李媛媛，鐘 琴，胡佐鴻

(成都市第一人民醫(yī)院病理科，四川 成都 610041)

漿膜腔積液細(xì)胞塊全切片掃描圖像作為初始診斷的可行性研究

李媛媛，鐘 琴，胡佐鴻

(成都市第一人民醫(yī)院病理科，四川 成都 610041)

目的 探討全切片掃描圖像技術(shù)在漿膜腔積液細(xì)胞塊初始診斷中的可行性。方法 回顧成都市第一人民醫(yī)院病理科2015年1～12月318例漿膜腔積液細(xì)胞塊病理資料，采用優(yōu)納第四代全自動(dòng)數(shù)字切片掃描系統(tǒng)掃描玻片，存入電腦。所有玻片均由同一位病理主治醫(yī)生獨(dú)立重新閱片分析。觀察者先進(jìn)行原始玻片傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡判讀，5周后再于電腦上判讀數(shù)字切片。閱片結(jié)束后，計(jì)算分析光學(xué)顯微鏡上判讀與電腦數(shù)字切片判讀的的可重復(fù)性。結(jié)果 全切片掃描圖像診斷與傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡診斷的，Kappa值0.91。所有的診斷差異性出現(xiàn)在可疑腫瘤病例，在良性與惡性病例之間沒有診斷差異性。結(jié)論 數(shù)字切片掃描圖像技術(shù)可用于細(xì)胞塊初始診斷。

全切片掃描圖像；傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡；數(shù)字切片；漿膜腔積液；細(xì)胞塊

數(shù)字切片掃描與應(yīng)用系統(tǒng)通過全自動(dòng)顯微鏡掃描平臺(tái)，掃描與控制軟件系統(tǒng)，集光學(xué)、自動(dòng)化、計(jì)算機(jī)與圖像處理、網(wǎng)絡(luò)等技術(shù)，將傳統(tǒng)的玻璃切片進(jìn)行掃描和無縫拼接，生成包括傳統(tǒng)玻璃切片內(nèi)所有信息，即一整張全視野高分辨率的數(shù)字化切片(whole slide imaging，WSI)，也稱虛擬病理切片(virtual slide of pathology)。數(shù)字切片技術(shù)經(jīng)過二十余年的發(fā)展完善，已有多項(xiàng)不同的病理實(shí)踐，目前國(guó)內(nèi)的應(yīng)用主要包括：病理質(zhì)量控制[1]、遠(yuǎn)程病理會(huì)診[2，3]、病理科研教學(xué)[4，5]、病理切片存檔、病理讀片等[6]，均取得了很大的進(jìn)展。但是，全切片掃描圖像技術(shù)作為病理科常規(guī)一線病理診斷應(yīng)用還不多。隨著WSI技術(shù)的日益成熟，高分辨率數(shù)字圖像的獲得，把WSI作為常規(guī)應(yīng)用的時(shí)機(jī)已經(jīng)成熟。但在臨床病理一線診斷實(shí)踐之前，WSI的這一應(yīng)用的有效性需要得到證實(shí)，這便需要比較同一病理圖像在WSI與傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡(conventional microscopy，CM)之間觀察者內(nèi)的可重復(fù)性。按照美國(guó)病理家學(xué)會(huì)(College of American Pathologist，CAP)關(guān)于WSI用于病理診斷目的驗(yàn)證指南[7]，這一比較應(yīng)在所有臨床面對(duì)的病理診斷實(shí)踐中實(shí)施，包括石蠟切片、冰凍切片、免疫組化、細(xì)胞學(xué)等。本文比較了在漿膜腔積液細(xì)胞塊切片中，同一觀察者在WSI與CM之間的診斷重復(fù)性。本文將成都市第一人民醫(yī)院病理科2015年的細(xì)胞塊HE掃描圖像的判讀與光學(xué)顯微鏡下的判讀結(jié)果比較，以探討全切片掃描圖像技術(shù)在漿膜腔積液細(xì)胞塊診斷中的價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集成都市第一人民醫(yī)院病理科2015年1～12月的漿膜腔積液細(xì)胞塊病理資料共318例，年齡7～93歲，平均年齡65歲。男209例，女109例。其中，胸水細(xì)胞塊242 例，腹水細(xì)胞塊62例，心包積液細(xì)胞塊14例。318例細(xì)胞塊切片中，原始診斷惡性腫瘤共90例，其中腺癌共82例，小細(xì)胞癌3例，鱗癌3例，間皮瘤1例，淋巴瘤1例；可疑惡性70例；未見惡性病變共158例。

