彭芊芊，趙 彤

南方醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院 1.消化內(nèi)科； 2.病理科，廣東 廣州 510095

美沙拉嗪對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎大鼠結(jié)腸組織TLR4表達(dá)的影響

彭芊芊1，趙 彤2

南方醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院 1.消化內(nèi)科； 2.病理科，廣東 廣州 510095

目的 探討美沙拉嗪對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis, UC)大鼠結(jié)腸組織 TLR4表達(dá)的影響。方法 選取30只SD大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、UC組及治療組。后兩組均采用三硝基苯磺酸(TNBS)誘導(dǎo)制備UC大鼠模型。成功建模2 d后，治療組采用美沙拉嗪+蒸餾水混懸液3 ml 灌胃，正常對(duì)照組、UC組僅用單純蒸餾水3 ml 灌胃，連續(xù)灌注14 d后，處死三組大鼠，對(duì)三組大鼠的疾病活動(dòng)指數(shù)、腸黏膜及組織學(xué)損傷進(jìn)行評(píng)估，RT-PCR反應(yīng)測(cè)定結(jié)腸組織TLR4 mRNA的表達(dá)；蛋白質(zhì)印跡法測(cè)定 TLR4蛋白的表達(dá)。結(jié)果 UC組大鼠疾病活動(dòng)指數(shù)、腸黏膜及組織學(xué)損傷評(píng)分均顯著高于正常對(duì)照組和治療組 (P<0.05)。UC組及治療組大鼠結(jié)腸組織TLR4 mRNA及蛋白表達(dá)水平顯著高于正常對(duì)照組(P<0.05)。與UC組比較，治療組大鼠結(jié)腸組織TLR4 mRNA及蛋白表達(dá)均顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論 美沙拉嗪對(duì)UC大鼠結(jié)腸組織 TLR4表達(dá)有抑制作用，可有效減少腸組織TLR4 mRNA的表達(dá)，緩解UC大鼠結(jié)腸組織損傷，有效保護(hù)UC大鼠結(jié)腸組織黏膜。

美沙拉嗪；潰瘍性結(jié)腸炎；大鼠結(jié)腸組織；TLR4

近年潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis, UC)的發(fā)病率逐年上升，其臨床表現(xiàn)以反復(fù)發(fā)作的慢性炎癥為特點(diǎn)，具體發(fā)病機(jī)制不明[1]。目前研究[2]表明, UC的發(fā)病與遺傳、環(huán)境、免疫等多種因素相關(guān)，免疫因素是近年的研究熱點(diǎn)，Toll 樣受體4 (Toll like receptor 4,TLR4)被認(rèn)為是促進(jìn)UC發(fā)病的重要表達(dá)免疫因素[2]。文獻(xiàn)[3]報(bào)道，UC大鼠結(jié)腸黏膜中TLR4蛋白表達(dá)明顯高于正常值，UC患者腸道黏膜TLR2及TLR4表達(dá)均增加。美沙拉嗪是治療UC療效良好的新型5-氨基水楊酸控釋劑，且目前未報(bào)道出現(xiàn)明顯的不良反應(yīng)[4]。本研究探討應(yīng)用美沙拉嗪對(duì)UC大鼠結(jié)腸組織 TLR4表達(dá)的影響，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及材料 健康成年SD 大鼠30 只，雄性17只，雌性13只，體質(zhì)量(195±5)g。主要試劑：三硝基苯磺酸(TNBS)購(gòu)自Sigma 公司，美沙拉嗪、抗體購(gòu)自SANTA CRUZ 公司，引物由上海生物工程公司合成。

1.2 研究方法

1.2.1 建模：將30只SD大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、UC組及治療組，每組各10只，后兩組均采用TNBS誘導(dǎo)制備UC大鼠模型。具體方法：將兩組大鼠禁食24 h，刺激誘導(dǎo)其排便，腹腔麻醉后，將潤(rùn)滑后的大鼠灌胃針插入腸道直接進(jìn)行結(jié)腸灌注，按100 mg/kg TNBS灌注足量后，提起大鼠倒立5 min，正常對(duì)照組按相同的辦法灌注等量的蒸餾水。成功建模2 d后，治療組采用美沙拉嗪+蒸餾水混懸液3 ml 灌胃，正常對(duì)照組、UC組僅用單純蒸餾水3 ml 灌胃，連續(xù)灌注14 d 后，處死三組大鼠，采集標(biāo)本。

