孫 皓，王多姿，郭富強

(1.成都市雙流縣第一人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，四川 成都 610200；2.四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，四川 成都 610072)

運動訓(xùn)練對腦出血大鼠腦組織中特異性腦源蛋白B表達的影響

孫 皓1，王多姿2，郭富強2

(1.成都市雙流縣第一人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，四川 成都 610200；2.四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，四川 成都 610072)

目的 探討運動訓(xùn)練對腦出血大鼠腦組織中特異性腦源蛋白B(S100B)表達的影響。方法 采用自體血注入法將80只SD大鼠制作成右側(cè)紋狀體腦出血模型，造模成功后隨機分為對照組和運動訓(xùn)練組(運動組)，每組又分為1、3、7、14、21 d亞組各8只。運動組行網(wǎng)屏訓(xùn)練、平衡木訓(xùn)練、滾籠訓(xùn)練，對照組不作任何干預(yù)。分別于不同時間點對大鼠進行神經(jīng)功能評分，取右側(cè)腦組織用免疫組化和原位雜交的方法檢測S100B的蛋白及mRNA表達。結(jié)果 在腦出血后14 d和21 d運動組大鼠的神經(jīng)功能評分優(yōu)于對照組；在腦出血后7 d運動組大鼠的S100B表達低于對照組(P< 0.05)。結(jié)論 運動訓(xùn)練可使腦出血大鼠腦組織內(nèi)S100B的含量降低，這可能是運動訓(xùn)練促進神經(jīng)功能的恢復(fù)機制之一。

腦出血；運動訓(xùn)練；S100B；神經(jīng)功能

腦出血是一類致死率和致殘率都很高的疾病[1]。特異性腦源蛋白B(S100B)在腦出血病理損傷過程中發(fā)揮著重要作用[2，3]。運動訓(xùn)練能對腦出血后腦的可塑性和神經(jīng)功能的恢復(fù)產(chǎn)生積極的影響[4～7]，但具體發(fā)生的機制并不十分清楚。目前國內(nèi)外研究運動訓(xùn)練對腦組織中S100B表達影響的報道較少。2007年3～12月作者通過對腦出血大鼠進行運動訓(xùn)練，動態(tài)觀察腦出血大鼠神經(jīng)功能評分和腦組織中S100B的蛋白及mRNA表達，探討運動訓(xùn)練促進腦出血后神經(jīng)功能恢復(fù)的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及試劑 健康雄性SD大鼠80只，鼠齡3～4個月，體重250～300 g(四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院動物中心提供)。飼養(yǎng)1周，使大鼠適應(yīng)實驗室環(huán)境。S100B免疫組化試劑盒及原位雜交試劑盒購于武漢博士德生物工程有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 模型制作及分組 用10%水合氯醛(0.33 ml/100 g)腹腔注射麻醉SD大鼠，參照包新民等[8]繪制的大鼠立體定位圖譜，定位前囪前0.2 mm，中線右旁開3 mm，垂直進針5.5 mm，為大鼠右側(cè)尾殼核區(qū)。斷尾取自體血50 μl注入腦內(nèi)，將80只SD大鼠都制作成右側(cè)紋狀體腦出血模型，造模成功后隨機分為對照組和運動訓(xùn)練組(運動組)，每組包括1、3、7、14、21d亞組各8只，術(shù)后將大鼠單獨飼養(yǎng)，運動組行運動訓(xùn)練，對照組不作任何干預(yù)，在術(shù)后1、3、7、14、21d分別進行大鼠的神經(jīng)功能評分，然后處死大鼠，取右側(cè)腦組織用免疫組化和原位雜交的方法檢測S100B的蛋白及mRNA表達。

1.2.2 神經(jīng)功能評分 在動物清醒后，采用Zausinger法[9]進行神經(jīng)功能缺損評分。0分：不能自發(fā)行走；1分：自由走動狀態(tài)下向病變對側(cè)旋轉(zhuǎn)；2分：抓住鼠尾，大鼠向病變對側(cè)旋轉(zhuǎn)；3分：對于施向病變對側(cè)壓力抵抗下降者；4分：不能伸直病變對側(cè)前爪，甚至全身向?qū)?cè)屈曲；5分：無神經(jīng)功能缺損。1～4分判斷為模型成功，0分和5分判定為造模失敗。

