趙曉艷,曾志馳,穆麗麗,鄧 悅,王 飛

(江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院,江西 南昌 330045)

蛋白酶高產(chǎn)菌株的篩選鑒定與酶學(xué)特性研究

趙曉艷,曾志馳,穆麗麗,鄧 悅,王 飛*

(江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院,江西 南昌 330045)

摘要：以酪蛋白水解圈為篩選標記,在以酪蛋白為唯一氮源的平板上,從土壤中分離篩選到3株高產(chǎn)蛋白酶的菌株,經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定和16S rRNA分析,將其分別鑒定為Bacillus sp. G1、Bacillus sp. G2、Stenotrophomonas sp. V1。將這3株菌株的發(fā)酵液通過硫酸銨分級沉淀初步純化后,其比酶活分別為22.21、19.10和16.03 U/mg。菌株Bacillus sp. G1和Bacillus sp. G2所產(chǎn)蛋白酶的最適反應(yīng)溫度和最適反應(yīng)pH值均為40 ℃和7.0；菌株Stenotrophomonas sp. V1所產(chǎn)蛋白酶的最適反應(yīng)溫度為70 ℃,最適酶反應(yīng)pH值為 7.5。

關(guān)鍵詞：蛋白酶；篩選；鑒定；酶學(xué)特性； Bacillus sp. G1； Bacillus sp. G2； Stenotrophomonas sp. V1

蛋白酶(Protease, EC 3.4)屬于水解酶類,是最重要的三大工業(yè)用酶之一,銷售額約占全球酶制劑市場的60%[1],被廣泛應(yīng)用于食品、釀造、醫(yī)藥、紡織、皮革、日用化學(xué)、洗滌劑、飼料以及水產(chǎn)加工等多個行業(yè),在我國國民經(jīng)濟的發(fā)展中起著重要的作用[2]。產(chǎn)生蛋白酶的微生物種類繁多,細菌、病毒、真菌、原生動物等皆有報道[3-4]。目前,用于蛋白酶工業(yè)生產(chǎn)的菌株多為地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、短小芽孢桿菌等[4-5]。在已知的3000多種蛋白酶中,絕大多數(shù)來源于常溫生物,其作用的溫度、pH值、離子強度范圍均較窄,從而在應(yīng)用上受到限制。因此,耐受低溫、高溫、鹽、酸、堿的蛋白酶越來越受到關(guān)注[6-10]。在尊重生物多樣性的基礎(chǔ)上,尋找和開發(fā)新型微生物蛋白酶資源,仍然具有重要的科研、應(yīng)用及商業(yè)價值。

本研究以酪蛋白為底物,從土壤中分離篩選到3株產(chǎn)蛋白酶的菌株,通過形態(tài)和16S rRNA序列測定對這3株菌株進行了鑒定,并對3株菌所產(chǎn)蛋白酶的酶學(xué)特性進行了初步研究，以期為開發(fā)新的微生物蛋白酶制劑提供菌株資源。

1材料與方法

1.1材料與試劑

Foline-phenol試劑、酪氨酸、酪蛋白、Tris-平衡酚、葡萄糖、胰蛋白胨、酵母提取物均購于國藥集團化學(xué)試劑有限公司。牛血清蛋白、考馬斯亮藍G250、溶菌酶、蛋白酶K、Taq DNA聚合酶購于上海博彩生物科技有限公司。

篩選培養(yǎng)基：可溶性淀粉2 g、酪蛋白1.0 g、K2HPO40.05 g、MgSO4· 7H2O 0.05 g、NaCl 0.05 g、FeSO4· 7H2O 0.001 g、瓊脂2 g、水100 mL, pH 7.2～7.4。