1.2.2 疾病活動(dòng)指數(shù)、腸黏膜及組織學(xué)損傷評(píng)分：按DAI評(píng)分對(duì)三組大鼠一般情況進(jìn)行評(píng)分。處死大鼠后，取出結(jié)腸組織，剖開腸系膜緣，用冰生理鹽水漂洗，按CMDI評(píng)分[5]評(píng)估其腸黏膜損傷。將結(jié)腸組織制成石蠟切片，進(jìn)行HE染色后，按TDI評(píng)分[6]評(píng)估其組織學(xué)損傷。采用RT-PCR反應(yīng)測(cè)定結(jié)腸組織TLR4 mRNA表達(dá)；蛋白質(zhì)印跡法測(cè)定結(jié)腸組織 TLR4蛋白表達(dá)。

2 結(jié)果

2.1 大鼠一般情況評(píng)分 正常對(duì)照組大鼠活動(dòng)正常，體毛光滑，反應(yīng)靈活有力，體質(zhì)量增加，糞便正常成形。UC組及治療組在建模成功2 d后出現(xiàn)不同的精神萎靡、懶動(dòng)、厭食，體毛色澤暗淡無(wú)光，反應(yīng)遲鈍，體質(zhì)量減輕，排便異常，且伴有血便、黏液便。治療組采用美沙拉嗪治療后，情況好轉(zhuǎn)，糞便在5 d后開始成形，不再伴有血便、黏液便。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中無(wú)大鼠死亡。

2.2 三組大鼠的疾病活動(dòng)指數(shù)、腸黏膜及組織學(xué)損傷評(píng)分 正常對(duì)照組大鼠結(jié)腸黏膜色澤正常，未出現(xiàn)充血水腫，無(wú)潰爛及潰瘍產(chǎn)生。UC組大鼠結(jié)腸出現(xiàn)擴(kuò)張水腫，正常腸黏膜皺襞消失，有充血水腫產(chǎn)生，伴有潰爛及潰瘍。治療組大鼠結(jié)腸病變輕于UC組大鼠，僅有局部充血水腫，無(wú)明顯腸道水腫擴(kuò)張，未見明顯潰爛及潰瘍。UC組大鼠疾病活動(dòng)指數(shù)、腸黏膜及組織學(xué)損傷評(píng)分均顯著高于正常對(duì)照組和治療組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見表1)。病理結(jié)果顯示，正常對(duì)照組大鼠結(jié)腸形態(tài)結(jié)構(gòu)正常， 無(wú)黏膜壞死及炎癥。UC組大鼠有部分黏膜壞死脫落，局部炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，且有明顯黏膜水腫，伴有隱窩膿腫。治療組大鼠結(jié)腸黏膜未見明顯潰瘍或已經(jīng)愈合，炎癥浸潤(rùn)減輕(見圖1)。

2.3 三組大鼠結(jié)腸組織TLR4 mRNA及蛋白表達(dá)水平 UC組及治療組大鼠結(jié)腸組織TLR4 mRNA及蛋白表達(dá)水平顯著高于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與UC組比較，治療組大鼠結(jié)腸組織TLR4 mRNA表達(dá)及蛋白表達(dá)均顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見表2、圖2) 。

組別只數(shù)疾病活動(dòng)指數(shù)組織學(xué)損傷評(píng)分腸黏膜損傷評(píng)分正常對(duì)照組1000.22±0.460.31±0.39 UC組104.60±1.11*6.31±1.98*5.48±1.81*治療組102.20±0.72*△2.56±1.29*△2.39±1.38*△

注：與正常對(duì)照組比較，*P<0.05；與UC組比較，△P<0.05。

圖1 三組大鼠病理組織切片(400×) A：正常對(duì)照組；B：UC組；C：治療組Fig 1 Biopsy of SD rats in three groups (400×) A: normal control group; B: UC group; C: treatment group

組別只數(shù)TLR4mRNATLR4蛋白正常對(duì)照組100.09±0.020.36±0.31UC組100.34±0.01*1.53±0.36*治療組10 0.24±0.01*△ 0.79±0.31*△

