趙建波，王豪勛，張 玲，趙曉靜，張中冕，周士霞, 段芳齡，馬 軍

鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院1. 消化內(nèi)科；2腫瘤內(nèi)科，河南 鄭州 450014；3. 河南省腫瘤醫(yī)院肝膽外科

原發(fā)性肝癌組織中CAIX蛋白的表達(dá)及其與微血管密度的關(guān)系

趙建波1，王豪勛2，張 玲3，趙曉靜1，張中冕2，周士霞2, 段芳齡1，馬 軍1

鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院1. 消化內(nèi)科；2腫瘤內(nèi)科，河南 鄭州 450014；3. 河南省腫瘤醫(yī)院肝膽外科

目的 研究原發(fā)性肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)中CAIX的表達(dá)及其與微血管密度(MVD)、臨床病理特征之間的關(guān)系。方法 采用組織芯片和免疫組化方法檢測(cè)HCC和癌旁組織中CAIX和CD34表達(dá)。結(jié)果 共收集41例HCC、36例癌旁組織，其中37例HCC和27例癌旁組織有病例資料。CAIX的表達(dá)在HCC和癌旁組織間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但HCC組織中CAIX包膜陽(yáng)性表達(dá)率高于癌旁組織，而CAIX胞漿陽(yáng)性表達(dá)率低于癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.05)。HCC組織MVD明顯高于癌旁組織(P<0.05)。CAIX陽(yáng)性的HCC和癌旁組織中MVD均高于CAIX陰性患者，但只有癌旁組織中CAIX陽(yáng)性組和陰性組間MVD差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論 CAIX的包膜表達(dá)是HCC的特異特征；CAIX高表達(dá)HCC患者，血管再生活躍；CAIX可作為HCC治療的潛在靶點(diǎn)。

原發(fā)性肝癌；CAIX蛋白；微血管密度

我國(guó)的原發(fā)性肝癌(hepatocellular carcinoma, HCC)發(fā)病主要由乙肝發(fā)展而來，隨著近幾年乙肝疫苗接種的普遍推廣，我國(guó)的乙肝、及乙肝相關(guān)肝癌發(fā)病率將逐漸降低[1]。但HCC是我國(guó)常見腫瘤之一，根據(jù)2015年國(guó)家腫瘤登記年報(bào)，我國(guó)HCC的發(fā)病率居第四位(21.35/10萬)，死亡率居第二位(18.43/10萬)，男性發(fā)病率更高。河南作為乙肝高發(fā)區(qū)，HCC的發(fā)病率位居惡性腫瘤發(fā)病率第五位(27.04/10萬人)，死亡率第四位(23.22/10萬人)。

目前HCC的發(fā)生機(jī)制尚不明確，基因表達(dá)水平異常是HCC發(fā)生和發(fā)展過程中的常見事件，但是哪些基因的異常是HCC發(fā)生的驅(qū)動(dòng)基因仍不明確。目前，HCC的靶向藥物索拉菲尼已經(jīng)在臨床應(yīng)用，但療效更好的靶向藥物亟待開發(fā)，因此，仍然需要探索更多和HCC相關(guān)的基因改變[2]。肝細(xì)胞發(fā)生癌變的早期即可由于細(xì)胞的快速生長(zhǎng)而改變周圍氧代謝狀態(tài)，從而引起基因表達(dá)異常。CAIX是碳酸酐酶同工酶家族的成員，在腫瘤組織中，可被缺氧誘導(dǎo)因子-1(HIF-1)激活而表達(dá)升高，在多種腫瘤中表達(dá)明顯升高[3]，對(duì)于HCC中CAIX的表達(dá)情況雖有少量報(bào)道[4-7]，但其臨床和病理意義尚未完全闡明。本研究利用組織芯片免疫組化方法檢測(cè)CAIX的表達(dá)，分析其在HCC和癌旁組織中的差異，及CAIX與微血管密度(microvessel density，MVD)的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2005年-2006年河南省腫瘤醫(yī)院肝膽外科HCC及其癌旁組織 (距腫塊3 cm)標(biāo)本，全部病例均為初治患者，術(shù)前均未行化療、放療或其他治療。共收取41例HCC組織標(biāo)本、36例癌旁組織標(biāo)本；其中37例HCC組織和27例癌旁組織有病例資料。本課題經(jīng)過醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)和患者知情同意。

