郭占領(lǐng)　李娟娟　楊　青,2△

(1復旦大學生命科學學院生物化學系　上海　200438;2云南天然產(chǎn)物與生物制藥協(xié)同創(chuàng)新中心　昆明　650091)

鼠源吲哚胺2,3-雙加氧酶活性檢測方法的建立

郭占領(lǐng)1李娟娟1楊青1,2△

(1復旦大學生命科學學院生物化學系上海200438;2云南天然產(chǎn)物與生物制藥協(xié)同創(chuàng)新中心昆明650091)

【摘要】目的建立鼠源吲哚胺2,3-雙加氧酶 (mouse indoleamine 2,3-dioxygenase,mIDO) 活性檢測方法。方法利用基因工程方法表達純化重組mIDO (recombinant mIDO,rmIDO),建立酶水平mIDO活性檢測體系;構(gòu)建過表達mIDO的小鼠Lewis肺癌 (Lewis lung cancer,LLC) 細胞株,建立細胞水平mIDO活性檢測體系。比較L-1-甲基色氨酸 (L-1-methyl tryptophan,L-1-MT) 在酶及細胞水平上對mIDO及人源IDO (human IDO,hIDO)的抑制作用,測定抑制類型、抑制常數(shù)Ki值及半數(shù)抑制濃度 (IC50) 值。 結(jié)果L-1-MT對mIDO和hIDO均有抑制作用,抑制類型及抑制常數(shù)Ki值相似,但IC50值在酶水平及細胞水平上均有差異。 結(jié)論mIDO酶活性檢測體系是篩選IDO抑制劑的有效工具,與hIDO酶活性檢測體系聯(lián)用,能反映種屬差異,可更好地利用小鼠模型來替代人類進行IDO抑制劑治療疾病的研究。

【關(guān)鍵詞】吲哚胺2,3-雙加氧酶;鼠源;人源;活性檢測體系;L-1-甲基色氨酸

吲哚胺2,3-雙加氧酶 (indoleamine 2,3-dioxygenase,IDO)是哺乳動物中催化色氨酸沿著犬尿氨酸途徑 (kynurenine pathway) 代謝的第一個限速酶[1],也是細胞內(nèi)一種含亞鐵血紅素的單體胞質(zhì)蛋白酶,最早被發(fā)現(xiàn)于1967年[2],廣泛分布于人和動物的細胞和組織中[3]。人源IDO (human IDO,hIDO)蛋白由403個氨基酸組成,相對分子質(zhì)量(Mr)為45 324[4],鼠源IDO (mouse IDO,mIDO)蛋白由407個氨基酸組成,Mr為45 639,通過序列比對發(fā)現(xiàn),mIDO與hIDO有62%的同源一致性[5]。mIDO與hIDO具有相似的催化色氨酸代謝的生化功能,二級結(jié)構(gòu)特征基本相似,但也存在差異,尤其是α-螺旋部分,它們在對不同底物的選擇性、pH耐受性以及抑制劑的抑制效力上也有差異[6]。

IDO的活性或表達的異常升高,與人類一些重大疾病有著密切關(guān)系[7]。IDO已被證實是阿爾茨海默病[8]、抑郁癥、癌癥等疾病治療藥物的研發(fā)靶標[9],篩選獲得高效的IDO抑制劑可為上述疾病的治療提供有效方案。L-1-甲基色氨酸 (L-1-methyl tryptophan,L-1-MT) 是發(fā)現(xiàn)較早、與底物色氨酸結(jié)構(gòu)最接近的競爭性IDO抑制劑,也是公認的研究比較透徹的IDO抑制劑[10-11]。目前廣泛應(yīng)用小鼠模型替代人類進行疾病及藥物研究。近年來在IDO抑制劑作為抗腫瘤候選藥物的研究中,小鼠模型更是占有主導地位[12-14]。因此在IDO抑制劑篩選時,有必要同時考查化合物對mIDO和hIDO的抑制作用,以便建立mIDO與hIDO活性檢測體系之間的相關(guān)性,使小鼠模型的數(shù)據(jù)更好地應(yīng)用到人類疾病治療的研究中。

