜▲周晨浩沈英皓劉彬彬任寧△

(復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院肝外科上海200032)

【摘要】目的 探討肝細(xì)胞肝癌患者中CSMD1基因rs1613815基因型與臨床病理特征的關(guān)系。 方法選取2009年1—7月復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院肝外科收治的經(jīng)病理確診的肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)患者146例,收集患者的臨床和病理資料。根據(jù)我們前期預(yù)實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果,采用美國(guó)Sequenom公司建立的MassARRAY檢測(cè)平臺(tái)分析CSMD1基因rs1613815位點(diǎn)的各種基因型,回顧性分析其與HCC患者臨床病理資料的關(guān)系。Kaplan-Meier法和COX回歸模型用于評(píng)估其預(yù)后價(jià)值。 結(jié)果在146例HCC標(biāo)本中,rs1613815位點(diǎn)AA、AC和CC基因型分別有33例、49例和64例。其中在中晚期HCC患者中,攜帶AC/CC基因型的患者其癌栓(含肉眼癌栓和鏡下癌栓)發(fā)生率明顯高于攜帶AA基因型的患者(70.6%vs.36.4%),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.039);攜帶AC/CC基因型的患者處于T2-4N0M0期的比例明顯高于攜帶AA基因型的患者(59.8%vs.31.2%),差異同樣具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.004)。而在年齡、性別、HbsAg、腫瘤直徑和數(shù)目及血清甲胎蛋白(alpha-fetoprotion,AFP)水平等分組中,AC/CC基因型和AA基因型所占的比例之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。在腫瘤直徑≥5 cm的患者中,攜帶AA基因型的患者術(shù)后總生存率和無(wú)瘤生存率明顯高于攜帶AC/CC基因型的患者(P值分別為0.023和0.005)。 結(jié)論CSMD1基因rs1613815 多態(tài)性與肝細(xì)胞肝癌患者的癌栓形成和TNM分期較晚密切相關(guān),提示其具有較高的轉(zhuǎn)移潛能和不良預(yù)后。

【關(guān)鍵詞】肝細(xì)胞肝癌;CSMD1基因;單核苷酸多態(tài)性;轉(zhuǎn)移

肝細(xì)胞肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是人類(lèi)最常見(jiàn)且預(yù)后差的惡性腫瘤之一,嚴(yán)重威脅著人類(lèi)的生存,即使外科手術(shù)切除,其術(shù)后轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)率依然很高。根據(jù)最新發(fā)布的全球癌癥統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示,2012年全球肝癌新發(fā)病例數(shù)超過(guò)78萬(wàn)人,而死亡病例數(shù)則接近75萬(wàn)人[1]。盡管人們已明確HCC的發(fā)生與慢性肝炎、肝硬化、長(zhǎng)期酗酒等因素有關(guān),但其分子發(fā)病機(jī)制尚不明確[2]。

單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism,SNP)是不同個(gè)體DNA序列上單個(gè)堿基的差異,是人類(lèi)可遺傳變異中最常見(jiàn)的一種,人類(lèi)染色體上平均每1000個(gè)堿基對(duì)中就會(huì)出現(xiàn)1個(gè)SNP。最新的研究顯示SNP不僅與腫瘤的遺傳易感性、腫瘤的預(yù)后有關(guān)[3],甚至還與化療藥物作用的個(gè)體敏感性和耐藥性密切相關(guān)[4-5]。而在肝癌研究中也有相關(guān)報(bào)道[6-7]。我們前期研究發(fā)現(xiàn)位于OPN啟動(dòng)子區(qū)域的-433等位基因及其相關(guān)的單體型(Ht2,Ht3)SNP能夠作為HCC的特異性預(yù)測(cè)指標(biāo)。其Ht2以及-443TT基因型通過(guò)增加OPN啟動(dòng)子活性并促進(jìn)表達(dá),從而加速HCC腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和肺部轉(zhuǎn)移[8]。同樣,位于HTPAP啟動(dòng)子區(qū)域的SNP中,啟動(dòng)子I單體型啟動(dòng)子較啟動(dòng)子Ⅱ和啟動(dòng)子Ⅲ單體型啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性顯著增強(qiáng),可導(dǎo)致不同水平的基因轉(zhuǎn)錄,統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示啟動(dòng)子Ⅱ+啟動(dòng)子Ⅲ單體型是HCC術(shù)后復(fù)發(fā)的獨(dú)立相關(guān)因子[9]。這些研究均證實(shí)關(guān)鍵基因的SNP及其單體型可影響HCC轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)。因此,揭示SNP與腫瘤發(fā)生和發(fā)展的關(guān)系、探索與腫瘤臨床表型相關(guān)的基因型(genotype)并將其作為分子標(biāo)志應(yīng)用于腫瘤防治是研究熱點(diǎn)。