產(chǎn)酶培養(yǎng)基：牛肉膏0.3 g、酪蛋白1.0 g、瓊脂2.0 g、NaCl 0.5 g、蒸餾水100 mL, pH 7.6～7.8。

LB培養(yǎng)基(L)：酵母粉 5.0 g、胰蛋白胨10.0 g、NaCl 10.0 g, pH 7.0～7.2。

1.2主要儀器與設(shè)備

SHIMADZU UV-2401紫外可見分光光度計,日本SHIMADZU公司； Beckman臺式高速冷凍離心機(Allegra X-22R)，美國Beckman公司； DYCP-31C水平核酸電泳儀，北京六一公司。

1.3試驗方法

1.3.1菌株篩選從江西南昌、上高、銅鼓等地采集土樣,稀釋涂布于篩選培養(yǎng)基,在30 ℃下培養(yǎng)2 d,將有水解圈的菌株反復(fù)在篩選培養(yǎng)基上劃線純化。

1.3.2菌株鑒定 將菌株劃線純化,挑取單菌落進行革蘭氏染色,鏡檢。用高鹽法[11]提取各產(chǎn)酶菌株的總DNA；以DNA作模板,利用16S rRNA基因的通用引物27f：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’(E.colibases 8 to 27)和1492r：5’-TACCTTGTTACGACT T-3’(E.colibases 1507 to 1492)[12]進行PCR擴增,擴增反應(yīng)體系為：10×Taq聚合酶反應(yīng)緩沖液5L、dNTP(20 mmol/L)4L、引物(25 pmol/L)各1L、Mg2+(25 mmol/L)4L、菌體DNA(約50 ng/L)1L、Taq DNA聚合酶(5 U/L)0.5L,用滅菌雙蒸水補至50L。反應(yīng)條件：95 ℃變性5 min,95 ℃ 30 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 1.5 min,30個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。

PCR產(chǎn)物經(jīng)0.75%瓊脂糖凝膠電泳純化后，將其送至南京金斯瑞生物科技有限公司測序。對測得的16S rRNA基因序列在GenBank中進行Blast比對,下載高同源性菌株的16S rRNA基因序列,并加入大腸桿菌E.coliATCC 11775T的16S rRNA基因序列作為外參,用MEGA version 5.05軟件包中的Cluster W進行同源聚類分析。然后利用鄰接法(Neighbor-Joining)1000次泊松校驗構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[13]。

1.3.3鹽析按0%～20%、20%～40%、40%～60%、60%～80%、80%～100%的硫酸銨飽和梯度進行分級沉淀。操作步驟：將粗酶液量好體積,倒入燒杯中,燒杯內(nèi)放置磁性轉(zhuǎn)子,將燒杯置于冰上,打開磁力攪拌器。按粗酶液的體積緩慢加入硫酸銨,使飽和度達到20%,然后在4 ℃下以13000 r/min的轉(zhuǎn)速離心20 min,對沉淀以少量不含硫酸銨的20 mmol/L Tris-HCl (pH 7.4)重懸,測定蛋白含量和酶活；對上清繼續(xù)添加硫酸銨,使飽和度達到40%,重復(fù)以上步驟,直至飽和度達到100%為止[14]。計算收集的各級沉淀的蛋白含量與酶活。取比酶活較高的分級沉淀蛋白,以少量20 mmol/L Tris-HCl (pH 7.4)重懸。

1.3.4最適反應(yīng)溫度測定將適量粗酶液加入至20 mmol/L Tris-HCl(pH 7.5)的測活體系中,將反應(yīng)體系分別放置于40、50、60、70 ℃條件下,反應(yīng)30 min后加入三氯乙酸終止,用Foline-Phenol試劑顯色后測定OD680,實驗設(shè)置3個重復(fù)[15]。

1.3.5最適反應(yīng)pH測定將適量的粗酶液加入至不同pH值的緩沖液體系中，測定酪蛋白水解酶活力,緩沖液為：檸檬酸緩沖液(pH 4.0～6.0)、磷酸鹽緩沖液(pH 6.0～8.0)、Tris-HCl緩沖液(pH 7.5～9.0)和甘氨酸-NaOH緩沖液(pH 9.0～12.0),各緩沖液濃度皆為20 mmol/L。酶活性測定反應(yīng)在最適溫度條件下進行,反應(yīng)時間為30 min。重復(fù)3次,以最大酶活為對照(100%),比較粗酶液在不同pH條件下的相對酶活[16]。

