徐 進(jìn)， 楊 潔，王 斌， 陳 珺， 劉 穎， 劉涵翰

湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬人民醫(yī)院 1.消化內(nèi)科； 2.健康管理中心； 3.病理科，湖北 十堰 442000

瑞巴派特對實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎大鼠腸道黏膜的保護(hù)作用

徐 進(jìn)1， 楊 潔2，王 斌1， 陳 珺1， 劉 穎1， 劉涵翰3

湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬人民醫(yī)院 1.消化內(nèi)科； 2.健康管理中心； 3.病理科，湖北 十堰 442000

目的 探討瑞巴派特對2, 4, 6-三硝基苯磺酸(TNBS)誘導(dǎo)的大鼠結(jié)腸炎的腸道黏膜保護(hù)作用及可能的作用機(jī)制。方法40只成年雌性SD大鼠隨機(jī)分為對照組(G1)、模型組(G2)、瑞巴派特治療組(G3)、奧沙拉嗪治療組(G4)，每組10只。連續(xù)治療結(jié)束后取病變段腸組織，行結(jié)腸大體損傷評分；結(jié)腸組織勻漿檢測白三烯B4(LTB4)含量、超氧化物歧化酶(SOD)及還原型谷胱甘肽(GSH-Px)活性；免疫組化法檢測結(jié)腸組織環(huán)氧合酶-2(COX-2)和5-脂氧合酶(5-LOX)的表達(dá)量；酶聯(lián)免疫吸附法檢測血清TNF-α、IL-10含量。 結(jié)果 治療后，與G2組比較，G3組和G4組的結(jié)腸大體損傷評分、血清TNF-α、IL-10水平、結(jié)腸組織LTB4水平均明顯降低，而SOD、GSH-Px的活性均明顯升高(P<0.05)。與G2組相比，G1、G3、G4組COX-2及5-LOX蛋白表達(dá)水平均明顯降低(P<0.05)。G1組COX-2和5-LOX蛋白表達(dá)極弱，與G3、G4組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。 結(jié)論 瑞巴派特對TNBS誘導(dǎo)的大鼠結(jié)腸炎有較好的治療作用，其作用機(jī)制可能與上調(diào)結(jié)腸組織中SOD及GSH-Px的活性、調(diào)節(jié)細(xì)胞因子、降低COX-2及5-LOX的表達(dá)有關(guān)。

潰瘍性結(jié)腸炎；瑞巴派特；環(huán)氧合酶-2；5-脂氧合酶

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis, UC)是一種病因、發(fā)病機(jī)制尚未完全明確的結(jié)直腸慢性非特異性炎性反應(yīng)。病變主要累及黏膜和黏膜下層，促炎與抗炎因子失衡及氧自由基損傷在UC發(fā)病過程中起重要作用[1]。瑞巴派特作為一種消化性潰瘍的胃腸黏膜保護(hù)劑，已被證明具有抗?jié)?、保護(hù)胃腸黏膜細(xì)胞、增加內(nèi)源性前列腺素合成、激活一氧化氮系統(tǒng)、清除自由基的作用[2]。臨床上應(yīng)用瑞巴派特治療UC取得一定的臨床療效[3]，但其對腸道黏膜的保護(hù)作用機(jī)制尚不清楚，本實(shí)驗(yàn)研究瑞巴派特在三硝基苯磺酸(TNBS)誘導(dǎo)的大鼠結(jié)腸炎模型中的治療作用，并試圖探討其可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與主要試劑 清潔級(jí)健康成年雌性未育Sprague-Dawley(SD)大鼠40只，體質(zhì)量200～220 g，由湖北醫(yī)藥學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供[許可證號(hào)：SCXK(鄂)2011-0008]，置于溫度為(22±1)℃，濕度為50%～70%的凈化動(dòng)物飼養(yǎng)房內(nèi)，混合飼料喂養(yǎng)，禁食不禁水。5%TNBS水溶液(美國Sigma公司)、瑞巴派特(浙江遠(yuǎn)力健藥業(yè))、奧沙拉嗪(天津力生制藥)、白三烯B4(LTB4)酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒(R&D Systems, Inc.)、還原型谷胱甘肽(GSH-Px)和超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒均購于南京建成生物工程研究所；TNF-α、IL-10 ELISA試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)、兔抗鼠COX-2多克隆抗體及兔抗鼠5-LOX多克隆抗體(美國Cayman Chemical公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 藥物配制：將5% TNBS 20 ml溶于50%乙醇溶液20 ml，制成2.5% TNBS(V/V)溶液；1片瑞巴派特(100 mg)溶于20 ml生理鹽水中；1片奧沙拉嗪(250 mg)溶于20 ml生理鹽水，制成溶液后備用。