1.2 主要試劑 HCC組織芯片制作由陜西超英公司協(xié)助完成。CAIX兔抗人多克隆抗體(上海生工，AB20346a)；CD34(D155253)；二抗檢測(cè)試劑盒為DAKO公司產(chǎn)品(K4065, K5007)。

1.3 組織芯片免疫組化方法 組織芯片常規(guī)二甲苯脫蠟、梯度酒精水化，一抗孵育(4 ℃，過夜)，洗片后加二抗(1∶300)孵育2 h，洗片后加DAB顯色劑，蘇木素復(fù)染，中性樹脂封片。CAIX濃度為1∶100，CD34濃度為1∶300。用PBS代替一抗作為陰性對(duì)照，預(yù)實(shí)驗(yàn)中的陽(yáng)性HCC組織作為陽(yáng)性對(duì)照。

1.4 結(jié)果判定 染色結(jié)果根據(jù)染色強(qiáng)度和染色細(xì)胞數(shù)量百分比判定。染色強(qiáng)度分為4級(jí)(無、弱、中、強(qiáng)染色分別為0、1、2、3分)，染色細(xì)胞數(shù)分為4級(jí)(0～10%、11%～25%、26%～50%、>50%分別記為0、1、2、3分)，根據(jù)兩項(xiàng)的乘積1分以下為陰性、2分以上為陽(yáng)性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)或校正χ2檢驗(yàn)；正態(tài)分布的計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)，非正態(tài)分布的計(jì)量資料采用兩獨(dú)立樣本的非參數(shù)檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HCC和癌旁組織中的CAIX表達(dá) CAIX在HCC組織中的陽(yáng)性表達(dá)率為56.1%(23/41)，在癌旁組織中的陽(yáng)性表達(dá)率為58.3%(21/36)，兩者相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；但是CAIX在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)模式差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。HCC組織中CAIX包膜陽(yáng)性表達(dá)率為12.2%(5/41)，而癌旁組織陽(yáng)性表達(dá)率只有2.8%(1/36)；HCC組織CAIX胞漿陽(yáng)性表達(dá)率為29.3%(12/41)，癌旁組織為55.6%(20/36)；HCC組織CAIX胞漿+包膜陽(yáng)性表達(dá)率為14.6%(6/41)，而癌旁組織CAIX無胞漿+包膜表達(dá)(見圖1)。HCC組織中CAIX包膜陽(yáng)性表達(dá)率高于癌旁組織，而胞漿陽(yáng)性表達(dá)率低于癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

所收集的標(biāo)本中，有臨床資料的HCC組織有37例、癌旁組織有27例。其中HBsAg陽(yáng)性患者30例(81.1%)；年齡≤60歲的患者31例(83.8%)；男性患者30例(81.1%)(見表1)。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，無論是HCC組織，還是癌旁組織，CAIX表達(dá)均與HBsAg、年齡、性別、遠(yuǎn)處或淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、被膜侵犯和切緣是否癌細(xì)胞陽(yáng)性無相關(guān)性(P均>0.05)。

表1 HCC組織中CAIX表達(dá)和病理臨床資料的相關(guān)性 [例數(shù)(%)]

Tab 1 Correlation between CAIX expression in HCC and clinical pathological data [n(%)]

例數(shù)HCC組織中CAIX陽(yáng)性表達(dá)例數(shù)癌旁組織中CAIX陽(yáng)性表達(dá)年齡(歲) ≤603117(54.8)2313(56.5) >6062(33.3)43(75.0)性別 男3016(53.3)2113(61.9) 女73(42.9)63(50.0)HBsAg 陽(yáng)性3016(53.3)2111(52.4) 陰性73(42.9)65(83.3)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 有63(50.0)44(100) 無3116(51.6)2312(52.2)

續(xù)表1

例數(shù)HCC組織中CAIX陽(yáng)性表達(dá)例數(shù)癌旁組織中CAIX陽(yáng)性表達(dá)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移 有63(50.0)53(60.0) 無3116(51.6)2213(59.1)包膜侵犯 有219(42.9)1710(58.9) 無1610(62.5)106(60.0)切緣 陽(yáng)性2312(52.2)1912(63.2) 陰性147(50.0)84(50.0)