本研究克隆表達純化重組mIDO (recombinant mIDO,rmIDO),結(jié)合實驗室已有的重組hIDO (recombinant hIDO,rhIDO)[15],分別建立酶及細胞水平上不同種源IDO的活性檢測體系,以評價L-1-MT對不同種源IDO酶的抑制作用,并尋找兩種酶活性檢測體系之間的相關(guān)性,旨在探索mIDO與hIDO在酶動力學上的關(guān)系。

材 料 和 方 法

試劑和藥品L-1-MT、異丙基-β-D硫代半乳糖苷 (IPTG) (美國Sigma-Aldrich 公司);L-色氨酸、對二氨基苯甲醛、亞甲基藍 (日本W(wǎng)ako公司);過氧化氫酶、5-氨基乙酰丙酸鹽酸鹽 (5-ALA)、苯甲基磺酰氟 (PMSF) (上海阿拉丁生化科技股份有限公司);PrimeSTAR Max DNA聚合酶 (日本Takara公司);NovoRec?PCR一步定向克隆試劑盒 (上海近岸蛋白質(zhì)科技有限公司);DMEM培養(yǎng)基、0.25%胰蛋白酶 (美國Gibco公司);HyClone胎牛血清、Lipofectamine 2000 (美國Thermo Fisher公司);PVDF膜 (美國Millipore公司);mIDO cDNA (美國GE公司)。

設(shè)備和儀器高速離心機、超低溫冰箱、Forma系列CO2培養(yǎng)箱、Multiskan MK3型酶標儀 (美國 Thermo Fisher公司);SW-CJ系列標準型潔凈工作臺 (蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司);倒置顯微鏡 (日本Olympus公司);凝膠成像儀 (上海分析儀器總廠);PCR儀、轉(zhuǎn)膜儀 (美國Bio-Rad公司);BG-垂直電泳儀、BG-水平電泳儀 (北京百晶生物技術(shù)有限公司)。

重組質(zhì)粒的構(gòu)建利用NovoRec重組酶構(gòu)建質(zhì)粒,根據(jù)其操作技術(shù)手冊設(shè)計PCR引物。引物包括5’端不少于15 bp與載體同源的序列以及20～25 bp目的片段特異性序列,使得到的目的片段兩端有不少于15 bp的序列與線性化載體兩端一致,引物序列及酶切位點信息見表1。

以mIDO cDNA為PCR模板,利用PrimeSTAR Max DNA聚合酶進行PCR反應(yīng)，獲得目的片段,反應(yīng)條件:98 ℃預變性3 min;98 ℃、10 s,55 ℃、12 s,72 ℃、1 min,28個循環(huán);72 ℃延伸10 min。PCR擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳鑒定,利用膠回收試劑盒回收擴增片段。用NcoI、XhoI雙酶切載體質(zhì)粒pET28a (+),用KpnI、EcoRI雙酶切載體質(zhì)粒pcDNA3.1 (+),并回收線性化片段。

表1　PCR引物序列

Underlined with solid lines:The endonuclease site sequence; Underlined with wavy line:The Kozak sequence.

將目的DNA片段與線性化載體片段依照3∶1～10∶1的摩爾比加入PCR管中并加入NovoRec重組酶及緩沖液,混勻后在37 ℃水浴中反應(yīng)20 min,結(jié)束后立刻將重組反應(yīng)液轉(zhuǎn)化到大腸埃希菌DH5α感受態(tài)細胞中,37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中過夜,次日挑取平板上中等大小克隆在含抗生素的LB培養(yǎng)基中擴增,抽提質(zhì)粒,進行雙酶切驗證,并將鑒定正確的陽性克隆送至蘇州金唯智生物科技有限公司測序。