1.2.3 運動訓(xùn)練方法 造模成功24 h后運動訓(xùn)練組大鼠給予滾籠訓(xùn)練、平衡木訓(xùn)練、網(wǎng)屏訓(xùn)練。每周6天，休息1天。①滾籠訓(xùn)練：自制電動網(wǎng)狀滾籠，長度100 cm，直徑60 cm，中間分為4格，將大鼠放入籠中，滾籠按5 r/min，10分鐘/次，1次/天，進行轉(zhuǎn)動。②平衡木訓(xùn)練：取170 cm長、2 cm寬的方木棒作為平衡木，平放于距地面7 cm處，讓大鼠在上面爬行，每天訓(xùn)練10 min。③網(wǎng)屏訓(xùn)練：網(wǎng)屏為50 cm×50 cm鐵絲網(wǎng)，鐵絲直徑為2 mm，網(wǎng)眼規(guī)格為1 cm×1 cm，網(wǎng)板的左右和上方都有25 cm高的木板框邊，網(wǎng)屏距地面高度為80 cm，下方鋪以12 cm厚的海綿，先將網(wǎng)屏水平放置并將老鼠置于其上，然后緩慢地將網(wǎng)屏一端抬高，在2 s內(nèi)將其抬高至垂直位并保持5 s，期間觀察大鼠是否會用前爪抓住網(wǎng)屏或從網(wǎng)屏上掉下，每天訓(xùn)練10 min。運動組及對照組在1、3、7、14、21 d分別作神經(jīng)功能評分，評分方法按照參考文獻[10]中介紹的進行。①平衡木行走評測：該項目評分標(biāo)準(zhǔn)共分為6個等級。0分：大鼠能跳上平衡木并在上面移動且不會掉下；1分：能跳上平衡木并在上面移動，掉下機會<50%；2分：能跳上平衡木并在上面移動，掉下機會>50%；3分：大鼠在健側(cè)肢體幫助下能跳上平衡木，但受累的癱瘓肢體不能幫助其向前移動；4分：大鼠在平衡木上不能移動，但不會掉下；5分：將大鼠放在平衡木上即會掉下。②網(wǎng)屏抓握評測：該項目評分標(biāo)準(zhǔn)共分為4個等級。0分：大鼠前爪抓住網(wǎng)屏5 s，期間不會掉下；1分：大鼠暫時抓住網(wǎng)屏并滑落一段距離，但沒有從網(wǎng)屏上掉下；2分：在5 s內(nèi)從網(wǎng)屏上掉下；3分：網(wǎng)屏轉(zhuǎn)動時，大鼠即刻從網(wǎng)屏上掉下。

1.2.4 標(biāo)本及病理切片的制作 各組大鼠在相應(yīng)的時間點用10%水合氯醛麻醉，迅速打開胸腔，由心尖部的左心室灌注生理鹽水，直至由剪開的右心耳流出的液體清亮為止；然后斷頭取腦，腦組織標(biāo)本浸于4 ℃的4%中性多聚甲醛液中固定24～48 h；以針眼為中心取厚約5 mm的冠狀切片，石蠟包埋，在切片機上連續(xù)切片(厚度3～4 μm)；使用免疫組織化學(xué)法和原位雜交法分別測定S100B蛋白及mRNA的表達情況。

1.2.5 檢測指標(biāo)及方法 嚴(yán)格按照免疫組化和原位雜交試劑盒提供的步驟進行操作，最后用DAB顯色，鏡下觀察S100B蛋白和mRNA表達。每只大鼠每個指標(biāo)隨機選一張切片，在400倍光鏡下隨機選擇血腫周圍的4個互不重疊的視野，每個時點共計32個視野，計數(shù)每個視野的陽性細胞數(shù)。S100B蛋白和mRNA表達以胞質(zhì)染成棕黃色的細胞為陽性細胞。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 13.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)處理。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，均經(jīng)方差齊性及正態(tài)性檢驗，組內(nèi)比較采用重復(fù)測量數(shù)據(jù)的方差分析及q檢驗，組間比較采用t檢驗。P< 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 神經(jīng)功能評測 兩組第14、21 d的平衡木行走評分和網(wǎng)屏抓握評分與第1、3、7 d比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P< 0.05)；運動組第14、21 d的評分與對照組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P< 0.05)，見表1。

表1 兩組不同時間點神經(jīng)功能評分比較(分)

①與對照組比較，P< 0.05；②與第1、3、7 d比較，P< 0.05

2.2 S100B的蛋白及mRNA表達測定 兩組S100B的蛋白表達均在第3 d最高，第21 d降到最低，對照組第3、7 d的水平明顯高于第1、14、21 d(P< 0.05)，運動組第3 d的水平明顯高于第1、7、14、21 d(P< 0.05)。運動組第7 d的水平明顯低于對照組(P< 0.05)。兩組S100B的mRNA表達均在第3 d最高，第21 d降到最低，第3、7 d的水平明顯高于第1、14、21 d(P< 0.05)。運動組第14、21 d的水平明顯低于對照組(P< 0.05)。見表2。