CSMD1 (CUB and Sushi multiple domains 1) 基因是2001年被發(fā)現(xiàn)的候選抑癌基因，位于8p23.2,大小超過(guò)2 Mb,含有72個(gè)外顯子,編碼一種含14個(gè)CUB結(jié)構(gòu)域和28個(gè)Sushi結(jié)構(gòu)域的跨膜蛋白(即CSMD1蛋白)。其中CUB結(jié)構(gòu)域位于細(xì)胞外,由氨基酸殘基組成,其結(jié)構(gòu)與免疫球蛋白的β-桶狀結(jié)構(gòu)相似,參與機(jī)體的發(fā)育過(guò)程;Sushi結(jié)構(gòu)域又稱補(bǔ)體調(diào)控蛋白功能結(jié)構(gòu)域或短的共有序列重復(fù)(short consensus repeats,SCR),廣泛存在于補(bǔ)體和黏著蛋白中。現(xiàn)已證實(shí),CSMD1基因在腦、視網(wǎng)膜、睪丸及胎兒肝臟和脾臟等人體組織和器官均有不同程度的表達(dá)。目前,CSMD1基因異常與多種疾病的發(fā)生存在著密切的關(guān)系,如精神分裂癥、自閉癥、高血壓、結(jié)直腸癌等[10-13]。

根據(jù)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果,本研究擬采用美國(guó)Sequenom公司建立的Massarray檢測(cè)平臺(tái)分析收集的HCC樣本檢測(cè)候選抑癌基因CSMD1基因rs1613815位點(diǎn)的不同基因型,回顧性分析各基因型在不同臨床表型之間分布頻率的差異,進(jìn)而探討該位點(diǎn)多態(tài)性作為預(yù)測(cè)HCC疾病進(jìn)展的可能性。

材 料 和 方 法

研究對(duì)象及篩選標(biāo)準(zhǔn)選取2009年1月至2009年7月復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院肝外科收治的經(jīng)病理確診的HCC患者146例,收集患者的臨床資料和隨訪資料用于本研究的回顧性分析。TNM分期采用2010年國(guó)際抗癌聯(lián)盟(UICC)/美國(guó)癌癥聯(lián)合委員會(huì)(AJCC)制定的TNM分期標(biāo)準(zhǔn)。本研究經(jīng)復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，所有研究對(duì)象均簽署知情同意書(shū)。

入選標(biāo)準(zhǔn):原發(fā)性肝癌患者;術(shù)前肝功能Child A級(jí)或Child B級(jí)且并未接受任何治療;腫瘤均由根治性手術(shù)切除,切緣陰性無(wú)殘癌;術(shù)后病理證實(shí)為HCC。

排除標(biāo)準(zhǔn):轉(zhuǎn)移性肝癌患者;術(shù)前肝功能Child C級(jí)或術(shù)前接受TACE、射頻、PEI等治療;術(shù)后病理提示膽管細(xì)胞癌、混合細(xì)胞癌等非肝細(xì)胞肝癌。

主要試劑和儀器QIAamp DNA mini kit試劑盒(德國(guó)Qiagen公司),GeneAmp P9700型PCR儀(美國(guó)ABI公司),iPLEXTMReagent Kit(美國(guó)Sequenom 公司),PCR 擴(kuò)增引物、單堿基延伸引物由深圳華大基因公司合成,芯片點(diǎn)樣采用韓國(guó)三星公司提供的MassARRAYTMNanodispenser點(diǎn)樣儀,MassARRAY 時(shí)間飛行質(zhì)譜生物芯片系統(tǒng)(美國(guó)Sequenom 公司),HotStarTaq DNA聚合酶(1000 U)(包括4×250 units HotStarTaq DNA聚合酶,10×PCR緩沖液,25 mmol/L MgCl2,德國(guó)Qiagen公司),dNTP混合物(TaKaRa公司)。

DNA提取嚴(yán)格按照QIAamp DNA mini kit試劑盒說(shuō)明書(shū)提取癌組織DNA。在提取 DNA 后,取 DNA 樣品1 μL,用NanoDrop 2000(Thermo公司,美國(guó))檢測(cè) DNA 濃度和純度。若吸光度D260/D280達(dá)到1.8～2.0,則認(rèn)為該DNA 純度合格。隨后將合格的DNA提取物置于-80 ℃冰箱備用。