rmIDO蛋白的表達mIDO蛋白的表達參照Austin等[16]關(guān)于hIDO蛋白表達的研究進行。將測序驗證正確的重組質(zhì)粒pET28a (+)-mIDO轉(zhuǎn)化到大腸埃希菌BL21 (DE3)感受態(tài)細胞中,從轉(zhuǎn)化平板上隨機挑取單克隆于含有50μg/mL卡那霉素的100 mL LB細菌培養(yǎng)基中,過夜培養(yǎng)。將100 mL培養(yǎng)物加入到同樣的 900 mL LB 培養(yǎng)基中,37 ℃孵育至菌液密度在600 nm處的吸光度(D)值達到 0.6 時將溫度降至室溫并加入5-ALA溶液,再加入終濃度為 0.5 mmol/L的IPTG,室溫誘導表達過夜。4 ℃下5 400×g離心20 min收集菌體,再用20 mL預冷的PBS(含1 mmol/L PMSF)重懸菌體,同樣條件離心,將收集的菌體凍存在-80 ℃待用(保存至多1個月)或進行下一步的純化。

rmIDO蛋白的純化用適量預冷的PBS (含1 mmol/L PMSF) 重懸菌體,超聲破碎;4 ℃下13 800×g離心20 min,取上清。預先用含10 mmol/L咪唑的磷酸鹽緩沖液 (20 mmol/L,pH=7.4,含150 mmol/L NaCl)平衡5 mL預裝Ni-NTA親和層析柱 (美國GE Healthcare 公司),將上清流經(jīng)柱體蛋白掛柱后,分別用10個柱體積的含20 mmol/L咪唑和40 mmol/L咪唑的磷酸鹽緩沖液洗去非特異性結(jié)合的雜蛋白,再用洗脫緩沖液 (含250 mmol/L咪唑的磷酸鹽緩沖液)洗脫下rmIDO蛋白。將得到的蛋白用超濾離心管 (美國Millipore公司)濃縮純化,采用Sephadex G-25脫鹽柱 (美國GE Healthcare公司)和50 mmol/L 磷酸鉀緩沖液 (pH=6.5),得到純化的rmIDO蛋白。純化后的蛋白用SDS-PAGE電泳分離并用考馬斯亮藍G-250染色,然后脫色檢測。

酶水平mIDO活性檢測mIDO活性檢測體系在Takikawa等[17]的研究基礎(chǔ)上改進優(yōu)化而來,500μL標準反應(yīng)體系中含有50 mmol/L的磷酸鉀緩沖液 (pH=6.5)、40 mmol/L抗壞血酸、200μg/mL過氧化氫酶、20μmol/L亞甲基藍、底物L-色氨酸和IDO酶及待測樣品。將該反應(yīng)體系混勻后置于37 ℃水浴中孵育30 min,加入200μL質(zhì)量濃度為30%的三氯乙酸溶液終止反應(yīng),在65 ℃水浴中加熱15 min后,反應(yīng)液于13 800×g離心5 min。取100μL上清與等體積質(zhì)量濃度為2%的對二氨基苯甲醛的冰乙酸溶液混合,充分混勻后用酶標儀檢測犬尿氨酸產(chǎn)生的黃色在492 nm處的吸光度(D)值。

抑制類型及Ki及IC50值測定在上述反應(yīng)體系中加入200μmol/L抑制劑和不同濃度梯度的rmIDO,對照組只加不同濃度梯度的酶而未加抑制劑,處理方法同上。最后以反應(yīng)速度對酶濃度作圖,根據(jù)所得兩條曲線的對應(yīng)關(guān)系判定抑制劑的抑制類型。抑制劑的IC50值及抑制常數(shù)Ki值的測定同樣利用上述反應(yīng)體系,加入不同濃度的底物,在一個底物濃度下加入不同濃度的抑制劑,其他處理方法同上。最后以抑制率對抑制劑濃度作圖,利用改良寇氏法計算出IC50值,以Dixon作圖法[18]得到Ki值。