1.2.2 UC模型建立及分組：40只雌性SD大鼠隨機(jī)分為對照組(G1)、模型組(G2)、瑞巴派特治療組(G3)、奧沙拉嗪治療組(G4)，每組10只。模型建立參照文獻(xiàn)[4]，大鼠禁食48 h后，G1組采用25%乙醇溶液灌腸，1.0 ml/只，其他組采用2.5% TNBS(V/V)溶液灌腸，1.0 ml/只。24 h后，G1、G2組：每天無菌生理鹽水灌胃，2.0 ml/只；G3組：每天瑞巴派特溶液灌胃，5 mg/kg；G4組：每天奧沙拉嗪溶液灌胃，125 mg/kg，共進(jìn)行10 d。

1.2.3 取材：治療結(jié)束后(第11天)，所有大鼠20%烏拉坦腹腔注射(1.5 ml/只)，麻醉后經(jīng)腹主動(dòng)脈無菌取血約2.0 ml，提取血清，-20 ℃保存，用于檢測TNF-α、IL-10水平。從距肛門1.0 cm向結(jié)腸近端切取6.0 cm腸段，縱行切開，用無菌生理鹽水洗凈內(nèi)容物，行大體損傷評分[5]。無損傷記0分，充血但無潰瘍記1分，充血且腸壁變厚，但無潰瘍記2分，有1處潰瘍但無腸壁增厚記3分，有2處或2處以上潰瘍/炎癥記4分，有2處或2處以上大潰瘍和炎癥或有1處潰瘍和炎癥沿結(jié)腸縱軸超過1 cm記5分，沿結(jié)腸縱軸損傷超過2 cm以上，每超過1 cm增加1分，記6～10分。

1.2.4 結(jié)腸勻漿檢測：結(jié)腸組織SOD、GSH-Px活性及LTB4含量的檢測分別按照試劑盒說明書的要求切取腸段，去除脂肪系膜組織。加冰生理鹽水低溫制備10%勻漿。-20 ℃貯存待檢測。

1.2.5 結(jié)腸組織COX-2、5-LOX免疫組化染色分析：取結(jié)腸病變部位組織，行免疫組化染色。細(xì)胞呈棕黃色為陽性，定位于細(xì)胞核和(或)細(xì)胞質(zhì)。陽性細(xì)胞比率按如下方法計(jì)算，在染色最強(qiáng)部位隨機(jī)選取3個(gè)視野，計(jì)算每只大鼠的平均陽性細(xì)胞比率，并按下述標(biāo)準(zhǔn)評分[6]：陽性細(xì)胞率≤5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，76%～100%為4分。

1.2.6 血清TNF-α、IL-10水平的測定：酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測，按照相應(yīng)試劑盒說明書操作。

2 結(jié)果

2.1 灌腸后大鼠的一般情況 灌腸造模10～24 h后，G2、G3及G4組大鼠出現(xiàn)腹瀉，解稀糊狀便、水樣便，伴黏液膿血，精神倦怠，皮毛無光澤，活動(dòng)、進(jìn)食減少；治療后，G3、G4組上述癥狀逐漸緩解，但G2組癥狀無明顯改善。而G1組大鼠僅出現(xiàn)解水樣便、糊狀便，3～4 d后恢復(fù)正常。整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間，無大鼠死亡。

2.2 瑞巴派特對結(jié)腸炎大鼠各指標(biāo)的影響 治療10 d 后，G3組結(jié)腸損傷大體評分、結(jié)腸組織LTB4水平較G2組顯著降低(P<0.05)，SOD、GSH-Px的活性較G2組顯著升高(P<0.05)。而G4組與G3組上述各指標(biāo)相比，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，見表1)。

組別只數(shù)大體評分LTB4(pg/ml)SOD(U/mg)GSH-Px(U/mg)G1100.52±0.56a186.26±22.14a204.21±6.86a43.89±0.28aG2105.30±0.55475.24±34.8656.41±4.158.05±0.17G3102.50±0.54b271.08±29.53b101.76±10.31b19.14±0.24bG4102.30±0.55b268.52±24.47b114.27±7.16b22.85±0.19b