注：與正常對(duì)照組比較，*P<0.05；與UC組比較，△P<0.05。

圖2 三組大鼠TLR4蛋白印跡圖 A：正常對(duì)照組；B：UC組；C：治療組

Fig 2 Western blotting of TLR4 protein in three groups

A: normal control group; B: UC group; C: treatment group

3 討論

UC是腸道慢性非特異性疾病，目前認(rèn)為其發(fā)病主要與免疫因子介導(dǎo)的機(jī)體綜合反應(yīng)有關(guān)，此外還涉及遺傳、感染、環(huán)境等多方面因素,細(xì)胞因子在其發(fā)病中扮演重要角色[7]。美沙拉嗪通過(guò)清除大鼠體內(nèi)腸道的氧自由基，抑制減少其結(jié)腸黏膜代謝的脂肪酸氧化，從而維持腸道黏膜屏障，減少其上皮由于局部炎癥增加的通透性，從而減少局部炎癥因子聚集導(dǎo)致的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，減輕UC嚴(yán)重程度[8]。TLR是機(jī)體腸道重要的病原相關(guān)模式受體，在機(jī)體免疫系統(tǒng)激活介導(dǎo)的反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用，細(xì)菌代謝產(chǎn)物往往通過(guò)激活跨膜TLR、通過(guò)MyD88 途徑及非MyD88 依賴途徑誘導(dǎo)炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生及聚集，積極參加免疫應(yīng)答，引起誘發(fā)的機(jī)體免疫及防御系統(tǒng)過(guò)度激活，體內(nèi)釋放大量炎癥因子，如TNF-α、IL-6、IL-8等，最終形成逐級(jí)放大瀑布式炎癥反應(yīng)綜合征及多器官功能衰竭[9]。正常機(jī)體存在免疫耐受應(yīng)對(duì)免疫激活，避免產(chǎn)生免疫疾病損傷，但文獻(xiàn)[10]報(bào)道, 重癥肺炎導(dǎo)致心肌損傷或敗血癥等疾病中，內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)于內(nèi)毒素耐受消失，通過(guò)TLR4 信號(hào)傳導(dǎo)通路介導(dǎo)炎癥因子的產(chǎn)生,導(dǎo)致級(jí)聯(lián)炎癥反應(yīng)。廖奕等[11]研究發(fā)現(xiàn)，UC結(jié)腸黏膜中TLR4 mRNA及蛋白表達(dá)水平均顯著升高，提示其對(duì)于UC發(fā)病及病情進(jìn)展起重要作用。

本研究結(jié)果表明，UC組大鼠疾病活動(dòng)指數(shù)、腸黏膜損傷評(píng)分及組織學(xué)損傷評(píng)分均顯著高于正常對(duì)照組和治療組。UC組及治療組大鼠結(jié)腸組織TLR4 mRNA及蛋白表達(dá)水平顯著高于正常對(duì)照組。與UC組比較，治療組大鼠結(jié)腸組織TLR4 mRNA及蛋白表達(dá)均顯著降低。說(shuō)明美沙拉嗪對(duì)UC大鼠結(jié)腸組織 TLR4表達(dá)有抑制作用，可有效減少結(jié)腸組織TLR4 mRNA的表達(dá)，緩解UC大鼠腸道擴(kuò)張充血水腫，減輕其潰瘍及糜爛，達(dá)到良好的治療效果。本研究結(jié)果與羅南等[12]結(jié)果近似。

[1]Teng X, Xu LF, Zhou P, et al. Effects of trefoil peptide 3 on expression of TNF-alpha, TLR4, and NF-kappaB in trinitrobenzene sulphonic acid induced colitis mice [J]. Inflammation, 2009, 32(2): 120-129．

[2]Monteleone G, Biancone L, Marasco R, et al. Interleukin 12 is expressedand actively released by Crohn’s disease intestinal lamina propriamononuclear cells [J]. Gastroenterology, 2012, 112(4): 1169．

[3]Niessner M, Volk BA. Altered Th1/Th2 cytokine profiles in the intestinal mucosa of patients with inflammatory bowel disease as assessed by quantitative reversed transcribed polymerase chain reaction (RT-PCR) [J]. Clin Exp Immunol, 2011, 101(3): 428．

[4]Yamaguchi T, Soma T, Takaku Y, et al. Salbutamol modulates the balance of Th1 and Th2 cytokines by mononuclear cells from allergic asthmatics [J]. Int Arch Allergy Immunol, 2010, 152 Suppl 1: 32-40．

[5]Cooper HS, Murthy SN，Shah RS, et al. Clinicopathologic study of dextran sulfate sodium experimental murine colitis [J]. Lab Invest, 2013, 69(2): 238-249.