LLC細胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染LLC細胞株購自中國科學院細胞庫 (TCM 7),采用含有10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將細胞吹打均勻傳代于6孔板里,待細胞生長至80%～90%融合時進行轉(zhuǎn)染。按照Lipofectamine 2000的說明書進行操作,并稍作改良:吸棄含血清培養(yǎng)基并用PBS洗滌細胞2次,每孔加入1 500μL無血清培養(yǎng)基。質(zhì)粒pcDNA3.1 (+)-mIDO和脂質(zhì)體(每孔2.5 ng質(zhì)粒和5μL脂質(zhì)體)分別加入到預裝有125μL Opti-MEM培養(yǎng)基的EP管中并輕輕吹打混勻,5 min后將兩者混合,室溫孵育20 min后逐滴均勻加入待轉(zhuǎn)染細胞培養(yǎng)液中,37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培育4～6 h后換成含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基,培養(yǎng)24 h后收集細胞行Western blot檢測IDO蛋白的表達。

細胞水平mIDO活性檢測將轉(zhuǎn)染pcDNA3.1 (+)-mIDO質(zhì)粒培養(yǎng)24 h后的LLC細胞以2.0×104/孔的密度種植于96孔板里,加入待測藥物,每孔200μL培養(yǎng)基,孵育12 h后,取150μL上清加入另一塊96孔板中,并加入50μL質(zhì)量濃度為30%的三氯乙酸,65 ℃加熱15 min,13 800 × g 離心5 min。取100μL上清與等體積質(zhì)量濃度為2%的對二氨基苯甲醛的冰乙酸溶液混合,充分混勻后用酶標儀檢測犬尿氨酸產(chǎn)生的黃色在492 nm處的吸光度(D)值。

Western blot檢測提取細胞總蛋白,經(jīng)BCA法測定蛋白質(zhì)濃度。取等量蛋白樣品及蛋白標準品點樣進行SDS-PAGE電泳,電泳結(jié)束后將PAGE膠中的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印到PVDF膜上,5%脫脂牛奶常溫封閉2 h。加入抗鼠IDO一抗 (1∶200)、GAPDH一抗 (1∶2 000),4 ℃孵育過夜,經(jīng)PBST (含0.3% Tween-20的PBS溶液)溶液洗膜3次,每次10 min,然后加入相應(yīng)的二抗 (1∶1 000)室溫緩慢震蕩1 h,PBST洗膜后用化學發(fā)光試劑盒顯色,并對mIDO的表達進行檢測。

hIDO的酶及細胞水平活性檢測方法hIDO的表達純化、過表達細胞株的構(gòu)建、酶及細胞水平活性檢測方法等實驗步驟參照文獻[15],抑制類型及Ki值、IC50值測定等實驗步驟參照文獻[19]。

結(jié)果

重組質(zhì)粒的鑒定mIDO的蛋白質(zhì)編碼區(qū)大小為1 224 bp,將重組質(zhì)粒雙酶切驗證,分別用NcoI、XhoI雙酶切重組質(zhì)粒pET28a (+)-mIDO,用KpnI、EcoRI雙酶切重組質(zhì)粒pcDNA3.1 (+)-mIDO,酶切產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳檢測,發(fā)現(xiàn)在1 200 bp左右出現(xiàn)DNA條帶 (圖1),測序結(jié)果經(jīng)比對軟件分析,重組質(zhì)粒中的基因序列完全正確,酶切、測序結(jié)果表明兩重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

M:DNA marker; Lane 1:pET28a (+)-mIDO (NcoI+XhoI ); Lane 2:pcDNA3.1 (+)-mIDO (KpnI+EcoRI ).

圖1重組質(zhì)粒pET28a (+)-mIDO和pcDNA3.1 (+)-

mIDO的酶切驗證

Fig 1Restriction endonuclease analysis of recombinant

plasmid pET28a (+)-mIDO and pcDNA3.1 (+)-mIDO

mIDO蛋白的表達純化誘導后超聲破菌的上清及經(jīng)過Ni-NTA親和層析柱純化的蛋白質(zhì)均通過SDS-PAGE分析 (圖2),在Mr約45 000處可見到特異的目的蛋白條帶,與文獻[16]的報道一致,而未誘導的重組菌、未掛柱蛋白、20 mmol/L咪唑及40 mmol/L咪唑洗脫蛋白則無此條帶。使用BandScan軟件分析目的條帶的純度為91.2%。誘導前后的蛋白經(jīng)過Western blot檢測進一步驗證為mIDO蛋白(圖3),為下一步的酶水平mIDO活性檢測提供了依據(jù)。1 L大腸埃希菌發(fā)酵液可獲得10 mg純化的rmIDO蛋白,比活力為136μmoL·h-1·mg-1。

M:Protein molecular weight marker; Lane 1:Protein before induction; Lane 2:Protein after induction; Lane 3:Soluble lysate protein; Lane 4:Protein of no specific combination with Ni-NTA chelating column; Lane 5:Protein eluted at 20 mmol/L imidazole; Lane 6:Protein eluted at 40 mmol/L imidazole; Lane 7:Protein eluted at 250 mmol/L imidazole.