1.4酶活測定

酶活測定參照文獻[2, 7]中的方法進行。酶活力單位定義：每分鐘水解酪蛋白產(chǎn)生1 μg酪氨酸所需的蛋白量(mg)為一個酶活力單位。

1.5蛋白含量測定

按Bradford方法進行,以牛血清蛋白作為標準蛋白,具體操作見參考文獻[17]。

2結(jié)果與分析

2.1菌株篩選結(jié)果

從江西上高、銅鼓、南昌等地采集土樣,稀釋分離后涂布于以酪蛋白為唯一氮源的平板上,以酪蛋白水解圈為篩選標記進行篩選,選取水解圈/菌落直徑較大的菌株劃線純化,得到3株菌株。菌落形態(tài)見圖1。

挑取單菌落,革蘭氏染色后鏡檢,菌體染色結(jié)果見圖2。由圖2可見：菌株G1和G2產(chǎn)芽孢,不膨大,芽孢中生,革蘭氏染色陽性,菌體大小(0.8～1.0)μm×(2.0～3.0)μm;菌株V1不產(chǎn)芽孢,革蘭氏染色陰性,菌體大小(0.2～0.5)μm×(0.8～1.0) μm。

將菌株G1、G2、V1分別接種于液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基,在30 ℃下以180 r/min搖瓶培養(yǎng)48 h,以6000 r/min離心10 min；取上清液5 μL點樣于酪蛋白平板,在30 ℃下反應(yīng)30 min,觀察粗酶液對酪蛋白的水解效果。從圖2 d～圖2f可以看出，3株菌的發(fā)酵液均對酪蛋白有較好的水解效果。

2.2菌株鑒定及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

用高鹽法提取各產(chǎn)酶菌株的總DNA,以DNA作模板,利用16S rRNA基因的通用引物27f和1492r進行PCR擴增,PCR產(chǎn)物經(jīng)0.75%瓊脂糖凝膠電泳后檢測其純度，結(jié)果如圖3所示。

a:菌株G1菌落(正面); b:菌株G2菌落(正面); c:菌株V1菌落(正面)。

a:菌株G1革蘭氏染色； b:菌株G2革蘭氏染色； c:菌株V1革蘭氏染色； d:菌株G1粗酶液在酪蛋白平板上的水解圈； e:菌株G2粗酶液在酪蛋白平板上的水解圈； f:菌株V1粗酶液在酪蛋白平板上的水解圈。

圖23株產(chǎn)蛋白酶菌株的菌體形態(tài)及其粗酶液活性檢測

1：5000 Plus核酸Marker；2：陰性對照；3：菌株G1 16S rRNA；

對3株菌株構(gòu)建16S rRNA系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果(圖4～圖6)顯示：菌株G1與巨大芽孢桿菌(Bacillusmegatherium)16S rRNA聚為一類(相似性97%)；菌株G2與阿耶波多芽孢桿菌(BacillusaryabhattaiB8W22)16S rRNA聚為一類(相似性98%)；菌株V1與寡養(yǎng)單胞菌(StenotrophomonaschelatiphagaLPM-5)16S rRNA聚為一類(相似性100%)。因此,分別將這3株菌命名為Bacillussp. G1、Bacillussp. G2和Stenotrophomonassp. V1。