引物設(shè)計(jì)和合成應(yīng)用Sequenom公司Genotyping Tools及MassARRAY Assay Design 軟件設(shè)計(jì)CSMD1基因rs1613815位點(diǎn)的PCR擴(kuò)增引物及單堿基延伸引物。其中,正向引物:5′-ACGTTGGATGCACAGCTACACATGAAGACC-3′;反向引物:5′-ACGTTGGATGCACTCTTA-TTTTCCAGGAAG-3′;單堿基延伸引物:5′-CGTTTGATTCTAATCCTGGACC-3′,正反引物和單堿基延伸引物均由深圳華大基因公司合成和純化。

PCR 擴(kuò)增和SAP純化PCR擴(kuò)增反應(yīng)按照5.0 μL體系進(jìn)行,其中包含模板DNA1.0 μL,上下游引物1.0 μL,2.5 mmol/L dNTP 1μL,5 U/μL Hotstar Taq 0.1 μL,10×PCR緩沖液0.625 μL,25 mmol/L MgCl20.325 μL,剩余體積用純化水補(bǔ)足。反應(yīng)條件嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。反應(yīng)產(chǎn)物4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

PCR反應(yīng)產(chǎn)物用SAP處理,以便去除體系中剩余的dNTP。反應(yīng)體系總體積為7 μL,其中包括PCR擴(kuò)增反應(yīng)的產(chǎn)物5 μL,10 × SAP緩沖液0.17 μL,1 U/μL SAP酶0.3 μL,剩余體積純化水補(bǔ)足。反應(yīng)條件嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。反應(yīng)產(chǎn)物4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

單堿基延伸反應(yīng)反應(yīng)體系包含經(jīng)SAP處理后的PCR產(chǎn)物7 μL,各延伸反應(yīng)的引物混合物0.804 μL,iPLEX酶0.041 μL,延伸終止混合物0.2 μL,10×iPLEX 緩沖液0.2 μL以及純化水0.755 μL,使得總體積達(dá)到9 μL。反應(yīng)條件嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。反應(yīng)產(chǎn)物4 ℃保存。

芯片點(diǎn)樣、質(zhì)譜檢測(cè)及結(jié)果輸出每個(gè)延伸反應(yīng)產(chǎn)物用6 mg Clean Resin純化,隨后將純化后的產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到表面覆蓋基質(zhì)的SpectroCHIP 芯片上,采用 MassARRAY 時(shí)間飛行質(zhì)譜生物芯片系統(tǒng)對(duì)CSMD1基因 SNP 位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè),通過(guò)TYPER 4.0 軟件分型并輸出結(jié)果。

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行分析,各基因型在癌栓和無(wú)癌栓組之間、T1N0M0期和T2-4N0M0期之間和其他臨床病理資料之間的頻率分布比較利用χ2檢驗(yàn),必要時(shí)采用Fisher′s精確檢驗(yàn),并計(jì)算比值比(odds ratios,OR)及其95%CI來(lái)表示該基因型與該因素的關(guān)聯(lián)強(qiáng)度。采用Kaplan-Meier法和Log-rank檢驗(yàn)繪制生存曲線,計(jì)算并比較兩組生存率差異。COX回歸模型用于評(píng)估各臨床病理資料、rs1613815基因型與HCC預(yù)后的關(guān)系。所有統(tǒng)計(jì)分析均為雙側(cè)檢驗(yàn),P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

HCC患者臨床病理資料本研究按照篩選標(biāo)準(zhǔn)共收集146例HCC患者,包括男性125例(85.6%)和女性21例(14.4%),平均年齡為(52.9±11.0)歲。82.2%的患者乙肝陽(yáng)性。平均最大腫瘤直徑為(5.54±3.49)cm,血清AFP平均值為4743.8 ng/mL(平均AFP值對(duì)數(shù)值為2.04±1.39)。僅2例患者存在肝門(mén)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,其余均為N0M0。按照UICC制定的分期標(biāo)準(zhǔn),腫瘤I期67例(45.9%),Ⅱ期31例(21.2%),Ⅲa和Ⅲb期共46例(31.5%),Ⅳ期2例(1.4%)。130例(89.0%)有肝硬化,105例為單發(fā)病例。

CSMD1基因rs1613815位點(diǎn)基因分型結(jié)果采用美國(guó)Sequenom公司建立的Massarray檢測(cè)平臺(tái)分析,根據(jù)本次研究的146例HCC樣本基因分型的結(jié)果顯示(圖1),CSMD1基因rs1613815位點(diǎn)存在AA、AC和CC 3種基因型,其中AA基因型有33例、AC基因型有49例、CC基因型有64例。

Using the MassARRAY system,3 genetypes were detected in rs1613815,which included AA genetype (A),AC genetype (B) and CC genetype (C).

