焦 云，舒巧云，劉珠琴，章建紅

(寧波市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院 林業(yè)研究所，浙江 寧波 315040)

楊梅S-SAP分子標(biāo)記體系的建立及應(yīng)用

焦 云，舒巧云，劉珠琴，章建紅

(寧波市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院 林業(yè)研究所，浙江 寧波 315040)

摘要：基于楊梅全基因組Ty1-copia類(lèi)型逆轉(zhuǎn)座子LTR序列設(shè)計(jì)開(kāi)發(fā)S-SAP引物組合，利用48份楊梅試材對(duì)其多態(tài)性指數(shù)進(jìn)行評(píng)價(jià)，使用UPGMA(Unweighted Pair Group Method with Arithmatic Mean)法，構(gòu)建了系統(tǒng)聚類(lèi)樹(shù)，并進(jìn)行了二維和三維主坐標(biāo)分析，進(jìn)而探討了楊梅種質(zhì)資源遺傳親緣關(guān)系。成功開(kāi)發(fā)了18個(gè)楊梅S-SAP引物組合，共擴(kuò)增獲得3739個(gè)條帶，平均每個(gè)引物組合可擴(kuò)增208個(gè)條帶(100～500 bp)，每個(gè)引物組合擴(kuò)增條帶數(shù)量范圍為98～292，Shannon信息指數(shù)范圍為0.2041～0.4522。其中，引物組合JY20的多態(tài)性最高，可擴(kuò)增出292個(gè)條帶。基于18個(gè)S-SAP引物組合，使用UPGMA法構(gòu)建所有試材的系統(tǒng)聚類(lèi)樹(shù)，結(jié)果共分為3個(gè)組及3個(gè)亞組。聚類(lèi)分析與主坐標(biāo)分析結(jié)果高度相似，具有相同地域來(lái)源的品種大部分被劃分于同一個(gè)分組，使用聚類(lèi)分析與主坐標(biāo)分析所得結(jié)果基本一致，但是聚類(lèi)結(jié)果與果實(shí)色澤沒(méi)有明顯的關(guān)聯(lián)性，利用三維主坐標(biāo)分析更能全面且真實(shí)地反映楊梅品種間的親緣關(guān)系。

關(guān)鍵詞：楊梅；S-SAP；分子標(biāo)記；遺傳多樣性

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，現(xiàn)在DNA分子標(biāo)記技術(shù)已有數(shù)十種，廣泛應(yīng)用于遺傳育種、基因組作圖、基因定位、物種親緣關(guān)系鑒別、基因庫(kù)構(gòu)建、基因克隆等方面。其中，逆轉(zhuǎn)座子分子標(biāo)記之一的S-SAP(Sequence-Specific Amplification Polymorphism)是根據(jù)AFLP演變而來(lái)，其擴(kuò)增的多態(tài)性一方面來(lái)源于限制性位點(diǎn)及其兩側(cè)序列的變異，與AFLP檢測(cè)的變異相同；另一方面來(lái)源于LTR 5′末端的變異和反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子插入位點(diǎn)的變異，在理論上其多態(tài)性高于AFLP。與其他類(lèi)型分子標(biāo)記相比，S-SAP分子標(biāo)記的多態(tài)性較高，利用其評(píng)價(jià)獲得的植物分類(lèi)及進(jìn)化分析結(jié)果更接近于基于地理和形態(tài)上的分析結(jié)果，進(jìn)而可以非常有效地進(jìn)行品種或基因型的鑒定，尤其在芽變性狀的鑒定方面更具靈敏性[1-2]，因此，它被認(rèn)為是多態(tài)性最豐富、靈敏度最高、反映的多態(tài)信息含量最多的一種分子標(biāo)記類(lèi)型。

目前，S-SAP分子標(biāo)記技術(shù)已經(jīng)成功應(yīng)用于葡萄[1]、蘋(píng)果[2]、桃[3]等果樹(shù)的遺傳多樣性分析，由于逆轉(zhuǎn)座子引物的開(kāi)發(fā)具有種族特異性，不同物種之間的逆轉(zhuǎn)座子引物異質(zhì)性很大，至今尚無(wú)S-SAP分子標(biāo)記技術(shù)在楊梅遺傳多樣性分析應(yīng)用的報(bào)道。本研究基于前期楊梅全基因組測(cè)序結(jié)果，深入挖掘Ty1-copia類(lèi)逆轉(zhuǎn)座子長(zhǎng)末端重復(fù)序列LTR(Long Terminal Repeat)信息，并建立適合于楊梅的S-SAP分子標(biāo)記技術(shù)體系，為進(jìn)一步利用該標(biāo)記開(kāi)展楊梅遺傳多樣性分析及相關(guān)基因組學(xué)研究奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