表2 兩組不同時間點S100B的蛋白及mRNA表達

①與對照組比較，P< 0.05；②與第3 d比較，P< 0.05；③與第3、7 d比較，P< 0.05

3 討論

腦出血后在血腫周圍組織存在著繼發(fā)性損傷，許多細胞因子的表達在炎性反應(yīng)中的作用尤為人們關(guān)注，這些細胞因子直接或間接影響著繼發(fā)損傷的程度[11～13]。S100B蛋白是神經(jīng)組織蛋白質(zhì)的一種，其中S100A和S100B是主要成份，它在體內(nèi)的水平反映了中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的程度[2，3，14]。腦內(nèi)S100B主要由活化的星形膠質(zhì)細胞產(chǎn)生，其生理濃度具有神經(jīng)生長因子樣作用，促進神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)生、發(fā)展。然而，在病理狀態(tài)下，S100B以高濃度水平存在，能夠刺激膠質(zhì)細胞產(chǎn)生大量致炎因子和一氧化氮，導(dǎo)致神經(jīng)元功能障礙或死亡，同時，S100B還具有直接神經(jīng)毒作用[15，16]。因此，近年來S100B也被臨床用于評估腦出血患者的預(yù)后[17]。

在本研究中，運動組采用網(wǎng)屏訓(xùn)練、滾籠訓(xùn)練、平衡木訓(xùn)練等方法訓(xùn)練腦出血大鼠的抓握、爬行、平衡等能力，在術(shù)后第14、21 d，其神經(jīng)功能恢復(fù)優(yōu)于對照組，說明運動訓(xùn)練可改善腦出血后神經(jīng)功能的評分，促進腦出血后神經(jīng)功能的恢復(fù)。運動訓(xùn)練能夠抑制S100B的表達，減輕腦出血后的炎癥反應(yīng)，從而抑制神經(jīng)細胞凋亡的發(fā)生，起到神經(jīng)保護的作用，但這種現(xiàn)象的具體機制還不清楚。近年的研究認(rèn)為：規(guī)律的多種運動訓(xùn)練能夠誘導(dǎo)抗炎反應(yīng)，可使肌肉纖維產(chǎn)生具有抗炎效應(yīng)的細胞因子，如白細胞介素6、白細胞介素10和熱休克蛋白70等，這些神經(jīng)保護因子阻斷了炎性反應(yīng)的部分環(huán)節(jié)[18～20]。另外一種機制可能是運動訓(xùn)練誘導(dǎo)了雄激素的分泌，雄激素又刺激了促紅細胞生成素的分泌[21]，促紅細胞生成素具有多種生理功能，它既能刺激紅細胞的生成，又能改善運動能力[22]，可能是通過抑制S100B的合成和分泌[23]，同時能夠上調(diào)熱休克蛋白70的表達，從而起到了神經(jīng)保護的作用[24]。

綜上所述，盡管目前腦出血后運動訓(xùn)練促進神經(jīng)功能恢復(fù)的機制還不完全清楚，但本研究結(jié)果顯示，運動訓(xùn)練使腦組織中S100B的表達下降，故我們認(rèn)為運動訓(xùn)練能夠抑制S100B的表達，減輕血腫周圍腦組織的炎性反應(yīng)，這可能是運動訓(xùn)練促進神經(jīng)康復(fù)的機制之一，更多的作用機制還有待進一步研究。

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Effect of exercise on S100B expression in the brain of rats after intracerebral hemorrhage

SUN Hao1，WANG Duo-zi2，GUO Fu-qiang2

(1.Department of Neurology，Shuangliu County First People’s Hospital，Chengdu 610042，China；2.Department of Neurology，Sichuan Academy of Medical Sciences & Sichuan Provincial People’s Hospital，Chengdu 610072，China)

GUOFu-qiang

Objective To investigate the correlation between exercise and S100B expression in rat brain after intracerebral hemorrhage (ICH).Methods A model of ICH was created by injection of their autoblood into right striatum in 80 Sprague-Dawley (SD) rats.The successful models were randomly divided into exercise group (Group E) and control group (Group C)，each group including subgroups of 1，3，7，14 and 21d.Animals in the group E were exercised with rolling cage training，net curtain training and walking balance wood training，while rats of the group C had no intervention.The rats were evaluated neurological function at the different time points.Then，the animals were executed to take out the right brain for detection of S100B expression at transcription and translation levels by using immunohistochemistry and hybridization in situ.Results The neurological function score in the group E at the 14d and 21d was better than that in the group C.The expression of S100B in the group E was lower than that in the group C.Conclusion Exercise could decrease the S100B expression in the brain of ICH rat.Exercise could be one of mechanisms of promoting neurological function recovery.

Intracerebral hemorrhage； Exercise； S100B； Neurological function

四川省衛(wèi)生廳科研基金資助項目(編號：020019)；四川省中醫(yī)藥管理局科研基金資助項目(編號：200669)

郭富強

R743.34

A

1672-6170(2016)04-0070-03

2015-11-03；

2016-04-23)