圖2表達純化rmIDO蛋白的SDS-PAGE分析

Fig 2SDS-PAGE analysis of purified rmIDO protein

Lane 1:Total protein before induction,no expression of mIDO; Lane 2:Total protein after induction,notable expression of mIDO.

圖3IPTG誘導前后rmIDO蛋白的表達

Fig 3Expression of rmIDO protein before and

after IPTG induction

過表達mIDO的LLC細胞株鑒定LLC細胞轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pcDNA3.1 (+)-mIDO,培養(yǎng)24 h,提取總蛋白,進行Western blot檢測 (圖4)。轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pcDNA3.1 (+)-mIDO的LLC細胞中有mIDO蛋白表達,且表達量很高,但未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒及轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒pcDNA3.1 (+)的LLC細胞中無mIDO蛋白表達。獨立實驗重復3次,結(jié)果均一致,為下一步細胞水平mIDO酶活性檢測提供了依據(jù)。

Lane 1:LLC cells without plasmid transfection;Lane 2:LCC cells transfected pcDNA3.1(+);Lane 3:LLC cells transfected recombinant plasmid pcDNA3.1(+)-mIDO.

圖4轉(zhuǎn)染pcDNA3.1 (+)-mIDO的LLC

細胞中mIDO蛋白的表達

Fig 4Expression of mIDO protein in pcDNA3.1 (+)-

mIDO transfected LLC cells

L-1-MT對mIDO和hIDO的抑制類型、Ki及IC50值固定L-1-MT的濃度為200μmol/L,與不同濃度梯度的IDO酶反應(yīng)并測定速度,對照組不加L-1-MT,最終以反應(yīng)速度對酶濃度作圖(圖5A),根據(jù)曲線的特征可以判定L-1-MT為IDO的可逆抑制劑。根據(jù)IDO活性檢測體系,在一個底物濃度下加入不同濃度的抑制劑,以抑制率對抑制劑濃度作圖(圖5B),利用改良寇氏法計算出L-1-MT對IDO酶的IC50值,并改變不同的底物濃度,以Dixon作圖法作圖(圖5C),得到L-1-MT對IDO酶的Ki值。利用過表達IDO的細胞株測定L-1-MT在細胞水平對IDO的抑制活性,以抑制率對抑制劑濃度作圖(圖5D),并計算出IC50值。L-1-MT對不同種源IDO的抑制類型、ki IC50值的檢測結(jié)果見表2。

討論

本實驗成功構(gòu)建了mIDO的重組表達載體pET28a (+)-mIDO,表達純化得到的rmIDO蛋白由SDS-PAGE及Western blot驗證。利用建立的酶活性檢測體系檢測L-1-MT在酶水平對mIDO和hIDO酶的抑制效果,發(fā)現(xiàn)L-1-MT對兩種酶的抑制類型一致,均為可逆競爭性抑制,抑制常數(shù)Ki值也很接近 (對rmIDO的Ki值為29.73μmol/L,對rhIDO的Ki值為32.97μmol/L),但IC50值存在一定差異。L-1-MT對mIDO和hIDO的IC50值分別為362.67和438.74 μmol/L,說明相較hIDO，L-1-MT對mIDO的抑制效力更強。本實驗還構(gòu)建了利用mIDO的真核生物表達載體pcDNA3.1 (+)-mIDO轉(zhuǎn)染鼠LLC細胞并表達mIDO蛋白,建立了細胞水平mIDO活性檢測體系,并分別檢測細胞水平上L-1-MT對mIDO和hIDO的抑制效力,發(fā)現(xiàn)其對IDO在細胞水平上的抑制效力要遠高于酶水平,且對LLC-mIDO及HEK293-hIDO的IC50值不同,分別為16.82和21.63 μmol/L,差異與酶水平結(jié)果相當。

表 2　L-1-MT mIDO和hIDO的抑制類型及相應(yīng)的Ki和IC50值

aKinetic parameters and IC50values are the mean of at least three independent assays;bRecombinant IDO.

