廖斷修，陳 洪，易興陽，何 妮，王 淳，林 靜

(1.四川省德陽市人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，四川 德陽 618000；2.溫州醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，浙江 溫州 325200)

CYP4A11基因多態(tài)性與腦梗死的相關(guān)性研究

廖斷修1，陳 洪1，易興陽1，何 妮1，王 淳1，林 靜2

(1.四川省德陽市人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，四川 德陽 618000；2.溫州醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，浙江 溫州 325200)

目的 評估CYP4A11基因多態(tài)性及其與腦梗死發(fā)病及梗死后血管事件的相關(guān)性。方法 采用基質(zhì)輔助激光解吸附電離/飛行時間質(zhì)譜法(MDLDI-TOF-MS)對396例腦梗死患者及378例對照者的CPYP4 A11rs2269231、CPYP4 A11rs9333025、CYP4F2rs3093135及CYP4F2rs2108622 SNPs進(jìn)行檢測。并對所有的腦梗死患者隨訪12月。結(jié)果 腦梗死組CPYP4 A11rs9333025 GG基因型頻率發(fā)布明顯高于對照組(P< 0.001)。CPYP4 A11rs9333025 GG與腦梗死的發(fā)病密切相關(guān)(OR=1.82，95%CI：1.24～5.04，P= 0.016)。rs9333025 GG基因型患者在隨訪期內(nèi)腦梗死復(fù)發(fā)率及其他血管事件發(fā)生率明顯高于rs9333025 AG基因型患者(P= 0.04)。rs9333025 GG為腦梗死后血管事件發(fā)生的獨立危險因素(RR=1.87，95%CI：1.16～5.36，P= 0.003)。結(jié)論 rs9333025 GG基因型增加了腦梗死的易感性和腦梗死后血管事件發(fā)生的風(fēng)險。

腦卒中；細(xì)胞色素P450；基因；變異；CYP4A1l；CYP4F2

腦卒中是一組由血管、環(huán)境和遺傳等多因素參與的復(fù)雜疾病，是我國人口死亡的首要死因。而腦梗死占所有腦卒中的80%左右，其病因和發(fā)病機制均未完全闡明。CYPω-羥化酶可將花生四烯酸(arachidonic acid，AA)轉(zhuǎn)化為20-羥基二十碳四烯酸(20-hydroxyeicosatetraenoic acid，20-HETE)。20-HETE具有較強的血管收縮功能[1]，在自動調(diào)節(jié)腦血流量和血壓中起重要作用[2]。動物模型研究表明[3]，阻斷20-HETE的合成可減小梗死面積大小。CYPω-羥化酶受CYP4A11和CYP4F2基因的編碼和調(diào)控。有研究表明[4，5]，CYP4A11和CYP4F2基因多態(tài)性可能影響其酶的活性，與腦梗死發(fā)病相關(guān)，然而這些研究均為病例對照研究，沒有對患者進(jìn)行前瞻性隨訪。本研究旨在探討CYP4A11和CYP4F2基因4個位點多態(tài)性與腦梗死發(fā)病及隨訪期腦梗死復(fù)發(fā)和其他血管事件發(fā)生的相關(guān)性，現(xiàn)報道如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選擇2010年3月至2013年3月在德陽市人民醫(yī)院和溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院住院首次發(fā)病的急性腦梗死患者(腦梗死組)，均符合中華醫(yī)學(xué)會神經(jīng)病學(xué)分會腦血管病學(xué)組制定的診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]，均經(jīng)頭顱MRI證實。采用Han等[7]提出的改良TOAST分型方法對腦梗死進(jìn)行分型，只納入動脈粥樣硬化血栓型(AT)腦梗死及小動脈病變型(SAD)腦梗死?；颊呒凹覍倬炇鹬橥鈺Ｅ懦龢?biāo)準(zhǔn)：①心源性腦栓死、其他病因型或原因不明確型腦梗死；②既往有腦卒中病史；③腦出血；④伴嚴(yán)重心、肝、腎疾??；⑤出院后未正規(guī)服用阿司匹林等二級預(yù)防藥物；⑥不愿參與該研究；⑦隨訪期有2次上述指標(biāo)未控制在正常范圍。共納入396例，男235例，女161例，年齡46～85歲[(68.8±11.1)