圖1rs1613815位點(diǎn)MassARRAY檢測(cè)結(jié)果

Fig 1Results of MassARRAY detection for rs1613815

CSMD1基因rs1613815基因型與HCC癌栓的關(guān)聯(lián)分析在146例HCC標(biāo)本中,52例有癌栓(包括肉眼癌栓和鏡下癌栓),94例無(wú)癌栓。由于處于I期的67例患者無(wú)癌栓分布,為排除腫瘤分期對(duì)癌栓分布的影響,本研究擬分析中晚期(Ⅱ～Ⅳ期)肝癌中rs1613815多態(tài)性與腫瘤癌栓的關(guān)系,其中CSMD1基因rs1613815各基因型分布及其頻率如表1所示。結(jié)果發(fā)現(xiàn),若以AA基因型為參照,在68例攜帶非AA基因型的患者中,48例有癌栓,其癌栓發(fā)生率為70.6%,而在11例攜帶AA基因型的患者中,僅4例發(fā)生癌栓(36.4%),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.039)。這提示攜帶非AA基因型的患者,其癌栓發(fā)生率要明顯高于攜帶AA基因型的患者。

表1　rs1613815不同基因型與中晚期HCC患者癌栓

aFisher′s exact test.

CSMD1基因rs1613815基因型與HCC TNM分期的關(guān)聯(lián)分析根據(jù)2010年UICC制定的HCC TNM分期標(biāo)準(zhǔn),處于T1N0M0期的患者有67例,處于T2-4N0M0期的患者有77例,另有2例存在肝門(mén)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,為T(mén)3N1M0。若同樣以AA基因型為參照,結(jié)果發(fā)現(xiàn)非AA基因型在T2-4N0M0組中的頻率顯著高于T1N0M0組中的頻率(59.8%vs.31.2%,P=0.004)。進(jìn)一步的比值比(OR)顯示,攜帶非AA基因型的患者其出現(xiàn)病灶分期較晚的風(fēng)險(xiǎn)是攜帶AA基因型患者的3.276倍,95%CI為1.418～7.569,表明該基因型與TNM分期、尤其是T分期密切相關(guān)(表2)。

CSMD1基因rs1613815基因型與腫瘤直徑、數(shù)目等臨床病理資料的關(guān)聯(lián)分析若按年齡(<50歲或≥50歲)、性別(男性或女性)、HbsAg感染(陰性或陽(yáng)性)、術(shù)前甲胎蛋白(alpha-fetoprotein,AFP)水平(<20 ng/mL或≥20 ng/mL)、肝硬化(無(wú)或有)、腫瘤數(shù)目(單個(gè)或多個(gè))、大小(<5 cm或≥5 cm)和分化(I+Ⅱ或Ⅲ+Ⅳ)等可能影響HCC預(yù)后的因素進(jìn)行分組,分別比較不同分組之間AA基因型和非AA基因型之間分布頻率差異。結(jié)果發(fā)現(xiàn)差異并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表3)。這提示CSMD1基因rs1613815基因型與年齡、性別、HbsAg感染、AFP水平、肝硬化、腫瘤數(shù)目、大小和分化等臨床病理特征無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)性。

表2　rs1613815不同基因型與HCC患者TNM分期的關(guān)聯(lián)分析

表3　rs1613815不同基因型與其他臨床病理資料的關(guān)聯(lián)分析

CSMD1基因rs1613815基因型與HCC預(yù)后的關(guān)系隨訪到2015年4月,在納入研究的146例HCC患者中,17例患者失訪,失訪率為11.6%。在剩余129例中,AA、AC和CC基因型分別有29例、43例和57例。Kaplan-Meier生存曲線分析顯示,攜帶AA基因型的患者術(shù)后中位總生存期(overall survival,OS)為46.4個(gè)月,稍低于攜帶AC/CC基因型的患者(中位OS為47.9個(gè)月),差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.921)(圖2A);同樣,攜帶AA基因型患者與攜帶AC/CC基因型患者之間無(wú)復(fù)發(fā)中位無(wú)瘤生存期(recurrence free survival,RFS)亦無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(中位RFS分別為42.9和36.8個(gè)月,P=0.310)(圖2B),提示CSMD1基因rs1613815位點(diǎn)多態(tài)性與HCC患者生存期無(wú)相關(guān)性。