2.2 HCC和癌旁組織CAIX和MVD的關(guān)系 本組織芯片中每個(gè)標(biāo)本大小為1 mm2，計(jì)數(shù)全部視野中CD34陽(yáng)性染色的血管數(shù)，計(jì)算微血管個(gè)數(shù)。根據(jù)文獻(xiàn)[8]報(bào)道的方法，其中相連的陽(yáng)性血管計(jì)為1個(gè)，不計(jì)有平滑肌組織的血管，不計(jì)直徑超過8個(gè)紅細(xì)胞的血管。研究發(fā)現(xiàn)，HCC組織中MVD為(59.38±57.02)個(gè)/mm2，癌旁組織(28.76±25.53)個(gè)/mm2，兩者相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.042)。HCC組織中，CAIX陽(yáng)性組MVD為(71.9±63.0)/mm2，CAIX陰性組MVD為(43.4±45.2)/ mm2；兩組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.06)。癌旁組織中，CAIX陽(yáng)性組MVD為(38.0±27.7)/mm2，CAIX陰性組為(15.9±15.1)/mm2；兩組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.008)。因各組MVD值不符合正態(tài)分布，以上結(jié)果均使用兩獨(dú)立樣本非參數(shù)檢驗(yàn)。癌旁組織中，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽(yáng)性組和陰性組MVD有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異外(P=0.034)，年齡、性別、HBsAg、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、被膜侵犯、切緣侵犯與MVD無明顯相關(guān)性；HCC組織中的MVD與年齡、性別、HBsAg、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、被膜侵犯、切緣侵犯均無明顯相關(guān)性。

3 討論

3.1 HCC和癌旁組織中CAIX的表達(dá)模式不同 碳酸酐酶(CA)的同工酶至少有16種，有些同工酶存在于細(xì)胞質(zhì)，有些為跨膜蛋白，有些分布于線粒體，有些存在于唾液或乳汁中。CAIX是一種跨膜蛋白酶，是由人宮頸癌細(xì)胞系中發(fā)現(xiàn)的，最初命名為MN，隨后發(fā)現(xiàn)MN的氨基酸序列和已發(fā)現(xiàn)的CA的序列具有高度同源性，是CA的異構(gòu)酶，遂將其命名為CAIX。在已發(fā)表的文獻(xiàn)中，CAIX多表達(dá)于腫瘤組織，如在宮頸癌中的表達(dá)率高達(dá)90%，直腸癌、乳腺癌、膀胱癌、食管鱗癌、胰腺癌、肺癌等也有高表達(dá)[9-10]。CAIX在腫瘤組織中的高表達(dá)與組織學(xué)分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、不良預(yù)后明顯相關(guān)。除少數(shù)正常組織(如正常胃、膽管、小腸黏膜、胰腺、輸精管上皮)表達(dá)外，多數(shù)正常組織中不表達(dá)。CAIX是一種缺氧相關(guān)蛋白，可通過抑制E-Cadherin的表達(dá)，減少細(xì)胞間黏附，促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移[9,11]。

已有報(bào)道的HCC中，CAIX的表達(dá)率為48.5%[4]，且與年齡、性別、血清AFP、腫瘤大小、組織學(xué)分級(jí)、臨床分期相關(guān)，與患者的無進(jìn)展生存期、5年生存期(OS)也明顯相關(guān)。而Luong-Player等[6]在HCC中僅檢測(cè)到15%的陽(yáng)性率。

本研究中，HCC組織的陽(yáng)性表達(dá)率為56.1%，和臺(tái)灣人群相似，但癌旁組織中也有高達(dá)58.3%的表達(dá)率，HCC和癌旁組織無明顯差異。但是HCC組織中CAIX包膜陽(yáng)性表達(dá)率高于癌旁組織，而胞漿陽(yáng)性表達(dá)率低于癌旁組織。CAIX是一種跨膜蛋白，文獻(xiàn)中報(bào)道的免疫組化染色中，CAIX多表現(xiàn)為包膜著色。這種差異是否與所用抗體的結(jié)合表位有關(guān)，還是與局部組織缺氧情況差異有關(guān)，尚需要進(jìn)一步探討。另外，Warburg發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞在有氧情況下也會(huì)表現(xiàn)為糖酵解為主的代謝特征，稱為Warburg效應(yīng)；后人又根據(jù)CAIX、Glut-1、BNIP-3等蛋白的表達(dá)情況，將腫瘤組織氧代謝分為多種情況，如糖酵解型、非糖酵解型、線粒體功能正常和不正常型等[12]，是否在肝臟腫瘤發(fā)生過程中也存在著不同的局部代謝模式，還需要更深入的研究。從本研究結(jié)果可以看出，包膜或包膜和胞漿共表達(dá)的CAIX可以作為HCC特異指標(biāo)。