以上結(jié)果說明L-1-MT對mIDO與hIDO具有相同的抑制類型,但在抑制效力方面可能會存在差異。這與mIDO、hIDO空間結(jié)構(gòu)的差異有關(guān),兩種來源的IDO酶具有62%的序列同源一致性,活性中心氨基酸序列具有100%同源一致性[20],但mIDO和hIDO二級結(jié)構(gòu)中α-螺旋的比例不同,分別為71%和61%[6];鼠源和人源細胞在轉(zhuǎn)運與代謝上的差異也會影響IDO細胞水平活性檢測的結(jié)果[6]。

A:Plot of reaction rate to enzyme concentration;B:IC50values of L-1-MT to rmIDO and rhIDO by enzymatic assay (IC50values were calculated by modified Karber’s method);C:Determination of kinetic parameters of L-1-MT in rmIDO and rhIDO;D:IC50values of L-1-MT in cellular assay (Determination of mIDO transfected LLC cells and hIDO transfected HEK 293 cells).

圖5L-1-MT對不同種源IDO的抑制類型及相應(yīng)Ki、IC50值的測定

Fig 5Determination of the inhibition type,Ki and IC50values of L-1-MT on different species of IDO

本實驗的研究成果為以后IDO抑制劑的篩選提供了mIDO酶活性檢測平臺,使得對抑制劑的篩選更全面,有助于更好地利用小鼠模型來替代人類進行IDO抑制劑治療疾病的研究。

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Establishment of the mouse indoleamine 2,3-dioxygenase activity assay system

GUO Zhan-ling1,LI Juan-juan1,YANG Qing1,2△

(1DepartmentofBiochemistry,SchoolofLifeSciences,FudanUniversity,Shanghai200438,China;2TheCollaborativeInnovationCenterofYunnanNaturalProductsandBiologicalPharmacy,Kunming650091,YunnanProvince,China)

【Abstract】ObjectiveTo establish a mouse indoleamine 2,3-dioxygenase (mIDO) activity assay system.MethodsRecombinant mIDO (rmIDO) expressed and purified by genetic engineering methods was used to set up an enzymatic mIDO activity assay method, and mIDO overexpressing Lewis lung cancer (LLC) cell line was constructed to establish a cellular mIDO activity assay method.The inhibitory activity of Lewis lung cancer (L-1-MT) on mIDO and human IDO (hIDO) in enzymatic and cellular level were investigated respectively,including inhibition type,kinetic parameters Ki and IC50values.ResultsL-1-MT showed inhibitory effects on mIDO and hIDO,and inhibition type and Ki values were similar,while IC50values were distinct in both enzymatic and cellular levels.ConclusionsThe established mIDO activity assay system is an effective tool for screening IDO inhibitors. It can reflect the species difference when combined with hIDO activity assay system,and is useful for the research on therapeutic effect of IDO inhibitors with mouse model instead of human beings.

【Key words】indoleamine 2,3-dioxygenase;mouse;human;activity assay system;L-1-methyl tryptophan

【中圖分類號】Q331, Q786

【文獻標識碼】A

doi:10.3969/j.issn.1672-8467.2016.03.018

(收稿日期:2015-09-06;編輯:段佳)

國家自然科學基金 (81373396);高等學校博士學科點專項科研基金 (20130071110037);上海市科委生物醫(yī)藥重點課題 (12431900204)

△Corresponding authorE-mail:yangqing68@fudan.edu.cn

*This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (81373396),the Research Fund for the Doctoral Program of Higher Education of China (20130071110037) and the Key Medical Project of Science and Technology Commission of Shanghai Municipality (12431900204).