從不同省份收集48份楊梅材料用于S-SAP分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)及遺傳多樣性分析，具體來(lái)源見(jiàn)表1。從健康植株上分別采集無(wú)病蟲(chóng)害的嫩葉，放入預(yù)先準(zhǔn)備好的液氮中迅速冷凍，然后轉(zhuǎn)入-80 ℃冰箱中保存，楊梅基因組DNA使用快速離心柱型植物基因組DNA提取試劑盒(目錄號(hào)：DP3112，百泰克)進(jìn)行提取。

表1　48份實(shí)驗(yàn)材料相關(guān)信息

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1S-SAP分子標(biāo)記引物設(shè)計(jì)使用逆轉(zhuǎn)座子預(yù)測(cè)軟件LTR_STRUC version 1.1對(duì)楊梅全基因組DNA序列進(jìn)行分析。在預(yù)測(cè)結(jié)果數(shù)據(jù)中優(yōu)先選擇兩端LTR序列相似度大于99%的逆轉(zhuǎn)座子，使用Primer Premier 5.0并參考3′端LTR區(qū)域序列，設(shè)計(jì)S-SAP分子標(biāo)記中選擇性擴(kuò)增所需的下游引物，在設(shè)計(jì)該引物時(shí)僅選擇從本區(qū)域5′端第一個(gè)堿基開(kāi)始，同時(shí)替換第一個(gè)堿基為錯(cuò)配堿基，設(shè)計(jì)引物長(zhǎng)度為19～23 bp，在特異選擇性擴(kuò)增引物末端添加4個(gè)選擇性堿基(GAG、CGT、GGT、TCC)，從而形成不同引物組合，同時(shí)在其5′端添加18 bp的通用引物序列(M13)TGTAAAACGACGGCCAGT，Tail中的5′端分別添加3種不同的熒光基團(tuán)，即FAM、HEX和PET，用于后期使用遺傳分析儀進(jìn)行擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)與分析。相關(guān)引物序列見(jiàn)表2，委托上海英駿生物技術(shù)有限公司合成，用超純水溶解。

1.2.2雙酶切、預(yù)擴(kuò)增及選擇性擴(kuò)增具體方法參照相關(guān)文獻(xiàn)[3]進(jìn)行。

1.2.3基因型分型檢測(cè)與數(shù)據(jù)分析取上述選擇性擴(kuò)增產(chǎn)物等比例混合后，委托上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司在ABI 3730遺傳分析儀上進(jìn)行檢測(cè)。擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小用Genemapper 4.0(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)軟件進(jìn)行讀數(shù)，只統(tǒng)計(jì)長(zhǎng)度范圍在100～500 bp內(nèi)的擴(kuò)增產(chǎn)物片段，然后使用Microsoft Excel 2007構(gòu)建數(shù)據(jù)矩陣表(1表示有條帶，0表示無(wú)條帶)；使用POPGENE Version 1.32軟件計(jì)算所有引物組合的Shannon信息指數(shù)和有效等位基因數(shù)；基于Dice系數(shù)[4]計(jì)算遺傳距離，使用非加權(quán)組平均法(UPGMA)及Free Tree Version 0.9.1.50軟件進(jìn)行聚類(lèi)分析，其中bootstrap值設(shè)置為1000，聚類(lèi)圖的修改使用Tree view 1.6.6軟件；基于Dice系數(shù)的遺傳距離使用NTSYS-pc Version 2.1軟件進(jìn)行主坐標(biāo)分析。

表2　本研究中S-SAP分子標(biāo)記引物組合信息表

注：M和E之后的小寫(xiě)字母代表選擇性堿基。

2結(jié)果與分析

2.1S-SAP引物組合多態(tài)性分析

基于楊梅全基因組DNA序列，使用LTR_STRUC version 1.1軟件分析預(yù)測(cè)逆轉(zhuǎn)座子LTR位點(diǎn)，在預(yù)測(cè)結(jié)果中選擇3個(gè)LTR區(qū)域相似度大于99%且長(zhǎng)度大于150 bp的Ty1-copia逆轉(zhuǎn)座子進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，共設(shè)計(jì)24個(gè)引物組合用于選擇性擴(kuò)增，隨機(jī)選擇8個(gè)楊梅品種進(jìn)行引物組合的預(yù)篩選及有效性鑒定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：18個(gè)引物組合成功擴(kuò)增，占總引物的75%；然后使用48份楊梅試材對(duì)這些引物組合進(jìn)行多態(tài)性評(píng)價(jià)，結(jié)果共擴(kuò)增出3739個(gè)100～500 bp的條帶，平均每個(gè)引物可擴(kuò)增208個(gè)條帶(表3)。此外，平均有效等位基因位點(diǎn)數(shù)量和Shannon信息指數(shù)分別為1.3750和0.3599。每個(gè)引物組合擴(kuò)增條帶數(shù)量范圍為3～193，其中，引物組合JY20的多態(tài)性最高，可擴(kuò)增出292個(gè)條帶，Shannon信息指數(shù)為0.4481。