注：與G2組比較，aP<0.01，bP<0.05。

2.3 結(jié)腸組織COX-2、5-LOX表達(dá) 在G1組的腸黏膜中，COX-2、5-LOX表達(dá)量極低；G2組的腸黏膜中可見大量胞質(zhì)染黃色或棕黃色的炎性細(xì)胞。G2組大鼠結(jié)腸組織COX-2、5-LOX表達(dá)水平較G3、G4組明顯增高(P<0.05)；G1組與其他三組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見表2、圖1)。

2.4 血清TNF-α、IL-10水平 G2、G3、G4組的血清TNF-α、IL-10水平明顯高于G1組(P<0.05)；G3、G4組的血清TNF-α、IL-10水平明顯低于G2組(P<0.05)；G3組與G4組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，見表2)。

圖1 免疫組化染色(400×) A：G2組結(jié)腸組織COX-2明顯表達(dá)；B：G3組結(jié)腸組織COX-2的表達(dá)明顯減少；C：G2組結(jié)腸組織5-LOX明顯表達(dá)； D：G3組結(jié)腸組織5-LOX的表達(dá)明顯減少

Fig 1 Immunohistochemistry staining (400×) A: COX-2 was significantly expressed in group G2; B: the expression of COX-2 was significantly decreased in group G3； C: 5-LOX was significantly expressed in group G2; D: the expression of 5-LOX was significantly decreased in group G3

組別只數(shù)TNF-α(pg/ml)IL-10(pg/ml)COX-2陽性積分5-LOX陽性積分G11034.2±2.8 25.1±2.60.25±0.180.22±0.16G21097.4±13.7a76.7±9.2a3.37±0.24a3.17±0.28aG31075.5±12.4ab55.8±14.4ab1.68±0.92ab1.05±0.29abG41074.2±11.6ab46.3±7.8ab1.55±0.21ab0.96±0.15ab

注：與G1組比較，aP<0.05；與G2組比較，bP<0.05。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),應(yīng)用瑞巴派特治療后，實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎大鼠臨床癥狀有所改善，且其大體損傷評分明顯降低，提示瑞巴派特對實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎有一定的治療作用，對腸黏膜損傷具有保護(hù)作用。Okayama等[5]用葡聚糖硫酸鈉(dextran sulfate sodium,DSS)誘導(dǎo)大鼠嚴(yán)重的結(jié)腸損傷，然后用瑞巴派特灌腸，發(fā)現(xiàn)由DSS誘導(dǎo)的損傷得到改善，結(jié)腸的黏液含量明顯提高，表明瑞巴派特對DSS誘導(dǎo)的大鼠結(jié)腸炎有效,其保護(hù)作用在于自由基的清除和促結(jié)腸黏液分泌。Miyata等[7]用瑞巴派特對1例抗生素及糖皮質(zhì)激素耐藥的重度隱窩炎患者進(jìn)行2次/d的灌腸治療(150 mg/次)，共8周，潰瘍愈合，隨訪11個(gè)月無復(fù)發(fā)，未見不良反應(yīng)。

氧自由基(oxygen free radicals，OFR)在UC發(fā)病機(jī)制中有重要作用。McKenzie等[8]發(fā)現(xiàn)UC患者活動(dòng)期腸黏膜中有大量OFR產(chǎn)生，直接或間接損傷腸黏膜上皮細(xì)胞。UC患者腸黏膜中抗氧化物質(zhì)含量降低，上皮細(xì)胞對氧化損傷反應(yīng)增強(qiáng)，增加腸黏膜的通透性[9]。UC患者口服卵磷脂超氧化物歧化酶(PC-SOD)可明顯改善疾病活動(dòng)指數(shù)，抗氧化劑治療可減輕結(jié)腸炎動(dòng)物模型腸道病理損傷，抑制或減少OFR有助于減輕炎性反應(yīng)，保護(hù)上皮細(xì)胞，改善腸黏膜通透性[10-11]。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠腸道氧化損傷明顯，表現(xiàn)為SOD和GSH-Px活性明顯降低，瑞巴派特可顯著上調(diào)SOD和GSH-Px活性，提示瑞巴派特具有明顯抗氧化作用。