歲]，AT腦梗死260例，SAD腦梗死136例。對照組為同期無腦卒中病史的門診患者，頭部CT檢查無顱內(nèi)病變，無腦卒中家族史，彼此之間及與腦梗死組患者之間無血緣關(guān)系。共納入378例，男222例，女156例，年齡44～78歲[(65.0±10.3)歲]。

1.2 方法

1.2.1 危險因素的評估 仔細(xì)詢問和登記研究對象一般情況，既往病史，個人史及常見危險因素如吸煙、酗酒情況，有無高血壓、糖尿病、冠心病、卒中史等，空腹血檢查血常規(guī)、凝血常規(guī)、生化常規(guī)、血脂全套等。

1.2.2 單核苷酸多態(tài)性(SNPs)的檢測 ①研究位點的選擇：參考國外研究位點，此基礎(chǔ)上在NCBI數(shù)據(jù)庫(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP)最新登記的各基因人類SNP，登錄人類HapMap計劃數(shù)據(jù)庫查找標(biāo)簽SNP(http：//www.hapmap.org/)，設(shè)置最小等位基因頻率(MAP)≥0.05，獲得各基因的標(biāo)簽SNP(TagSNP)，即為本研究各基因研究的位點。據(jù)此檢測CYP4A11 rs2269231，rs9333025 和CYP4F2 rs2108622，rs3093135等4個位點的基因型。②檢測方法：抽取腦梗死患者入院第2天及對照組體檢時清晨空腹靜脈血2 ml，用乙二胺四乙酸二鈉鹽抗凝處理，保存于-80 ℃冰箱中備用。采用低滲溶血、酚氯仿法從白細(xì)胞中抽提DNA，適量雙蒸水溶解，核酸分析儀測定DNA濃度。通過PCR擴增第1個靶序列，然后加入特異性延伸產(chǎn)物將擴增的片段SNPs連接。PCR引物和單堿基延伸引物都使用Assay Designer軟件包設(shè)計，引物序列見表1。SNPs的分型數(shù)據(jù)獲得是利用PCR的引物延伸和基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜法(MALDI-TOF；上海生工有限公司)測定[8]。

表1 每個SNP基因型的擴增和延長引物

F：正向引物；R：反向引物

1.3 隨訪和終點指標(biāo)

1.3.1 隨訪方法 出院后囑患者繼續(xù)控制血糖、血脂和血壓，鼓勵患者戒煙戒酒，繼續(xù)服用抗血小板藥物。由專人采用電話、信件、門診、家訪等方式對患者進(jìn)行12個月隨訪。每3個月至少門診隨訪1次，檢查血脂全套、血糖、血壓等。

1.3.2 終點指標(biāo) ①復(fù)發(fā)性缺血性卒中(RIS)，包括新發(fā)腦梗死和短暫腦缺血發(fā)作(TIA)；②深靜脈血栓形成(DVT)；③心肌梗死(MI)；④全因死亡；⑤出血事件，包括腦出血和顱外出血。對終點事件采用盲法評估，即評估者不知曉DNA分析的結(jié)果。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用t檢驗；計數(shù)資料以率表示，組間比較采用χ2或Fisher確切概率法。腦梗死發(fā)生的危險因素分析采用多因素Logistic回歸；腦梗死患者卒中后12個月發(fā)生血管事件風(fēng)險采用Cox比例風(fēng)險模型分析。P< 0.05為差異有統(tǒng)計意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組臨床特征比較 與對照組比較，腦梗死組患者年齡偏大，患高血壓、糖尿病的比例較高(P< 0.05)，兩組吸煙、飲酒、總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、甘油三酯(TG)、體重指數(shù)(BMI)等比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P> 0.05)，見表2。