多因素COX回歸分析顯示HBV感染、腫瘤大小和癌栓是影響患者OS的獨(dú)立預(yù)測(cè)指標(biāo);而AFP水平、腫瘤數(shù)目和大小、癌栓是影響患者RFS的獨(dú)立預(yù)測(cè)指標(biāo)(表4)。隨后,為明確rs1613815多態(tài)性與臨床復(fù)發(fā)的關(guān)系,并排除其他相關(guān)因素(AFP水平、腫瘤數(shù)目和大小)造成的干擾。我們?cè)诮y(tǒng)一這些因素的情況下做進(jìn)一步的結(jié)合分析(joint analysis)。結(jié)果如表5所示,在腫瘤≥5 cm的HCC患者中,AA基因型和AC/CC基因型之間OS或RFS差異顯著,并在Kaplan-Meier分析中也得到相似的結(jié)果(圖3)。

No significant differences was found in OS (A) or RFS (B) between the AA group (n=29) and the AC/CC group (n=100).

圖2　攜帶AA基因型和攜帶AC/CC基因型患者Kaplan-Meier生存曲線分析

表5　rs1613815基因型與HCC患者AFP水平、腫瘤大小和數(shù)目的交互作用分析

HR：Hazard ratio.aAdjusted by age,gender,HBV,AFP level,cirrhosis,tumor number,tumor size,thrombi status,TNM stage or differentiation,where appropriate.

The AA group (n=13) had a significantly higher overall survival rate(A) or recurrence-free survival rate(B) than the AC/CC (n=49) group (thePwas 0.023 and 0.005,respectively).

圖3腫瘤直徑≥ 5 cm患者攜帶AA基因型和攜帶AC/CC基因型的Kaplan-Meier生存曲線分析

Fig 3The Kaplan-Meier analysis of carrying AA and AC/CC genotypes in patients with tumor size ≥ 5 cm

討論

在HCC發(fā)生、發(fā)展的過(guò)程中,遺傳因素起著極其重要的作用。隨著基因組學(xué)及分子生物學(xué)技術(shù)的不斷深入和改進(jìn),人們已從宏觀的疾病發(fā)生發(fā)展過(guò)程逐步轉(zhuǎn)變?yōu)樵谖⒂^與分子水平上研究疾病的進(jìn)展,逐漸把目光轉(zhuǎn)向與肝癌轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)相關(guān)分子的研究。目前研究顯示肝癌的遺傳因素主要由SNP等所導(dǎo)致,這些多態(tài)性廣泛存在于抑癌基因、轉(zhuǎn)錄因子、生長(zhǎng)因子,甚至于細(xì)胞代謝通路中。缺氧誘導(dǎo)因子 (hypoxia-inducible factor,HIF-1) 是介導(dǎo)細(xì)胞對(duì)缺氧微環(huán)境產(chǎn)生適應(yīng)性反應(yīng)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子,其活性或表達(dá)對(duì)維持腫瘤細(xì)胞物質(zhì)代謝、增殖和轉(zhuǎn)移具有重要意義。Guo等[14]在研究HIF1α基因的3個(gè)SNP位點(diǎn)時(shí)發(fā)現(xiàn),rs2057482 CC基因型的患者較CT+TT基因型的患者復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)高、預(yù)后差。功能學(xué)實(shí)驗(yàn)表明,攜帶CC基因型的患者,其HIF1A表達(dá)明顯高于CT+TT基因型的患者(P=0.014)。這提示CC基因型通過(guò)改變HIF1A的表達(dá)水平,增強(qiáng)其活性,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移,加劇HCC患者的預(yù)后。而Yoshiya等[15]則在研究上皮生長(zhǎng)因子(epidermal growth factor,EGF)基因5′UTR區(qū)單核苷酸多態(tài)性(rs4444903)在HCV感染所致的HCC作用時(shí)發(fā)現(xiàn),AA組中血清EGF顯著低于攜帶AG+GG組(P=0.02),預(yù)后分析則提示AA組患者術(shù)后RFS明顯高于AG+GG組。三羧酸循環(huán)(TCA循環(huán))是細(xì)胞三大物質(zhì)(糖類(lèi)、脂肪和蛋白質(zhì))代謝的最終通路,也是能量代謝的重要途徑,而該通路關(guān)鍵位點(diǎn)的編碼基因突變將引起TCA循環(huán)功能障礙。如Wan等[16]在研究三羧酸循環(huán)中3個(gè)關(guān)鍵酶(SDH、FH、IDH)基因的SNP時(shí),成功篩選出7個(gè)SNPs與HCC的預(yù)后(尤其是RFS)密切相關(guān),且進(jìn)一步推測(cè)SDHD基因rs10789859位點(diǎn)是HCC總體復(fù)發(fā)的起始危險(xiǎn)因素,SDHD基因rs3935401位點(diǎn)是HCC總體生存的起始危險(xiǎn)因素?？傊?這些研究表明SNP在HCC中普遍存在,通過(guò)引起目的基因突變或致其表達(dá)缺失,降低其活性或作用,最終影響HCC轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)。