1.2 方法 細(xì)胞塊制作標(biāo)本離心后甲醛固定，酒精脫水，再離心取沉渣，石蠟包埋切片，HE染色。玻片掃描采用北京優(yōu)納科技有限公司PRECICE600×8全自動(dòng)數(shù)字切片掃描系統(tǒng)掃描不同切片，快速線性掃描玻片，40倍掃描，可一次性掃描240張(用時(shí)約23個(gè)小時(shí))，共掃描318張。所有玻片均由同一位病理主治醫(yī)生獨(dú)立重新閱片分析。WSI瀏覽閱片軟件采用北京優(yōu)納科技有限公司PRECISE iViewer(軟件版本5.2.10.0)，電腦顯示器DELL U2312，分辨率1920×1080。

在第一階段，觀察者進(jìn)行原始玻片光學(xué)顯微鏡判讀，閱片結(jié)束5周后再于電腦上進(jìn)行隨機(jī)編號(hào)數(shù)字切片判讀，為觀察者提供每例細(xì)胞塊切片的原始基本臨床信息，隱藏細(xì)胞塊切片原始診斷結(jié)果。判讀結(jié)果參照Nathan細(xì)胞塊四分類診斷[8]，簡(jiǎn)化分為惡性腫瘤(主要包括腺癌、小細(xì)胞癌、鱗癌、淋巴瘤、間皮瘤等)，可疑惡性腫瘤，未見惡性腫瘤三個(gè)大類。閱片結(jié)束后，計(jì)算分析第一次光學(xué)顯微鏡上判讀與第二階段電腦數(shù)字切片判讀的可重復(fù)性?？芍貜?fù)分為三類：一致(兩次診斷完全相同)、基本一致(惡性診斷為可疑惡性，或反之)、不一致(惡性或可疑惡性診斷為良性，或反之)。最后，計(jì)算重復(fù)性完全一致的百分比及95%的可信區(qū)間。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。計(jì)算兩次判讀完全一致的百分比(95%的可信區(qū)間)。對(duì)觀察者兩次的判讀結(jié)果一致性采用Kappa系數(shù)(κ值)判定。判定標(biāo)準(zhǔn)為：κ≤0.00時(shí)，無意義；κ=1時(shí)，表明2次觀察結(jié)果完全一致；0.00<κ≤0.40時(shí)，表明2次觀察一致性差；0.40<κ≤0.60時(shí)，表明兩者一致性中度；0.60<κ≤0.80時(shí)，表明兩者有較高的一致性；κ>0.80時(shí)，表明兩者有極好的一致性。

2 結(jié)果

318例細(xì)胞塊切片，有18例掃描不成功(15由于機(jī)器故障造成，3例由于切片質(zhì)量原因)，實(shí)際納入分析的細(xì)胞塊切片共300例。第一次光鏡閱片與第二次數(shù)字閱片結(jié)果可重復(fù)性比較見表1。

表1 光鏡閱片CM與數(shù)字閱片WSI結(jié)果重復(fù)性比較 (n=300)

兩次閱片完全一致的共284例，診斷Kappa值0.91?；疽恢碌?例，不一致的9例。所有的診斷不一致出現(xiàn)在可疑惡性病例，在良性與惡性病例之間沒有診斷不一致。

3 討論

3.1 細(xì)胞塊及WSI的特點(diǎn) 在腫瘤的防治及診斷中，細(xì)胞病理學(xué)占有重要的地位。但是，相較與組織病理學(xué)，由于細(xì)胞學(xué)不具備組織結(jié)構(gòu)特征，因此又存在顯著的局限性。近年來逐漸開展的細(xì)胞塊技術(shù)明顯縮小了細(xì)胞學(xué)與組織學(xué)之間的差距，主要表現(xiàn)在：一方面，細(xì)胞塊切片顯示出了細(xì)胞團(tuán)塊的微小結(jié)構(gòu)特征，接近微小組織活檢；另一方面也是最重要的一面，細(xì)胞塊切片可以進(jìn)一步行免疫細(xì)胞化學(xué)染色[9]，在良惡性的鑒別及病理分型中發(fā)揮了舉足輕重的作用。雖然細(xì)胞塊的免疫細(xì)胞化學(xué)如此重要，但與組織學(xué)標(biāo)本比較，受標(biāo)本本身的特點(diǎn)及取材限制，細(xì)胞塊一般較小，經(jīng)細(xì)胞塊切片及免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)后，一般所剩不多。因此，細(xì)胞塊切片的保存就相當(dāng)重要。但是，隨時(shí)間的流逝，染色會(huì)褪色或模糊，尤其是免疫細(xì)胞化學(xué)切片毀損或褪色后無法再生。因此，尋找細(xì)胞學(xué)玻片的良好保存方法勢(shì)在必行。