3.2 癌旁組織中CAIX陽(yáng)性表達(dá)的患者M(jìn)VD增高 惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展常常伴隨著局部組織破壞，新生血管生成。新生血管為腫瘤生長(zhǎng)提供了充足的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，并由此導(dǎo)致腫瘤進(jìn)一步生長(zhǎng)、浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移。檢測(cè)腫瘤組織新生血管的標(biāo)志物有CD34、CD105、CD31、CD146、vWF等，通過組織血管染色，計(jì)算血管密度，作為腫瘤新生血管活躍程度的指標(biāo)。CD34 是較早用于血管內(nèi)皮染色的標(biāo)志物，優(yōu)于其他幾種蛋白標(biāo)志[13]。本研究通過CD34染色發(fā)現(xiàn)，HCC的MVD值明顯高于癌旁組織，說明HCC組織中微血管新生活躍。

在一些惡性腫瘤中，CAIX的表達(dá)和HIF-1α、GLUT-1、VEGF有關(guān)，說明腫瘤的缺氧環(huán)境導(dǎo)致局部代謝環(huán)境變化，并促進(jìn)血管的增生，以便為腫瘤細(xì)胞提供更多的營(yíng)養(yǎng)。有文獻(xiàn)[14]報(bào)道，宮頸癌中缺氧環(huán)境下，CAIX高表達(dá)，并調(diào)控VEGF表達(dá)增多，通過血管再生促進(jìn)腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，但尚無文獻(xiàn)分析CAIX和MVD之間的聯(lián)系。本研究中，盡管癌組織微血管生成活躍，CAIX陽(yáng)性組的MVD值高于CAIX陰性組，但是統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果無明顯差異，因此需要進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量來探討腫瘤組織中兩者之間的關(guān)系。癌旁組織CAIX陽(yáng)性組的MVD值高于CAIX陰性組，并具有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。綜合上述結(jié)果，說明HCC患者不管在癌組織(盡管本研究中統(tǒng)計(jì)量未達(dá)到P<0.05)還是癌旁組織，CAIX表達(dá)增強(qiáng)，血管再生活躍，提示了CAIX作為腫瘤缺氧指標(biāo)的可靠性。

CAIX的表達(dá)增高是HCC細(xì)胞快速增殖、適應(yīng)缺氧環(huán)境的表現(xiàn)。通過CAIX的表達(dá)增多，調(diào)控其下游的信號(hào)通路，刺激血管再生，有利于癌細(xì)胞獲取營(yíng)養(yǎng)、生存、增殖。因此，通過抑制CAIX的高表達(dá)，阻斷腫瘤細(xì)胞血管再生的途徑，促進(jìn)其凋亡，可作為新的腫瘤精準(zhǔn)治療靶點(diǎn)[15]。Zhu等[16]在用西地尼布(Cediranib)治療的HCC患者中，發(fā)現(xiàn)外周血CAIX升高者治療效果差(OS短)。

[1]Rong G, Wang H, Bowlus CL, et al. Incidence and risk factors for hepatocellular carcinoma in primary biliary cirrhosis [J]. Clin Rev Allergy Immunol, 2015, 48(2-3): 132-141.

[2]Wang X, Zhang A, Sun H. Power of metabolomics in diagnosis and biomarker discovery of hepatocellular carcinoma [J]. Hepatology, 2013, 57(5): 2072-2077.

[3]黃勇, 朱耀, 姚旭東. 碳酸酐酶Ⅸ與腫瘤[J]. 中國(guó)癌癥雜志, 2008, 18(12): 941-946. Huang Y, Zhu Y, Yao XD. Carbonic anhydrase IX and tumor [J]. China Oncology, 2008, 18(12): 941-946.

[4]Huang WJ, Jeng YM, Lai HS, et al. Expression of hypoxic marker carbonic anhydrase IX predicts poor prognosis in resectable hepatocellular carcinoma [J]. PLoS One, 2015, 10(3): e0119181.

[5]Yu SJ, Yoon JH, Lee JH, et al. Inhibition of hypoxia-inducible carbonic anhydrase-IX enhances hexokinase Ⅱ inhibitor-induced hepatocellular carcinoma cell apoptosis [J]. Acta Pharmacol Sin, 2011, 32(7): 912-920.