表2 兩組臨床特征比較

2.2 兩組基因型分布比較 腦梗死組和對照組中4個基因位點的基因型分布均符合哈迪-溫伯格平衡(P> 0.05)。腦梗死組患者rs9333025 GG基因型頻率分布明顯高于對照者(P< 0.001)，而rs2269231、rs2108622和rs3093135各基因型在兩組中分布差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P> 0.05)，見表3。4個位點基因型在AT和SAD患者之間比較差異也無統(tǒng)計學(xué)意義(P> 0.05)。多因素Logistic回歸分析表明rs9333025的GG基因型是腦梗死危險因素之一(OR=1.82，95%CI：1.24～5.04，P= 0.016)，見表4。

表3 兩組基因型頻率分布比較 [n(%)]

表4 腦梗死發(fā)生的Logistic回歸分析

2.3 不同基因型和危險因素的腦梗死患者隨訪期終點指標(biāo)比較 腦梗死組中4例(1.01%)在隨訪期因外地定居等原因失訪，共392例(98.99%)完成隨訪。隨訪期有54例患者發(fā)生新的血管事件(37例RIS，5例死亡，6例MI，6例DVT)。rs9333025 GG基因型腦梗死患者隨訪期總血管事件發(fā)生率明顯高于rs9333025 AG基因型腦梗死患者(P= 0.04)，而其他3個位點各基因型與隨訪期血管事件發(fā)生差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P> 0.05)。年齡>68歲，AT型腦梗死，伴高血壓、糖尿病或高LDL的腦梗死患者與隨訪期血管事件發(fā)生密切相關(guān) (P< 0.05)，見表5。

表5 首次腦梗死后12月內(nèi)血管事件發(fā)生情況 [n(%)]

2.4 腦梗死患者隨訪期血管事件發(fā)生Cox比例風(fēng)險模型分析 將隨訪期是否發(fā)生血管事件作為應(yīng)變量，將性別、年齡、高血壓、糖尿病、LDL升高、有無吸煙、四個位點的基因型和腦梗死分型等作為自變量進(jìn)行Cox比例風(fēng)險模型分析：高血壓病(RR=1.46，95%CI：1.06～3.64，P= 0.018)，糖尿病(RR=1.34，95%CI：1.01～3.02，P= 0.036)和攜帶rs9333025 GG基因型(RR=1.87，95%CI：1.16～5.36，P= 0.003)為腦梗死患者隨訪期血管事件發(fā)生的獨立危險因素，見表6。

表6 血管事件發(fā)生Cox回歸分析

3 討論

本研究主要目的是研究編碼20-HETE合成酶相關(guān)基因多態(tài)性與腦梗死之間的潛在關(guān)聯(lián)。結(jié)果表明，CYP4A11rs9333025多態(tài)性是腦梗死發(fā)生的獨立的危險因素，而CYP4A11rs2269231、CYP4F2 rs2108622和rs3093135則與腦梗死無明顯的相關(guān)性。這一結(jié)果與其他學(xué)者研究結(jié)果相吻合[9，10]?；谶@些研究結(jié)果，分析可能原因為CYP4A11 多態(tài)性可影響CYP4A11酶的活性，有助于20-HETE的產(chǎn)生，從而導(dǎo)致腦梗死發(fā)病風(fēng)險的增加。

然而本研究結(jié)果與某些報道有差異，如Lasker等認(rèn)為[1]，AA轉(zhuǎn)化為20-HETE過程中CYP4F2是CYP4A11的10倍，同時顯示抗 CYP4F2治療抑制腎微粒體中20-HETE的形成的效果為抗CYP4A11治療的2倍。Ward等[11]研究表明，是CYP4F2基因而不是CYP4A11基因與20-HETE分泌增加和血壓有關(guān)。有研究表明CYP4F2基因多態(tài)性與缺血性腦卒中獨立相關(guān)[4，11]。然而，本研究結(jié)果沒有發(fā)現(xiàn)CYP4F2基因多態(tài)性與腦梗死的發(fā)病相關(guān)。造成差異的原因尚不清楚，一個可能的原因是在分子水平有較多因素對腦梗死的發(fā)病有關(guān)，另一個原因可能是由于種族差異，此外，腦梗死是一組多種危險因素引起的復(fù)雜疾病，目前基因多態(tài)性與之關(guān)系的分析已成為研究熱點[12]，但疾病不僅取決于基因-基因、還取決于基因-環(huán)境相互作用的結(jié)果[13]，本研究沒有分析基因-基因交互作用對腦梗死發(fā)病的影響，這可能也是差異的原因之一。