我們前期研究發(fā)現(xiàn)肝癌轉(zhuǎn)移灶中染色體8p缺失率明顯高于其相應(yīng)的原發(fā)瘤,提示染色體8p缺失與肝癌轉(zhuǎn)移有關(guān)[17-18]。而在臨床上發(fā)現(xiàn),外周血DNA 染色體8p上D8S258位點(diǎn)的等位基因失衡(allelic imbalance,AI)與HCC腫瘤分化、TNM分期、血管侵犯、3年無(wú)瘤生存率和3年總體生存率密切相關(guān)[19]。我們推測(cè)8p可能含有一個(gè)或多個(gè)在肝癌進(jìn)展尤其是在腫瘤轉(zhuǎn)移中起重要作用的腫瘤抑制基因。隨后在對(duì)HCC進(jìn)行全基因組檢測(cè)時(shí)發(fā)現(xiàn),位于8p區(qū)域上的新抑癌基因CSMD1基因上共有8個(gè)位點(diǎn)存在SNP(rs1613815、rs10092638、rs2049304、rs8180892、rs1523259、rs10107710、rs17515、rs4875793)。通過(guò)對(duì)比癌栓組和無(wú)癌栓組中各個(gè)SNP不同基因型之間是否存在差異時(shí)發(fā)現(xiàn),僅rs1613815 AA基因型和非AA基因型(包括AC和CC基因型)在癌栓組和無(wú)癌栓組之間存在顯著差異,顯示其具有較高的轉(zhuǎn)移潛能。為驗(yàn)證這一點(diǎn),我們通過(guò)MassARRAY質(zhì)譜SNP分型技術(shù)檢測(cè)選取的HCC標(biāo)本中CSMD1基因rs1613815基因型,回顧性分析不同基因型與癌栓的關(guān)系。結(jié)果顯示攜帶非AA基因型的患者,其癌栓發(fā)生幾率明顯高于攜帶AA基因型的患者,這與前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。隨后的生存分析并未提示其與腫瘤預(yù)后的密切相關(guān)性。而進(jìn)一步的結(jié)合分析顯示僅在≥5 cm的腫瘤中,非AA基因型患者術(shù)后中位RFS和OS(分別為22.5和33.3個(gè)月)顯著低于AA基因型患者(分別為50.8和53.3個(gè)月),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值分別為0.005和0.023)。這提示,該位點(diǎn)多態(tài)性尚不能準(zhǔn)確用于預(yù)測(cè)HCC患者術(shù)后情況。而通過(guò)多基因多位點(diǎn)的聯(lián)合檢測(cè)或許才能夠彌補(bǔ)單基因單位點(diǎn)在腫瘤預(yù)后預(yù)測(cè)中的不足。

