邢文峰，肖　莉

解放軍第一九八醫(yī)院，湖南 郴州 423000

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*通信作者

HPLC梯度洗脫法同時測定壯血藥酒中4種成分的含量

邢文峰*，肖莉

解放軍第一九八醫(yī)院，湖南 郴州 423000

[摘要]目的建立同時測定壯血藥酒中新北美圣草苷、柚皮苷、補骨脂素和佛手柑內(nèi)酯4個主要成分含量的高效液相色譜檢測方法。方法采用依利特C18柱；流動相A為乙腈-甲醇(1∶2)，流動相B為0.4%冰醋酸溶液，梯度洗脫；流速為1.1 mL/min；柱溫為25 ℃；檢測波長λ1=283 nm (新北美圣草苷和柚皮苷)，λ2=222 nm (補骨脂素和佛手柑內(nèi)酯)。結(jié)果在優(yōu)化的色譜條件下，新北美圣草苷、柚皮苷、補骨脂素和佛手柑內(nèi)酯的線性范圍分別為6.52～130.40 μg/mL (r=0.999 7)、6.61～132.20 μg/mL (r=0.999 3)、6.75～135.00 μg/mL (r=0.999 6)、4.05～81.00 μg/mL (r=0.999 9)；4種成分的平均加樣回收率(n=6)分別為96.94%、99.14%、98.09%、96.87%，RSD分別為0.75%、0.52%、1.18%、1.02%。結(jié)論該方法簡便快捷，回收率、重復性良好，可用于壯血藥酒中新北美圣草苷、柚皮苷、補骨脂素和佛手柑內(nèi)酯的含量分析。

[關鍵詞]壯血藥酒；新北美圣草苷；柚皮苷；補骨脂素；佛手柑內(nèi)酯

0引言

壯血藥酒是治療貧血、病后體質(zhì)虛弱、腰膝酸痛、婦女帶下、月經(jīng)不調(diào)等癥狀的中藥復方制劑，現(xiàn)收載于部頒標準中藥成方制劑第5冊[1]，由骨碎補、五指毛桃、當歸、黑老虎、何首烏(制)、白術(炒)、雞血藤、甘草(炙)等加工而成，具有補氣血、通經(jīng)絡、壯筋骨、健脾胃的功效。原質(zhì)量標準僅對方中當歸進行了薄層色譜定性，未對方中任何藥味進行定量，經(jīng)文獻檢索，未見對壯血藥酒中所含成分進行定量的報道，本研究首次對壯血藥酒藥材骨碎補[2]和五指毛桃[3]中新北美圣草苷、柚皮苷、補骨脂素和佛手柑內(nèi)酯進行定量研究，建立了同時測定4種成分的方法，現(xiàn)報道如下。

1儀器與試藥

安捷倫1200型HPLC色譜儀；VS-100UE型恒溫超聲波提取機；XS205DU型十萬分之一電子天平；柚皮苷對照品(批號：110722-201312，含量以94.7%計，常溫干燥、密閉遮光保存，使用前無需處理)、補骨脂素(批號：110739-201416，含量以99.9%計，常溫保存)由中國食品藥品檢定研究院提供；新北美圣草苷對照品(批號：13241-32-2，含量以98.0%計)、佛手柑內(nèi)酯(批號：484-20-8，含量以98.9%計)由上海同田生物技術股份有限公司提供；壯血藥酒(每瓶裝75 mL；批號：140235、140276、140291)購于國藥集團馮了性(佛山)藥業(yè)有限公司；甲醇、乙腈為色譜純，冰醋酸為分析純，水為重蒸餾水。

2方法

2.1色譜條件采用依利特C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相A為乙腈-甲醇(1∶2)，流動相B為0.4%冰醋酸溶液，按表1進行梯度洗脫[4-9]；檢測波長：0～29 min，λ1=283 nm[10-12]，29～50 min，λ2=222 nm[13]；流速采用1.1 mL/min；柱溫采用25 ℃；進樣量為20 μL。

表1　流動相梯度洗脫程序

2.2對照品溶液的配制方法

2.2.1對照品儲備液的制備分別稱取對照品新北美圣草苷、柚皮苷、補骨脂素和佛手柑內(nèi)酯適量，分別加50%乙醇溶解并稀釋，制成質(zhì)量濃度分別為0.652、0.661、0.675、0.405 mg/mL單一成分的對照品儲備液。