細(xì)胞因子在腸道免疫反應(yīng)中起關(guān)鍵作用，致炎因子與抗炎因子之間的失衡均可導(dǎo)致炎癥性腸病的發(fā)生。研究[12]發(fā)現(xiàn)，UC患者血清及腸黏膜中TNF-α表達(dá)水平升高，提示TNF-α對UC發(fā)病有促進(jìn)作用。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)經(jīng)瑞巴派特治療后，結(jié)腸炎大鼠血清TNF-α水平明顯下降。Mitsuyama等[13]研究顯示，活動(dòng)性UC患者血清中IL-10含量與正常對照組比較明顯升高，并在恢復(fù)早期仍然升高，直到炎癥緩解后下降至正常水平。本研究結(jié)果與其類似，經(jīng)瑞巴派特、奧沙拉嗪治療后，隨著病情的緩解，IL-10呈不同程度的回落。

COX-2與5-LOX分別是花生四烯酸(arachidonic acid，AA)代謝的兩條主要途徑的關(guān)鍵酶。COX-2與UC的炎癥過程密切相關(guān)。5-LOX可以催化AA生成LTB4。LTB4作用在炎性細(xì)胞的LTB4受體上，主要介導(dǎo)炎性細(xì)胞向炎癥部位趨化，對中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞和效應(yīng)性T細(xì)胞具有極強(qiáng)的趨化作用，被認(rèn)為是UC中主要起作用的炎性介質(zhì)[14]。Mazzon等[15]敲除結(jié)腸炎模型小鼠的5-LOX基因，其炎癥程度明顯減輕。本研究顯示，經(jīng)瑞巴派特和奧沙拉嗪治療后LTB4均明顯降低，大鼠腸組織局部COX-2及5-LOX表達(dá)量顯著降低，推測瑞巴派特和奧沙拉嗪可能通過抑制腸組織局部COX-2及5-LOX表達(dá)，從而減輕腸組織局部黏膜損傷。

綜上所述，瑞巴派特治療實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎大鼠有一定效果，其潛在的可能作用機(jī)制是上調(diào)結(jié)腸組織中SOD及GSH-Px的活性、調(diào)節(jié)細(xì)胞因子水平、減少局部COX-2及5-LOX蛋白表達(dá)，從而減輕局部炎性反應(yīng)強(qiáng)度而緩解炎癥，但具體的作用機(jī)制仍需進(jìn)一步的研究證實(shí)。

[1]霍麗娟, 安麗婷, 師永盛. 美沙拉嗪聯(lián)合雙歧三聯(lián)活菌治療潰瘍性結(jié)腸炎的臨床療效觀察[J]. 中華消化雜志, 2012, 32(8): 523-527．

Huo LJ, An LT, Shi YS. The clinical efficacy of mesalazine and bifid-triple viable combination therapy in patients with ulcerative colitis [J]. Chin J Dig, 2012, 32(8): 523-527．

[2]李頡, 諸琦, 曹海霞, 等. 瑞巴派特對提高胃潰瘍愈合質(zhì)量的實(shí)驗(yàn)研究[J]. 中華消化雜志, 2008, 28(7): 451-455．

Li J, Zhu Q, Cao HX, et al. Effect of Rebamipide on the quality of gastric ulcer healing in rats [J]. Chin J Dig, 2008, 28(7)： 451-455．

[3]朱晚林, 葉秀津, 王章流, 等. 瑞巴派特保留灌腸治療潰瘍性結(jié)腸炎療效[J]. 中國藥師, 2009, 12(9): 1289-1290．

Zhu WL, Ye XJ, Wang ZL, et al. Therapeutic effect of Rebamipide enema retention therapy on ulcerative colitis [J]. China Pharmacist, 2009, 12(9): 1289-1290．

[4]Siddiqui A, Ancha H, Tedesco D, et al. Antioxidant therapy with N-acetylcysteine plus mesalamine accelerates mucosal healing in a rodent model of colitis [J]. Dig Dis Sci, 2006, 51(4): 698-705．

[5]Okayama M, Tsubouchi R, Nishio H. Protective effect of intra-rectal administration of rebamipide on dextran sulfate sodium-induced rat colitis [J]. Digestion, 2004, 70(4): 240-249.

[6]唐平飛， 李瑾， 賀文成， 等. 吉法酯對三硝基苯磺酸誘導(dǎo)大鼠實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎的作用[J].中華消化雜志， 2009, 29(9)： 554-558.