目前關(guān)于CSMD1基因在癌癥中的研究已有諸多報(bào)道。Ma等[20]等發(fā)現(xiàn)CSMD1基因的缺失在頭頸部鱗狀細(xì)胞癌(head and neck squamous cell carcinom,HNSCC)、乳腺癌、肺癌中是一種常見(jiàn)的現(xiàn)象。而早在20世紀(jì)90年代,學(xué)者們就已經(jīng)注意到HNSCC中染色體8p23易發(fā)生等位基因的缺失和純合性缺失,且該缺失與HNSCC的發(fā)生和預(yù)后有著密切的關(guān)系[21-22]。Richter等[23]則進(jìn)一步通過(guò)對(duì)20個(gè)HNSCC細(xì)胞系中CSMD1基因的表達(dá)水平的檢測(cè)發(fā)現(xiàn),只有1個(gè)細(xì)胞系中存在CSMD1基因結(jié)構(gòu)正常的轉(zhuǎn)錄子,其余細(xì)胞系均發(fā)生外顯子缺失、轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)或終止異常,從而導(dǎo)致其功能異常。而Kamal等[24]揭示CSMD1在細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)中表達(dá),且在乳腺癌中的表達(dá)低于正常組織。追溯到Tang 等[25]也發(fā)現(xiàn)CSMD1基因在A375細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中有表達(dá),而且與正常的皮膚細(xì)胞相比,在黑色素瘤細(xì)胞中較低,這可能與選擇性剪接CSMD1基因編碼分泌蛋白有關(guān)。但同時(shí)他指出CSMD1基因在正常組織中的表達(dá)比腫瘤組織更高,表明CSMD1基因與腫瘤的分級(jí)和預(yù)后相關(guān)。此外,Zhang等[26]通過(guò)結(jié)直腸癌研究CSMD家族的3個(gè)基因CSMD1、CSMD2和CSMD3的表達(dá)產(chǎn)物時(shí)發(fā)現(xiàn),與配對(duì)的正常組織相比,這3個(gè)基因的表達(dá)產(chǎn)物均明顯降低,且低表達(dá)的CSMD2和CSMD3蛋白與腫瘤分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤大小密切相關(guān)。而CSMD1和CSMD2則與臨床預(yù)后相關(guān)。這些研究均表明,CSMD1基因在癌癥的發(fā)生、發(fā)展、淋巴結(jié)侵襲、腫瘤分化,甚至預(yù)后等多個(gè)癌癥進(jìn)程中起著非常重要的作用。而有關(guān)CSMD1基因多態(tài)性的研究則相對(duì)少見(jiàn),且主要集中在非腫瘤疾病中。如Donohoe等[10]通過(guò)研究CSMD1 rs10503253多態(tài)性對(duì)精神分裂癥的神經(jīng)性認(rèn)知反應(yīng)時(shí)發(fā)現(xiàn),攜帶A等位基因的患者在語(yǔ)言智商、語(yǔ)言情景記憶能力和空間工作記憶能力方面均較攜帶其他等位基因的患者表現(xiàn)差。這說(shuō)明攜帶A等位基因可能惡化患者的神經(jīng)性認(rèn)知反應(yīng),進(jìn)而加重精神分裂癥的癥狀。Koiliari等[27]則進(jìn)一步指出認(rèn)知反應(yīng)的程度與A等位基因呈劑量效應(yīng),其中攜帶AA基因型患者的認(rèn)知反應(yīng)程度最差,相反攜帶CC基因型患者的認(rèn)知反應(yīng)最好。

目前并未見(jiàn)CSMD1基因諸如rs1613815等任何位點(diǎn)的多態(tài)性與HCC易感性及進(jìn)展預(yù)后等方面的報(bào)道,而且有關(guān)CSMD1基因突變或表達(dá)異常在HCC中的研究亦不多。目前的研究?jī)H指出腫瘤組織CSMD1基因的表達(dá)要明顯低于正常肝組織。Zhu等[28]通過(guò)免疫組化染色發(fā)現(xiàn),HCC組織中CSMD1的陽(yáng)性率僅為27.3%,遠(yuǎn)低于癌前病變?cè)錾Y(jié)節(jié)(dysplastic nodules,DN)和腫瘤周?chē)谓M織(陽(yáng)性率分別為75%和82%)。Midorikawa等[29]則利用GIM分析觀察到在68例顯性HCC中有3例存在8p23.2缺失,他指出8p23.2雜合性丟失只發(fā)生于晚期肝細(xì)胞肝癌,且CSMD1基因的表達(dá)與第一個(gè)外顯子的甲基化無(wú)關(guān),反映出CSMD1基因促進(jìn)了肝癌的發(fā)展。但CSMD1基因如何導(dǎo)致HCC發(fā)生發(fā)展的確切機(jī)制尚不清楚。目前研究主要傾向于通過(guò)激活Smad通路發(fā)揮其抑癌活性。一方面,CSMD1與Smad3相互作用導(dǎo)致其磷酸化。而磷酸化后的p-Smad3則促進(jìn)Smad2的磷酸化以及Smad2/3/4復(fù)合物的形成。另一方面,CSMD1基因也可直接引起Smad1/5/8復(fù)合物磷酸化。隨后,磷酸化后的產(chǎn)物p-Smad1/5/8與Smad4相互作用并被激活。最終,通過(guò)兩條途徑將信號(hào)轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi),進(jìn)而調(diào)節(jié)目的基因的轉(zhuǎn)錄[25]。