2.3鹽析結(jié)果

采用鹽析法對粗酶液進行分級沉淀,在不同濃度的硫酸銨飽和溶液中,酶活力、蛋白含量和比酶活測定結(jié)果見圖7。

由圖7可知：菌株Bacillussp. G1的粗酶液在60%～80%硫酸銨飽和濃度的沉淀中有較高的比酶活(22.21 U/mg),其單位酶活為114.53 μg/(min·mg)；菌株Bacillussp. G2的粗酶液在80%～100%硫酸銨飽和濃度的沉淀中有較高的比酶活(19.10 U/mg),其單位酶活為106.50 μg/(min·mg)；菌株Stenotromonassp. V1的粗酶液在60%～80%硫酸銨飽和濃度的沉淀中有較高的比酶活(16.03 U/mg),其單位酶活為107.03 μg/(min·mg)。

圖4　菌株Bacillus sp. G1 16S rRNA系統(tǒng)發(fā)育樹

圖5　菌株Bacillus sp. G2 16S rRNA系統(tǒng)發(fā)育樹

2.4反應(yīng)溫度對酶活性的影響

分別取適量的鹽析后的酶液在不同溫度下進行反應(yīng),測定酶反應(yīng)的最適溫度。以各溫度條件下的最高酶活為對照(100%),繪制溫度-相對酶活曲線。由圖8可知：菌株Bacillussp. G1和Bacillussp. G2所產(chǎn)蛋白酶的最適反應(yīng)溫度為40 ℃,在50 ℃時其相對酶活為78%,在30 ℃條件下相對酶活分別為60%和30%。當(dāng)溫度達60 ℃以上時失去活力,表明這兩株菌所產(chǎn)的蛋白酶為中溫蛋白酶；菌株Stenotromonassp. V1所產(chǎn)蛋白酶的最適反應(yīng)溫度為70 ℃,在40～60 ℃時其相對酶活為60%,但在30 ℃和80 ℃時均失去活力,表明該菌株所產(chǎn)的蛋白酶為高溫蛋白酶。

2.5反應(yīng)pH值對酶活性的影響

分別取適量的鹽析后的酶液在不同pH條件下進行反應(yīng),酶反應(yīng)溫度選取各自的最適溫度。以各pH條件下的最高酶活為對照(100%),繪制pH值-相對酶活曲線，見圖9。

圖6　菌株Stenotromonas sp. V1 16S rRNA系統(tǒng)發(fā)育樹

a： Bacillus sp. G1菌株粗酶液鹽析結(jié)果; b： Bacillus sp. G2菌株粗酶液鹽析結(jié)果; c：Stenotromonas sp. V1菌株粗酶液鹽析結(jié)果。

從圖9可見：菌株Bacillussp. G1所產(chǎn)蛋白酶的最適酶反應(yīng)pH值為7.5,當(dāng)pH在8.5以上和5.0以下時,其相對酶活喪失；在pH為6時,其相對酶活為35%, pH為8時相對酶活為98%, pH為7時相對酶活為80%(圖9-a)。表明該菌株所產(chǎn)蛋白酶為中性蛋白酶。

菌株Bacillussp. G2所產(chǎn)蛋白酶的最適酶反應(yīng)pH值為7.5,當(dāng)pH在8.5以上和4.0以下時,其相對酶活喪失;在pH為6時,其相對酶活為34%, pH為8時相對酶活為8%, pH為7時相對酶活為80%(圖9-b),表明該菌株所產(chǎn)蛋白酶為中性蛋白酶。

菌株Stenotrophomonassp. V1所產(chǎn)蛋白酶的最適酶反應(yīng)pH值為8.0,當(dāng)pH在10以上和5以下時,其相對酶活喪失；在pH為9時,其相對酶活為18%, pH為6時在檸檬酸緩沖液中很難測出酶活(4%), pH為7.5時相對酶活為80%(圖9-c),表明該菌株所產(chǎn)蛋白酶為堿性蛋白酶。