表3　S-SAP引物組合特征信息表

注：Ne代表有效等位基因數(shù)；I代表Shannon遺傳多樣性指數(shù)。

2.2楊梅種質(zhì)資源遺傳多樣性分析

基于18個(gè)S-SAP引物組合并使用UPGMA構(gòu)建48份試材的遺傳親緣關(guān)系聚類(lèi)樹(shù)(圖1)，共分為3個(gè)組及3個(gè)亞組。A組包含有A-1、A-2、A-3亞組。A-1亞組包括19份試材，包括荸薺和白楊梅等主栽品種。J2015-9、J2015-10、J2015-11為早熟優(yōu)株，它們與荸薺品種劃分于同一分支，意味著它們可能與荸薺品種的親緣關(guān)系比較近。A-2亞組包括有9份試材，主要為大果類(lèi)型品種，例如東魁、瑞光及來(lái)自浙江麗水的J2015-6等。A-3亞組主要是來(lái)自廣東的楊梅品種。B組包括有12份試材，其中包括來(lái)自江蘇的著名品種大浮大葉細(xì)蒂和大浮小葉細(xì)蒂。而C組品種均來(lái)自于江蘇。

基于Nei等[4]遺傳距離系數(shù)進(jìn)行主坐標(biāo)分析，前3個(gè)主坐標(biāo)的方差貢獻(xiàn)率分別為8.7%、7.4%和5.0%(圖2-Ⅰ)，通過(guò)比較圖1和圖2可以看出,系統(tǒng)聚類(lèi)分析和主坐標(biāo)分析所得結(jié)果基本上一致。但是值得注意的是，圖2-Ⅰ中A-3亞組的27號(hào)樣品在聚類(lèi)分析(圖1)及圖2-Ⅱ中均被劃分于B組；另外，其B組中的4和15號(hào)樣品在聚類(lèi)分析(圖1)以及三維主坐標(biāo)分析(圖2-Ⅱ)均劃分于C組，除此以外，其他品種的分類(lèi)結(jié)果一致，由此可知，盡管聚類(lèi)分析與三維主坐標(biāo)分析結(jié)果完全一致，但是后者能夠進(jìn)一步從不同方向、不同層次展示各品種間的親緣關(guān)系。

圖1　48份楊梅試材UPGMA聚類(lèi)樹(shù)

Ⅰ.二維散點(diǎn)圖；Ⅱ.三維散點(diǎn)圖；A-1、A-2、A-3和

3討論與結(jié)論

在前期研究中，一些DNA分子標(biāo)記技術(shù)，例如AFLP、ISSR和SSR已經(jīng)廣泛應(yīng)用于楊梅遺傳多樣性研究分析中[5-15]。然而，盡管大量的分子標(biāo)記相繼被開(kāi)發(fā)，但是還不夠全面且多態(tài)性普遍較低，在同等條件下用于鑒定同等數(shù)量植物品種及基因型則需要較高的實(shí)驗(yàn)成本。事實(shí)上，每種分子標(biāo)記技術(shù)都是基于不同原理，但它們都或多或少可以反映來(lái)自基因組的變異[16]；其中，S-SAP是一種基于基因組中普遍存在的、多拷貝、高度異質(zhì)、插入位點(diǎn)多態(tài)的反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的分子標(biāo)記，其技術(shù)體系比較成熟，也是多態(tài)性及靈敏度最高的分子標(biāo)記之一，可以高效地進(jìn)行植物品種鑒定，目前已在柑橘[16]、番茄[17]、萵苣[18]等植物上得到應(yīng)用。本研究共獲得18個(gè)S-SAP引物組合，平均每個(gè)引物組合可擴(kuò)增獲得208個(gè)條帶，遠(yuǎn)高于前期研究中AFLP分子標(biāo)記的多態(tài)性(39.3個(gè)條帶)[12]、ISSR分子標(biāo)記(4.9個(gè)條帶)[6]、SSR分子標(biāo)記多態(tài)性(8.3個(gè)條帶)[5]。由此可見(jiàn)，S-SAP分子標(biāo)記對(duì)于品種鑒定具有更高的多態(tài)性和檢測(cè)效率。此外，基于前期的研究基礎(chǔ)[3,19]，在選擇性擴(kuò)增過(guò)程中加入一個(gè)嵌有熒光基團(tuán)的通用引物M13，并在選擇性擴(kuò)增引物上游添加M13序列，該方法可以較大幅度降低實(shí)驗(yàn)成本，避免了使用傳統(tǒng)聚丙烯酰胺凝膠電泳及銀染等繁瑣的操作方法，同時(shí)大幅度提高了檢測(cè)分辨率，可以廣泛應(yīng)用于今后楊梅遺傳多樣性分析研究及基因組學(xué)的深入開(kāi)展。