WSI是近年出現(xiàn)的新技術(shù)[10，11]，由于能夠?qū)η衅畔⑷珨?shù)字化儲(chǔ)存，永久保存，可能是一種很好的替代保存方式，不存在玻片損壞、丟失及褪色風(fēng)險(xiǎn)。數(shù)字切片閱讀能夠模擬光鏡觀察如在平面X軸-Y軸移動(dòng)及放大觀測(cè)倍數(shù)，數(shù)字切片閱讀還能夠提供另外的特點(diǎn)，如任何方向方便的圖片移動(dòng)導(dǎo)向，系統(tǒng)觀察整張切片，避免漏掉局部區(qū)域，多張圖片同時(shí)觀察，同一切片的不同染色并列比較，連續(xù)變焦放大縮小，多人同時(shí)閱片討論，這都更有利于圖片觀察(圖1a)。在病理學(xué)醫(yī)、教、研實(shí)踐中，數(shù)字切片具有傳統(tǒng)切片的所有功能，借助網(wǎng)絡(luò)具有閱片不受空間與時(shí)間限制的優(yōu)點(diǎn)。

3.2 細(xì)胞塊應(yīng)用于WSI的優(yōu)勢(shì) WSI用于能否用于細(xì)胞塊初始診斷，還需要病理實(shí)踐印證，其前提是全切片掃描圖像的判讀要與CM下的判讀具有可重復(fù)性。關(guān)于這類可重復(fù)性研究在組織病理學(xué)診斷中近來有較多報(bào)道，包括常規(guī)外科病理[12]及胃腸[13]、泌尿[14]、乳腺[15]、前列腺[16]專科組織系統(tǒng)。與組織學(xué)研究相比，細(xì)胞學(xué)的WSI研究不多，而且，細(xì)胞學(xué)涂片的獨(dú)自特點(diǎn)如涂片厚薄不均，重疊，背景模糊是對(duì)數(shù)字化切片的挑戰(zhàn)，而這類問題在日常光鏡下通過上下調(diào)焦觀察不同平面是容易得到解決的。雖然3D多平面掃描技術(shù)也即WSI的Z軸堆疊掃描(Z-stacking)也可以解決上述細(xì)胞學(xué)涂片的問題，但成本高，掃描耗時(shí)長(zhǎng)，操作麻煩，并不利于細(xì)胞學(xué)WSI的開展。然而，與組織學(xué)切片一樣，細(xì)胞塊切片能夠避免上述細(xì)胞涂片問題，這也是細(xì)胞塊技術(shù)優(yōu)于傳統(tǒng)涂片的特點(diǎn)之一。因此，依靠細(xì)胞塊技術(shù)，細(xì)胞學(xué)可以有效地與WSI聯(lián)姻。

圖1 漿膜腔積液細(xì)胞塊不同病理改變WSI瀏覽顯示器界面截圖(右上方為縮略圖) a.細(xì)胞塊切片外觀，包括切片編號(hào)及細(xì)胞塊形態(tài);b.良性病變,可見間皮細(xì)胞、淋巴細(xì)胞及中性粒細(xì)胞(×40);c.腺癌,核仁明顯，核膜增厚，可見腺體結(jié)構(gòu)(×40);d.鱗癌,細(xì)胞成巢，核仁明顯(經(jīng)免疫細(xì)胞化學(xué)證實(shí),×40);e.小細(xì)胞癌,細(xì)胞胞質(zhì)稀少，鑲嵌狀排列明顯(經(jīng)免疫細(xì)胞化學(xué)證實(shí),×40);f.可疑腺癌,細(xì)胞形態(tài)溫和，可見腺樣結(jié)構(gòu)(最后經(jīng)免疫細(xì)胞化學(xué)證實(shí)為間皮瘤,×20)