3討論

本研究獲得的3株高產(chǎn)蛋白酶菌株中,Bacillussp. G1和Bacillussp. G2所產(chǎn)蛋白酶均為常溫中性蛋白酶；對這兩株菌株通過鹽析初步分級純化后，所得蛋白酶的比酶活分別為22.21和19.10 U/mg,與已報道的芽孢桿菌所產(chǎn)蛋白酶活力[18-19]相比不占優(yōu)勢,但通過培養(yǎng)條件優(yōu)化后有望提高,具有一定的應(yīng)用潛力。

圖8　3株菌株所產(chǎn)蛋白酶的最適反應(yīng)溫度

a：菌株Bacillus sp. G1; b：菌株Bacillus sp. G2; c：菌株Stenotrophomonas sp. V1。

嗜麥芽窄食單胞菌(Stenotrophomonasmaltophilia),又稱嗜麥芽黃單胞菌、嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌。由于該菌產(chǎn)生的蛋白酶多為高溫堿性蛋白酶,因此具有較高的工業(yè)開發(fā)和應(yīng)用價值,其相關(guān)研究近年來在國際上越來越受到重視。如來源于嗜麥芽窄食單胞菌PO-1的絲氨酸堿性蛋白酶,其分子量為36.0 kDa,最適pH 9.0,最適反應(yīng)溫度60 ℃[20]；來源于Stenotrophomonasmaltophiliastrain S-1的堿性蛋白酶SmP-1，其分子量約為40.0 kDa,最適pH 12.0,最適反應(yīng)溫度50 ℃[21]。

菌株Stenotrophomonassp. V1所產(chǎn)的蛋白酶為高溫堿性蛋白酶,通過鹽析初步分級純化后所得蛋白酶的比酶活為16.03 U/mg,最適反應(yīng)溫度為70 ℃,最適酶反應(yīng)pH為7.5,與已報道的寡營養(yǎng)單胞菌所產(chǎn)堿性蛋白酶相比,其酶活力均高于從Stenotrophomonasmaltophiliastrain PO-1和Stenotrophomonasmaltophiliastrain S-1發(fā)酵液中所分離的堿性蛋白酶的,顯示出很大的應(yīng)用潛力。

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(責(zé)任編輯：黃榮華)

Research on Screening, Identification and Enzymological Characteristics of Strains with High Yield of Protease

ZHAO Xiao-yan, ZENG Zhi-chi, MU Li-li, DENG Yue, WANG Fei*

(College of Bioscience and Bioengineering, Jiangxi Agricultural University, Nanchang 330045, China)

Abstract：Three bacteria strains producing protease were screened and isolated from soil by observation of clearing zones on casein agar plates, based on phenotypic and 16S rRNA gene phylogenetic analysis, G1, G2 and V1 were preliminary classed and named as Bacillus sp. G1, Bacillus sp. G2 and Stenotrophomonas sp. V1. Bacillus sp. G1, Bacillus sp. G2 and Stenotrophomonas sp. V1 were all aerobic strains. The proteases from Bacillus sp. G1, Bacillus sp. G2 and Stenotrophomonas sp. V1 were purified by the methods of ammonium sulfate precipitation, the specific activities of three proteases were up to 22.21 U/mg, 19.10 U/mg and 16.03 U/mg, respectively. The enzymes from Bacillus sp. G1 and G2 were optimally active at 40 ℃ and in 20 mmol/L phosphate buffered saline buffer(PBS, pH 7.0), and the alkaline protease from Stenotrophomonas sp. V1 was optimally active at 70 ℃ and in 20 mmol/L PBS buffer (pH 7.5).

Key words：Protease; Screening; Identification; Enzymological characteristics; Bacillus sp. G1; Bacillus sp. G2; Stenotrophomonas sp. V1

收稿日期：2015-10-07

基金項目：國家自然科學(xué)基金地區(qū)科學(xué)基金項目(31560031)。

作者簡介：趙曉艷(1995─),女,從事生物與工程方面的研究。*通訊作者：王飛。

中圖分類號：TQ925.2

文獻標志碼：A

文章編號：1001-8581(2016)04-0032-07