張 磊，粟 珊，張 茂

(四川省宜賓市第一人民醫(yī)院，四川 宜賓 644000)

應(yīng)用紫外分光光度法測定人血白蛋白中氨濃度

張 磊，粟 珊，張 茂

(四川省宜賓市第一人民醫(yī)院，四川 宜賓 644000)

目的 探討紫外分光光度法測定人血白蛋白中氨濃度的價值，加強藥劑科對人血白蛋白的管理。方法 將同一生產(chǎn)批號的人血白蛋白中加入過量定量的鎢酸鈉溶液、硫酸溶液，使蛋白沉淀的同時，氨與硫酸形成硫酸銨留在濾液中，再加入酚顯色劑、堿性次氯酸鈉溶液顯色后于波長630 nm處測定吸光度。結(jié)果 人血白蛋白內(nèi)的氨在10～300 μmol/L范圍內(nèi)的濃度與吸光度呈良好的線性關(guān)系，本方法具有較好的精密度、穩(wěn)定性及回收率。結(jié)論 紫外分光光度法測定人血白蛋白中氨濃度方法簡單、準(zhǔn)確，易于操作，適合基層醫(yī)院監(jiān)測人血白蛋白內(nèi)的氨濃度。

人血白蛋白；氨；紫外分光光度法

人血白蛋白系由乙肝疫苗免疫健康人的血漿或血清中分離提取制成的外源性白蛋白制劑，對增加循環(huán)血容量和維持血漿膠體滲透壓有很好的作用。然而輸注人血白蛋白也可引起一些不良反應(yīng)，甚至誘發(fā)肝性腦病，其原因與人血白蛋白內(nèi)可能含有一定濃度的氨有關(guān)。以往有報道[1]發(fā)現(xiàn)國產(chǎn)血制品存放時間越久，其中含有的氨濃度越高。而鑒于存在一定的技術(shù)難度及條件限制，人血白蛋白內(nèi)氨濃度的測定在基層醫(yī)院中很少開展。本研究結(jié)合現(xiàn)有實驗條件，探討檢測人血白蛋白內(nèi)氨濃度的簡單易行方法，為患者提供安全保障，為藥劑科對人血白蛋白的管理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 電子天平BN-V9型(昆山巨天儀器設(shè)備有限公司)；紫外可見分光光度儀 Lambda 25型(美國Perkin-Elmer公司)；離心沉淀器80-2型(江蘇金南儀器制造有限公司)；液體快速混勻器SK-1型(江蘇金壇市天竟實驗儀器廠)；電熱恒溫水箱HH-W420型(江蘇金壇市國旺實驗儀器廠)；人血白蛋白注射液(同路生物制藥有限公司，25 ml:5 g，生產(chǎn)批號:20141023)；鎢酸鈉；硫酸銨；亞硝基鐵氰化鈉；苯酚；氫氧化鈉；次氯酸鈉；硫酸，所用試劑均為分析純，水為新制無氯蒸餾水。

1.2 方法 將同一生產(chǎn)批號的新鮮人血白蛋白注射液(距離生產(chǎn)日期30天內(nèi))采用紫外分光光度法檢測其內(nèi)部的氨濃度。同時，對于該方法下的精密度、穩(wěn)定性、回收率進行評定。①無氨水的制備:參考文獻[2]取重蒸水1000 ml，加入稀硫酸1 ml與高錳酸鉀溶液1 ml，蒸餾即得備用。②酚顯色劑:取亞硝基鐵氰化鈉25.0 mg，與適量苯酚混合后加無氨水至100 ml，過濾即得。③堿性次氯酸鈉溶液:取次氯酸鈉250 mg，氫氧化鈉2500 mg，溶于100 ml無氨水中即得。同時配制0.5 mmol/L硫酸溶液、5 mmol/L硫酸銨溶液。④分別取③中配制的5 mmol/L硫酸銨溶液100、200、500、1000、1500、2000、3000 μl置于50 ml容量瓶內(nèi)，加無氨水定容至刻度，即得10、20、50、100、150、200、300 μmol/L的硫酸銨標(biāo)準(zhǔn)溶液。⑤標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備[1]:將④中的標(biāo)準(zhǔn)溶液1 ml分別加入10%鎢酸鈉溶液、0.5 mol/L硫酸溶液各0.5 ml，震蕩離心，取上清液1 ml，再加入酚顯色劑、堿性次氯酸鈉溶液各1 ml，水浴后以空白管校正后在630 nm處測定吸光度，將所得的吸光度(見表1)對濃度進行線性回歸處理。⑥回收率試驗:按照④中的方法配制三個濃度(100、50、10 μmol/L)的硫酸銨標(biāo)準(zhǔn)溶液適量，各取1 ml分別精密加入10%鎢酸鈉溶液、0.5 mol/L硫酸溶液各0.5 ml，再通過與酚顯色劑、堿性次氯酸鈉溶液反應(yīng)顯色后，測定OD值，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計算測得量與回收率。⑦精密度實驗:配制低、中、高(25、50、75 μmol/L)3個濃度的硫酸銨溶液各3份，日內(nèi)4 ℃冷藏保存，每間隔1 h測定OD值1次，連續(xù)測定5次。另取相同樣本4 ℃冷藏保存，每日測定1次，連續(xù)測定5日。所得到的OD值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線換算成氨濃度，評估精密度。⑧白蛋白樣本的測定及穩(wěn)定性試驗:1 ml新鮮的人血白蛋白注射液中加入過量定量的10%鎢酸鈉溶液、0.5 mol/L硫酸溶液，使其蛋白質(zhì)完全沉淀，其中的氨與硫酸生成硫酸銨，再以酚顯色劑、堿性次氯酸鈉溶液顯色后于波長630 nm處測定OD值，共測定8次。取硫酸銨溶液適量配制成75 μmol/L硫酸銨溶液，加入等量的新鮮人血白蛋白注射液。經(jīng)上述方法處理后，分別取1 ml置于30 ℃及4 ℃下保存。30 ℃下保存的樣本在1 d內(nèi)每間隔2 h測定1次，每次測定5份，共測定8次；4 ℃下保存的樣本每天定時測量1次，每次平行測定5份，連續(xù)測定7 d，共測定8次；將所得到的OD值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線換算成游離氨濃度，評估穩(wěn)定性。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理。計量資料的表示采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差，組間比較采用t檢驗。P< 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性關(guān)系 標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。計算回歸方程OD=0.002C+0.266(r=0.999，P< 0.01)。