[6]Obermeier F, Dunger N, Strauch UG, et al. Contrasting activity of cytosin-guanosin dinucleotide oligonucleotides in mice with experimental colitis [J]. Clin Exp Immunol, 2003, 134(2): 217-224．

[7]Greenhill CJ, Rose-John S, Lissilaa R, et al. IL-6 trans-signaling modulates TLR4-dependent inflammatory responses via STAT3 [J]. J Immunol, 2013, 186(2): 1199-1208．

[8]Putra AB, Nishi K, Shiraishi R, et al. Jellyfish collagen stimulates production of TNF-α and IL-6 by J774.1 cells through activation of NF-κB and JNK via TLR4 signaling pathway [J]. Mol Immunol, 2014, 58(1): 32-37．

[9]Wang WM, Deng MJ, Liu XT, et al. TLR4 activation induces nontolerant inflammatory response in Eendothelial cells [J]. Inflammation, 2013, 34(6): 509-518．

[10] Szebeni B, Veres G, Dezsofi A, et al. Increased expression of Toll- like receptor (TLR)2 and TLR4 in the colonic mucosa of children with inflammatory bowel disease [J]. Clin Exp Immunol, 2012, 151(1): 34-41．

[11] 廖奕, 范恒, 陳小艷, 等. β-arrestin1在實(shí)驗(yàn)性大鼠結(jié)腸炎發(fā)生機(jī)制中的作用及氧化苦參堿的干預(yù)作用[J]. 中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合雜志, 2012, 30(10): 1067-1072.

Liao Y, Fan H, Chen XY, et al. Pathogenetic mechanism of β-arrestin1 in experimental colitis of rats and intervention effects of oxymatrine [J]. CJITWM, 2012, 30(10): 1067-1072.

[12]羅南, 顏玉. 美沙拉嗪對(duì)大鼠潰瘍性結(jié)腸炎NF-κB和TGF-β表達(dá)的影響[J]. 黑龍江醫(yī)藥科學(xué), 2012, 33(4): 11-12.

Luo N, Yan Y. Effect of Mesalazine on NF-κB and TGF-β expression in ulcerative colitis [J]. Heilongjiang Medicine and Pharmacy, 2012, 33(4): 11-12.

(責(zé)任編輯：王豪勛)

Effect of Mesalazine on the expression of TLR4 in colonic tissue of ulcerative colitis rats

PENG Qianqian1, ZHAO Tong2

1.Department of Gastroenterology; 2.Department of Pathology, the Third Affiliated Hospital of Southern Medical University, Guangzhou 510095, China

Objective To investigate the effect of Mesalazine on the expression of TLR4 in colonic tissue of ulcerative colitis (UC) rats. Methods Thirty SD rats were randomly divided into normal control group, UC group and treatment group. TNBS was used to induce UC rat model in UC group and treatment group. Two days after the successful model, the treatment group was treated with Mesalazine plus distilled water suspension gavage 3 ml; normal control group and UC group were treated with distilled water gavage 3 ml, SD rats of three groups were killed after 14 days treatment. Disease activity index, the intestinal mucosa injury and histological injury were evaluated. TLR4 mRNA was detected by RT-PCR; TLR4 protein was detected by Western blotting. Results The disease activity index, histological injury score and intestinal mucosa injury score in UC group were significantly higher than those in the normal control group and treatment group (P<0.05). Expressions of TLR4 mRNA and protein in UC group and treatment group were significantly higher than those in the normal control group (P<0.05). Compared with the UC group, the expressions of TLR4 mRNA and protein in treatment group were decreased, and there was significant difference between two groups (P<0.05).Conclusion Mesalazine can inhibit TLR4 expression in UC rats, can effectively reduce the expression of TLR4 mRNA in intestinal tissue, and relieve the damage of colonic tissue of UC rats.

Mesalazine; Ulcerative colitis; Colonic tissue of rats; Toll like receptor 4

10.3969/j.issn.1006-5709.2016.07.007

論著·炎癥性腸病

R574.62

A

1006-5709(2016)07-0742-03

2015-10-16