細(xì)胞塊的WSI研究有少量報(bào)道[17，18]，Tawfik報(bào)道了婦科液基剩余標(biāo)本細(xì)胞塊的WSI研究，證實(shí)液基細(xì)胞塊WSI是可行的一種選擇，能夠有效發(fā)現(xiàn)宮頸微生物及良性反應(yīng)性改變；并與原始液基細(xì)胞學(xué)結(jié)果比較，證實(shí)婦科液基細(xì)胞塊WSI發(fā)現(xiàn)異常細(xì)胞的敏感性與液基涂片一致，并顯示出檢出LSIL與HSIL更高的特異性。關(guān)于非婦科的體液細(xì)胞塊的WSI研究尚未見報(bào)道。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)細(xì)胞塊切片的WSI能夠完全再現(xiàn)在光鏡下的細(xì)胞學(xué)特征，明確顯示胸水、腹水、心包積液中的良性細(xì)胞如間皮心包、淋巴細(xì)胞及中性粒細(xì)胞等(圖1b)；能夠發(fā)現(xiàn)惡性腫瘤細(xì)胞如腺癌(圖1c)、鱗癌(圖1d)、小細(xì)胞癌(圖1e)；可以觀察到腺癌的核仁、腺腔，鱗癌的角化，小細(xì)胞癌的粉塵染色質(zhì)、鑲嵌排列等細(xì)微特征。

3.3 細(xì)胞塊WSI與CM閱片的可重復(fù)性 在本研究中，兩次閱片完全一致的共284例，診斷κ=0.91。所有的診斷基本一致及不一致都與可疑惡性病例相關(guān)，在良性與惡性病例之間沒有診斷不一致。本研究95%可重復(fù)性與其他學(xué)者報(bào)道的可重復(fù)性基本一致，Houghton在普外科病理報(bào)道的重復(fù)性為95%[12]，Janabi在胃腸[13]、泌尿[14]、乳腺[15]等?？祁I(lǐng)域報(bào)道的可重復(fù)性分別為95%、87%、93%。

基本一致的7例中，4例WSI診斷為可疑惡性，而CM診斷為惡性；3例WSI診斷為惡性，而CM診斷為可疑惡性。重新回顧這7例，發(fā)現(xiàn)其共同特征是異型性細(xì)胞惡性特征明確，但是數(shù)量少，診斷者在作出惡性或可疑惡性的尺度把握上重復(fù)性不好造成的，并非WSI本身的缺陷造成。這類輕度的不一致也不具有明顯的臨床及預(yù)后意義，對(duì)待可疑惡性，我們一般通過再次送檢標(biāo)本或在細(xì)胞塊切片上做免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)都能夠最終明確診斷(圖1f)。

不一致的9例中，3例WSI診斷為未見惡性，而CM診斷為可疑惡性；6例WSI診斷為可疑惡性，而CM診斷為未見惡性。重新回顧這9例，發(fā)現(xiàn)其共同特征是異型性細(xì)胞惡性特征模棱兩可，即我們常說的核異質(zhì)細(xì)胞，診斷者在做出良性或可疑惡性的尺度把握上重復(fù)性不好造成的，也并非WSI本身的缺陷造成。這類不一致其實(shí)在診斷者兩次光鏡下不同時(shí)段診斷也可能出現(xiàn)，即診斷者內(nèi)的可重復(fù)性變異，Reyes等[19]在WSI與CM的可重復(fù)性研究中，比較了診斷者內(nèi)兩次不同時(shí)段CM閱片的可重復(fù)性變異性，發(fā)現(xiàn)三位不同病理學(xué)者的可重復(fù)性變異分別為4%、7%、0%，平均3.7%。

綜上所述，我們的研究顯示W(wǎng)SI可較好地用于細(xì)胞塊初始診斷。

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Whole slide images of serous effusion cell blocks for the primary diagnosis：A feasibility study

LI Yuan-yuan，ZHONG Qin，HU Zuo-hong

(Department of Pathology，Chengdu First People’s Hospital，Chengdu 610041，China)

HUZuo-hong

Objective To investigate the feasibility of whole slide imaging (WSI) of serous effusion cell blocks for the primary diagnosis.Methods Serous effusion cell blocks from 318 cases between January 2015 and December 2015 at our department were retrospectively reviewed.Each slide was digitally scanned by UNIC fourth generation digital section scanning system and the images were stored in a shared file.All slices were independently reviewed by the same pathologists.The observers first reviewed the glass slides under conventional microscopy (CM) and then reviewed the digital images in an interval of 5 weeks.After finishing all cases，reproducibility of WSI versus CM were analyzed.Results The diagnostic reproducibility for WSI versus CM was 95% CI (0.93～0.97).κ= 0.91.All diagnostic disagreements were found in suspicious malignancy.There was no intra observer disagreement in the diagnosis of benign versus malignant diseases.Conclusion WSI could be used for the initial diagnosis of serous effusion cell blocks.

Whole slide imaging； Conventional microscopy； Digital slide；Serous effusion；Cell block

胡佐鴻

R361

A

1672-6170(2016)04-0089-04

2016-02-13；

2016-05-04)