圖1 氨的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 穩(wěn)定性 根據(jù)回歸方程計算得出新鮮的人血白蛋白注射液中氨濃度為(25.98±2.32) μmol/L，見表1。

2.3 回收率 見表2。

2.4 精密度 見表3。

3 討論

白蛋白是人體細胞外液中含量最多的蛋白質(zhì)，由585個氨基酸組成，分子量約66.2 kD。其中白蛋白40%分布于血液，60%分布于細胞外液中，循環(huán)半衰期約16～18 h[3]。肝硬化患者由于肝功能受損，引起白蛋白合成減少，易引起低白蛋白血癥。輸注人血白蛋白是糾正低白蛋白血癥的常用方法。人血白蛋白中白蛋白含量在96%以上[4]。上世紀(jì)80年代時有報道[1]提出:一些國產(chǎn)人血白蛋白注射液的氨濃度為97～199 μmol/L，而正常人血氨濃度為20～60 μmol/L。這些血制品中的氨濃度超過了正常人血氨上限，一旦肝衰竭患者輸注此類藥物則可能誘發(fā)昏迷。然而，該報道中沒有提到對人血白蛋白中氨的具體檢測方法，且之后未再見到類似的報道。時隔近30年，人血白蛋白的生產(chǎn)工藝較前有了一定進步，是否其中還含有一定濃度的氨尚不清楚。大多數(shù)醫(yī)院的檢驗科由于技術(shù)設(shè)備受限，沒有開展對人血白蛋白內(nèi)氨濃度的檢測。本研究結(jié)合現(xiàn)有實驗條件，建立了一套對人血白蛋白內(nèi)的氨濃度檢測的簡易方法，易于操作，且具有較好的精密度、穩(wěn)定性及回收率。

表1 氨濃度穩(wěn)定性試驗

*與第1次(0)比較，P< 0.05

表2 氨回收率試驗

表3 氨濃度精密度試驗

本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，新鮮的人血白蛋白內(nèi)含有微量的氨，氨的濃度在4 ℃條件下不會隨著保存時間的延長而顯著增多，而在30 ℃保存條件下，24 h內(nèi)人血白蛋白中的氨濃度則會顯著升高，而人體正常的血氨濃度為20～60 μmol/L[5]。因此，人血白蛋白在4 ℃保存條件下具有較好的安全性:不會產(chǎn)生高濃度的氨，不會引起人體血氨濃度的增高、誘發(fā)肝性腦病。人血白蛋白內(nèi)含有微量的氨，可能與其制備原料-血漿中含有一定濃度的代謝性氨有關(guān)。

通過檢測人血白蛋白內(nèi)的氨濃度，能夠為患者提供安全保障，也為藥劑科對人血白蛋白的管理提供了依據(jù)。

[1] 張木森.肝硬化病例靜脈輸入血制品引起肝昏迷5例報告[J].空軍總醫(yī)院學(xué)報，1987，3(2):159-160.

[2] 中華人民共和國藥典委員會.中華人民共和國藥典(二部)[S].2005年版.2005，附錄:134.

[3] 安友仲.合理應(yīng)用人血白蛋白-正確認識生理物質(zhì)在病理過程中的作用[J].中國臨床營養(yǎng)雜志，2008，16(1):1-4.

[4] 陳新謙，金有豫.新編藥物學(xué)[M].第14版.北京:人民衛(wèi)生出版社，1998:633.

[5] 李影林.臨床醫(yī)學(xué)檢驗手冊[M].吉林:吉林科學(xué)技術(shù)出版社，1990:503.

R917

A

1672-6170(2016)01-0078-04

宜賓市重點科技計劃項目(編號:2014SF011)；宜賓市衛(wèi)生局醫(yī)學(xué)科研項目

2015-06-04；

2015-09-13)