[6]Luong-Player A, Liu H, Wang HL, et al. Immunohistochemical reevaluation of carbonic anhydrase IX (CA IX) expression in tumors and normal tissues [J]. Am J Clin Pathol, 2014, 141(2): 219-225.

[7]Kang HJ, Kim IH, Sung CO, et al. Expression of carbonic anhydrase 9 is a novel prognostic marker in resectable hepatocellular carcinoma [J]. Virchows Arch, 2015, 466(4): 403-413.

[8]Weidner N. Current pathologic methods for measuring intratumoral microvessel density within breast carcinoma and other solid tumors [J]. Breast Cancer Res Treat, 1995, 36(2): 169-180.

[9]McDonald PC, Dedhar S. Carbonic anhydrase IX (CAIX) as a mediator of hypoxia-induced stress response in cancer cells [J]. Subcell Biochem, 2014, 75: 255-269.

[10]Mahon BP, Pinard MA, McKenna R. Targeting carbonic anhydrase IX activity and expression. Molecules [J]. 2015, 20(2): 2323-2348.

[11]Kato Y, Yashiro M, Noda S, et al. Expression of a hypoxia-associated protein, carbonic anhydrase-9,correlates with malignant phenotypes of gastric carcinoma [J]. Digestion, 2010, 82(4): 246-251.

[12]Yu M, Zhou Q, Zhou Y, et al. Metabolic phenotypes in pancreatic cancer [J]. PLoS One, 2015, 10(2): e0115153.

[13]Rosca EV, Koskimaki JE, Rivera CG, et al. Anti-angiogenic peptides for cancer therapeutics [J]. Curr Pharm Biotechnol, 2011, 12(8): 1101-1116.

[14]Iwasaki K, Yabushita H, Ueno T, et al. Role of hypoxia-inducible factor-1α, carbonic anhydrase-IX, glucose transporter-1 and vascular endothelial growth factor associated with lymph node metastasis and recurrence in patients with locally advanced cervical cancer [J]. Oncol Lett, 2015, 10(4): 1970-1978.

[15]Kockar F, Yildrim H, Sagkan RI, et al. Hypoxia and cytokines regulate carbonic anhydrase 9 expression in hepatocellular carcinoma cells in vitro [J]. World J Clin Oncol, 2012, 3(6): 82-91.

[16]Zhu AX, Ancukiewicz M, Supko JG, et al. Efficacy, safety, pharmacokinetics, and biomarkers of cediranib monotherapy in advanced hepatocellular carcinoma: a phase Ⅱ study [J]. Clin Cancer Res, 2013, 19(6): 1557-1566.

Expression of carbonic anhydrase IX and its relationship with microvessel density in hepatocellular carcinoma

ZHAO Jianbo1, WANG Haoxun2, ZHANG Ling3, ZHAO Xiaojing1, ZHANG Zhongmian2, ZHOU Shixia2, DUAN Fangling1, MA Jun1

1. Department of Gastroenterology; 2. Department of Oncology, the Second Affiliated Hospital, Zhengzhou University, Zhengzhou 450014; 3. Department of Hepatic Surgery, He’nan Cancer Hospital, China

Objective To explore the expression of CAIX protein in hepatocellular carcinoma (HCC)and the relationship of its expression with microvessel density(MVD) and clinic-pathological characteristics.Methods Immunohistochemistry was used to detect the expressions of CAIX and CD34 in tissue array of HCC.Results Forty-one HCC (37 cases with clinic-pathological data) and corresponding 36 para-cancerous tissue (27 cases with clinic-pathological data) were collected. No difference was detected for CAIX expression between HCC tissue para-cancerous tissue(P>0.05). MVD(calculated by CD34 expression) in HCC tissue was higher than that in para-cancerous tissue(P<0.05). MVDs of patients with positive CAIX expression both in HCC tissue and para-cancerous tissue were higher than those with CAIX negative patients, but difference was only found in para-cancerous tissue(P<0.05).Conclusion HCC is characteristic for cellular membrane expression for CAIX protein. HCC patients with higher CAIX protein expression are accompanied with up-regulated microvessel regeneration.

Hepatocellular carcinoma; CAIX protein; Microvessel density

河南省醫(yī)學(xué)科技攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目、教育部留學(xué)人員科技活動(dòng)項(xiàng)目擇優(yōu)資助[2006]321

馬軍，E-mail: 843093451@qq.com

10.3969/j.issn.1006-5709.2016.07.022

R735.7

A

1006-5709(2016)07-0806-04

2016-05-10