通過(guò)對(duì)48份楊梅試材的聚類(lèi)分析發(fā)現(xiàn)，聚類(lèi)結(jié)果與地域來(lái)源具有較為密切的關(guān)系，但是聚類(lèi)分析以及主坐標(biāo)分析結(jié)果均表明與果實(shí)色澤性狀沒(méi)有較為明顯的聯(lián)系，意味著楊梅果實(shí)色澤性狀的形成具有較為復(fù)雜的遺傳決定機(jī)制，具體原因還需要今后進(jìn)一步探索研究，該結(jié)果與前期研究一致[5,9]。另外，聚類(lèi)分析中B組中的大浮烏梅和馬山白楊梅均為來(lái)自江蘇的品種，它們聚在一個(gè)獨(dú)立的分支且遠(yuǎn)離其他品種，由此可見(jiàn)，兩者具有較為獨(dú)特的遺傳背景。同時(shí)，值得注意的是，圖2-Ⅰ中A-3亞組的27號(hào)樣品在主坐標(biāo)三維散點(diǎn)圖中(圖2-Ⅱ)被劃分于B組，事實(shí)上從后者圖中可以看出，27號(hào)樣品與B組樣品的三維空間距離較小，說(shuō)明它們之間的親緣關(guān)系更為接近，故而將其劃分于B組更能真實(shí)反映品種間的親緣關(guān)系，該結(jié)果與聚類(lèi)分析結(jié)果一致，然而，三維主坐標(biāo)分析能提供更加全面且豐富的信息。因此，在基于相同遺傳距離計(jì)算方法的條件下，可以優(yōu)先選擇采用三維主坐標(biāo)分析的方法。

總之，本研究中所構(gòu)建的S-SAP分子標(biāo)記體系具有高效、穩(wěn)定和便捷的特點(diǎn)；此外，利用該分子標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行遺傳多樣性分析能夠較為真實(shí)地反映品種之間的親緣關(guān)系，因此，該技術(shù)可為今后在楊梅遺傳多樣性等方面研究提供有效的手段。

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(責(zé)任編輯：曾小軍)

Establishment and Application of S-SAP Molecular Marker System in Chinese Bayberry (Myricarubra)

JIAO Yun, SHU Qiao-yun, LIU Zhu-qin, ZHANG Jian-hong

(Institute of Forestry, Ningbo Academy of Agricultural Science, Ningbo 315040, China)

Abstract：Designed S-SAP markers based on the LTR (long terminal repeat) sequences of Ty1-copia retrotransposons, used them for DNA profiling of 48 individuals of Chinese bayberry, evaluated the index of polymorphism, constructed a distance tree using clustering with UPGMA, and two-dimensional and three-dimensional plot principal coordinate analysis (PCO) were performed to analyze the genetic relationship of the Chinese bayberry samples. Successfully obtained amplicons from 18 primer combinations, analyzed yielded an average of 208 fragments per primer combination, adding up to a total of 3739 polymorphic fragments whose sizes ranged from 100 to 500 base pairs (bp). The number of markers for each genotype ranged from 98 to 292, and Shannon’s information index ranged from 0.2041～0.4522. The primer combination JY20 generated a total of 292 bands and was the most polymorphic. Reconstructed a UPGMA tree based on the above-mentioned 18 S-SAP markers, which were further divided into three groups and three subgroups. The cluster analysis and principal coordinate analysis results showed that the accessions in the same geographical region were more closely related than those from different regions, and which did not correlate with fruit color, using the three-dimensional plot of the PCO analysis could be more fully and more truly explain the genetic relationships of samples.

Key words：Chinese bayberry; S-SAP; Molecular markers; Genetic diversity

收稿日期：2015-09-24

基金項(xiàng)目：寧波市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院院長(zhǎng)基金(2015NKYP001)。

作者簡(jiǎn)介：焦云(1983─)，男，河北石家莊人，副研究員，博士，研究方向：果樹(shù)遺傳育種與栽培技術(shù)。

中圖分類(lèi)號(hào)：S667.6

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1001-8581(2016)04-0001-06