Tang PF, Li J, He WC, et al. The effects of Gefarnate in treatment of rat model of colitis induced by trinitrobenzene sulphonic acid [J]. Chin J Dig, 2009, 29(9): 554-558. [7]Miyata M, Konagaya T, Kakumu S, et al. Successful treatment of severe pouchitis with rebamipide refractory to antibiotics and cortiecosteroids: a case report [J]. World J Gastroenterol, 2006, 12(4): 656-658．

[8]McKenzie SJ, Baker MS, Buffinton GD, et al. Evidence of oxidant-induced injury to epithelial cells during inflammatory bowel disease [J]. J Clin Invest, 1996, 98(1): 136-141.

[9]Buffinton GD, Doe WF. Depleted mucosal antioxidant defences in inflammatory bowel disease [J]. Free Radic Biol Med, 1995, 19(6): 911-918．

[10]Suzuki Y, Matsumoto T, Okamoto S, et al. A lecithinized superoxide dismutase (PC-SOD) improves ulcerative colitis [J]. Colorectal Dis, 2008, 10(9): 931-934. [11]Giris M, Depboylu B, Do ru-Abbaso lu S, et al. Effect of taurine on oxidative stress and apoptosis-related protein expression in trinitrobenzene sulphonic acid-induced colitis [J]. Clin Exp Immunol, 2008, 152(1): 102-110.

[12]Tian L, Huang YX, Tian M, et al. Downregulation of electroacupuncture at ST36 on TNF-alpha in rats with ulcerative colitis [J]. World J Gastroenterol, 2003, 9(5): 1028-1033.

[13]Mitsuyama K, Tomiyasu N, Takaki K, et al. Interleukin-10 in the pathophysiology of inflammatory bowel disease：increased serum concentrations during the recovery phase [J]. Mediators Inflamm, 2006, (6): 26875.

[14]Hendel J, Nielsen OH. Expression of cyclooxygenase-2 mRNA in active inflammatory bowel disease [J]. Am J Gastroenterol, 1997, 92(7): 1170-1173.

[15]Mazzon E, Sautebin L, Caputi AP, et al. 5-lipoxygenase modulates the alteration of paracellular barrier function in mice ileum during experimental colitis [J]. Shock, 2006, 25(4): 377-383.

(責(zé)任編輯：李 健)

Protective effects of Rebamipide on colonic mucosa of experimental colitis in rats

XU Jin1, YANG Jie2, WANG Bin1, CHEN Jun1, LIU Ying1, LIU Hanhan3

1.Department of Gastroenterology; 2. Physical Examination Center; 3. Department of Pathology, Renmin Hospital, Hubei University of Medicine, Shiyan 442000, China

Objective To investigate the protective effects and mechanism of Rebamipide in 2,4,6-trinitrobenzene sulfonic acid (TNBS) induced colitis rats．Methods Forty female adult Sprague-Dawley (SD) rats were randomly divided into 4 groups: normal control group (G1), TNBS-induced colitis model group (G2), TNBS-induced colitis treated with Rebamipide group (G3) and TNBS-induced colitis treated with Olsalazine group (G4). Each group

its respective treatment. At the end of the experiment, colon tissue was collected for assessment of colonic mucosa damage score. LTB4 content, SOD and GSH-Px activity were detected. Expressions of COX-2 and 5-LOX in tissues were detected by immunohistochemistry. The serum levels of TNF-α and IL-10 were measured by ELISA. Results After treatment, compared with group G2, colonic mucosa damage score, LTB4 level, serum TNF-α and IL-10 were significantly decreased in group G3 and group G4, while SOD and GSH-Px activity were significantly increased (P<0.05). The expressions of COX-2 and 5-LOX were significantly lower in group G1, G3, G4 than those in group G2 (P<0.05)．Compared with group G3 and G4, the levels of COX-2 and 5-LOX were significantly decreased in group G1 (P<0.05).Conclusion The effects of Rebamipide in treatment of TNBS-induced colitis may be related to the mechanisms of up-regulating SOD and GSH-Px activity, regulating cytokine, and reducing the expressions of COX-2 and 5-LOX．

Ulcerative colitis; Rebamipide; Cyclooxygenase-2; 5-Lipoxygenase

10.3969/j.issn.1006-5709.2016.07.008

徐進(jìn)，碩士，主治醫(yī)師，研究方向：炎癥性腸病的基礎(chǔ)與臨床。E-mail：xujin200725@126.com

楊潔，碩士，副主任醫(yī)師，研究方向：胃腸道疾病的基礎(chǔ)與臨床。E-mail：syrmyjfbk@163.com

R574.62

A

1006-5709(2016)07-0745-04

2015-09-14