目前相關(guān)基因多態(tài)性與腦梗死易感性研究多為病例對照研究，前瞻性隊列研究少。本研究對腦梗死患者進(jìn)行前瞻性隨訪12個月，發(fā)現(xiàn)CYP4A11rs9333025 GG與腦梗死后隨訪期血管事件發(fā)生密切相關(guān)，Cox 比例風(fēng)險模型分析表明攜帶 rs9333025 GG基因型的腦梗死患者是腦梗死后血管事件發(fā)生的獨立危險因素。

本研究結(jié)果提示，CYP4A11多態(tài)性不僅與腦梗死易感性相關(guān)，而且與腦梗死后血管事件發(fā)生密切相關(guān)。其機制還不完全清楚?？赡蹸YP4A11基因編碼CYP4A11酶的活性，參與了花生四烯酸代謝為20-HETE。20-HETE在腦血管的調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要作用：它可以促進(jìn)氧自由基的形成，導(dǎo)致血管內(nèi)皮功能障礙[14]；可抑制 Na+，K+-ATP酶活性，是腦血管強效收縮因子[15]；激活細(xì)胞內(nèi)的信號傳導(dǎo)通路導(dǎo)致細(xì)胞凋亡和細(xì)胞死亡[16]。實驗研究已表明，抑制20-HETE的合成減少TIA后的腦梗死面積和改善預(yù)后[17]。

本研究尚存較多局限，首先，20-HETE水平?jīng)]有測定，不能確定CYP4A11和CYP4F2基因多態(tài)性與20-HETE水平之間的相關(guān)性；其次，本研究樣本量偏少，僅限于兩個中心研究，因此我們的結(jié)果還有待于更大樣本量和多中心研究來證實；第三，較多的CYP通路基因可能與腦梗死發(fā)病有關(guān)，本研究則主要集中在編碼CYPω-羥化酶相關(guān)CYP基因的研究，因此未來的研究應(yīng)該關(guān)注更多的候選基因。

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Correlation between Cytochrome (CYP) 4A11 genetic polymorphisms and cerebral infarction

LIAO Duan-xiu1，CHEN Hong1，YI Xing-yang1，HE Ni1，WANG Chun1，LIN Jing2

(1.Department of Neurology，Deyang People’s Hospital，Deyang 618000，China；2.Department of Neurology，The Third Affiliated Hospital，Wenzhou Medical College，Wenzhou 325200，China)

YIXing-yang

Objective To evaluate the associations between 4 single-nucleotide polymorphisms (SNPs) from the two genes and ischemic stroke as well as atherothrombotic events after stroke.Methods Three hundred and ninety-six patients with ischemic stroke and 378 controls were genotyped for 4 SNPs of the CYP4A11 gene (rs2269231 and rs9333025) and CYP4F2 gene (rs2108622 and rs3093135) using the method of matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS).All patients were followed up 12-months for atherothrombotic events.Results The frequency of GG genotype of rs9333025 was significantly higher in the ischemic stroke patients than that in controls (P< 0.001).Multiple logistic regression analysis showed that rs9333025 GG was significantly associated with higher risk of ischemic stroke (OR= 1.82，95%CI = 1.24～5.04，P= 0.016).The rs9333025 GG was significantly associated with higher atherothrombotic events than rs9333025 AG during 12 months after stroke (P= 0.04).Multiple Cox regression analysis revealed that the rs9333025 GG was an independent risk factor for atherothrombotic events after adjustment for confounding factors (RR= 1.87，95% CI = 1.16-5.36，P= 0.003).Conclusion rs9333025 GG genotype increases susceptibility to ischemic stroke，and is associated with high frequencies of atherothrombotic events in stroke patients.

Stroke； Cytochrome P450； Genetics； Variants； CYP4 A1l； CYP4F2

R743.33

A

1672-6170(2016)04-0059-05

四川省衛(wèi)生和計劃生育委員會科研基金資助項目(編號：140025)

易興陽

2015-09-23；

2016-05-23)