盡管已經(jīng)充分認(rèn)識(shí)到SNP在基因組結(jié)構(gòu)和腫瘤中的作用,但在腫瘤復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移中的作用研究依然很少。目前SNP分析主要用于檢驗(yàn)?zāi)撤N疾病和某個(gè)特定SNP等位位點(diǎn)在一定群體中的出現(xiàn)頻率是否存在相關(guān)性,而這種相關(guān)可能是風(fēng)險(xiǎn)位點(diǎn)與臨近的多態(tài)性標(biāo)記間存在連鎖不平衡的結(jié)果。由于目前的研究大多局限于一個(gè)或幾個(gè)多態(tài)性位點(diǎn),不可避免地帶有盲目性和偶然性。因而這種局限性、盲目性的視角難以窺探腫瘤進(jìn)展的全部面貌。而且由于腫瘤異質(zhì)性的存在,局部的腫塊研究同樣難以反映整體的全部特性,這也就解釋了為什么大多數(shù)研究結(jié)果依然停留在實(shí)驗(yàn)階段,而不能被應(yīng)用于臨床實(shí)踐中。

綜上所述,本研究首次探討CSMD1基因rs1613815基因型的SNP與HCC臨床病理特征的關(guān)系,結(jié)果表明,該位點(diǎn)AC/CC基因型與HCC的癌栓發(fā)生和TNM分期密切相關(guān),提示其具有較高的侵襲轉(zhuǎn)移能力和較差的腫瘤分期,這或許為臨床上判斷HCC患者癌栓形成及其疾病進(jìn)展帶來(lái)一定的價(jià)值和意義。然而本研究也同時(shí)注意到該位點(diǎn)多態(tài)性并不能準(zhǔn)確用于HCC預(yù)后的評(píng)價(jià),僅對(duì)腫瘤直徑≥5 cm的HCC患者有一定的預(yù)測(cè)價(jià)值。因此我們期望通過(guò)后續(xù)研究尋找多基因多位點(diǎn)的聯(lián)合檢測(cè)模式以用于肝癌轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的臨床預(yù)測(cè),促進(jìn)肝癌的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制研究及個(gè)體化治療。

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Association of rs1613815 genotypes in CSMD1 gene with clinicopathological parameters of hepatocellular carcinoma

CHEN Wan-yong▲, ZHANG Wen-tao▲, ZHOU Chen-hao, SHEN Ying-hao, LIU Bin-bin, REN Ning△

(DepartmentofLiverSurgery,ZhongshanHospital,FudanUniversity,Shanghai200032,China)

【Abstract】ObjectiveTo investigate the relationship between rs1613815 genotypes in CSMD1 gene with clinicopathological parameters of hepatocellular carcinoma (HCC) patients.MethodsFrom Jan.to Jul. in 2009,146 pathologically confirmed HCC patients were enrolled from Department of Liver Surgery,Zhongshan Hospital,Fudan University.We collected the clinical and pathological data.The polymorphism of CSMD1 gene (rs1613815) was detected by USA Sequenom MassARRAY.According to the results of our previous pre-experiment,the relationship between different genotypes of rs1613815 and clinicopathological parameters of those HCC patients was analyzed retrospectively.Kaplan-Meier method and Cox regression model were used to estimate clinical outcomes.ResultsIn the 146 cases of HCC,we found 33 cases carrying AA genotype,49 carrying AC genotype and 64 carrying CC genotype in rs1613815.In mid-advanced HCC patients,the incidence rate of tumor thrombi (including macroscopic and microscopic thrombi) in those patients carrying AC/CC genotype was apparently higher than those carrying AA genotype (70.6%vs.36.4%),and the difference was statistically significant (P=0.039).Meanwhile,the ratio of carring AC/CC genotype patients in T2-4N0M0 was also significantly higher than those carrying AA genotype (59.8%vs.31.2%,P=0.004).No significant difference was found between AC/CC and AA genotype in age,gender,HbsAg,tumor size and number,serum alpha-fetoprotein(AFP) level and other clinicopathological parameters (P>0.05).In patients with tumor size ≥5 cm,the AA group had a significantly higher overall survival rate or recurrence-free survival rate than the AC/CC group (the P value was 0.023 and 0.005,respectively).ConclusionsCSMD1 rs1613815 polymorphisms were positively correlated with tumor thrombi status and advanced TNM-stage of HCC,which indicated that it had a high potential of metastasis and poor prognosis.

【Key words】hepatocellular carcinoma;CSMD1 gene;single nucleotide polymorphism;metastasis

【中圖分類(lèi)號(hào)】R735.7

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

doi:10.3969/j.issn.1672-8467.2016.03.001

(收稿日期:2016-01-13;編輯:張秀峰)

國(guó)家自然科學(xué)基金(81472672);上海市科技啟明星跟蹤計(jì)劃(13QH1401000)

▲Co-first authors

△Corresponding authorE-mail:renning@fudan.edu.cn

*This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (81472672) and Shanghai Municipal Science and Technology Star Tracking Program (13QH1401000) .