2.2.2混合對照品溶液的制備按上述4種對照

品儲備液順序，分別依次吸取2.5、5.0、1.0、2.0 mL，用50%乙醇溶液稀釋，制成每1 mL分別含新北美圣草苷、柚皮苷、補骨脂素、佛手柑內(nèi)酯32.6、66.1、13.5、16.2 μg的混合對照品溶液。

2.3樣品溶液的制備方法

2.3.1樣品溶液的制備精密吸取壯血藥酒6.0 mL，置于50 mL容量瓶中，用50%乙醇溶液稀釋至刻度，振搖均勻，微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，作為樣品溶液備用。

2.3.2陰性對照溶液的制備按照部頒標準《中藥成方制劑》第5冊壯血藥酒質(zhì)量標準中規(guī)定的處方工藝，分別制備不含骨碎補、五指毛桃的樣品，按照文中“2.3.1”項下樣品溶液的制備方法分別制備成骨碎補、五指毛桃空白溶液。

2.4線性關系考察分別精密吸取上述制備的對照品儲備液0.1、0.2、0.5、1.0、2.0 mL，將其分別置于10 mL量瓶中，用50%乙醇稀釋成系列濃度的混合對照品溶液，在上述的色譜條件下，分別進樣20 μL，進行測定，記錄新北美圣草苷、柚皮苷、補骨脂素、佛手柑內(nèi)酯的峰面積，以峰面積Y為縱坐標、對照品質(zhì)量濃度X為橫坐標，繪制標準曲線，回歸方程、線性范圍及r值見表2。

表2　線性關系實驗結(jié)果(n=6)

3方法學考察

3.1專屬性試驗分別精密吸取樣品溶液、混合對照品溶液、骨碎補空白溶液和五指毛桃空白溶液，參照上述色譜條件各進樣20 μL進行測定，記錄色譜峰。結(jié)果顯示，在該色譜條件下，按保留時間先后的出峰順序-新北美圣草苷、柚皮苷、補骨脂素、佛手柑內(nèi)酯，樣品溶液和混合對照品溶液所測的新北美圣草苷、柚皮苷、補骨脂素、佛手柑內(nèi)酯的保留時間一致；空白樣品在對照品相應位置處未呈現(xiàn)吸收峰。結(jié)果表明，處方中其他藥物對所測成分的測定無干擾。色譜圖見圖1。

3.2精密度試驗精密吸取“2.2.2”項下制備的混合對照品溶液20 μL，參照“2.1”項下色譜條件，連續(xù)進樣6次，記錄新北美圣草苷、柚皮苷、補骨脂素和佛手柑內(nèi)酯的峰面積，計算相對標準偏差，新北美圣草苷為1.25%、柚皮苷為0.67%、補骨脂素為0.84%、佛手柑內(nèi)酯為1.08%。

3.3重復性試驗按壯血藥酒樣品含量測定方法，對同一批號(批號：140235)的6份壯血藥酒樣品進行測定，記錄新北美圣草苷、柚皮苷、補骨脂素和佛手柑內(nèi)酯的峰面積，計算相對標準偏差，結(jié)果新北美圣草苷、柚皮苷、補骨脂素和佛手柑內(nèi)酯峰面積的RSD依次為1.46%、0.38%、0.94%、1.13%，表明本研究的檢驗方法重復性良好。

3.4穩(wěn)定性試驗取同一批號的壯血藥酒樣品(批號：140235)的同一樣品溶液，分別在0、2、4、8、12、24 h進樣測定，結(jié)果顯示，新北美圣草苷、柚皮苷、補骨脂素和佛手柑內(nèi)酯的RSD分別為0.98%、0.42%、0.87%、1.51%，表明24 h內(nèi)樣品溶液的穩(wěn)定性良好。

圖1　新北美圣草苷、柚皮苷、補骨脂素和佛手柑內(nèi)酯的HPLC

3.5加樣回收率試驗取9份已知含量的壯血藥酒(批號：140235；新北美圣草苷為0.289 mg/mL、柚皮苷為0.561 mg/mL、補骨脂素為0.107 mg/mL、佛手柑內(nèi)酯為0.132 mg/mL)適量，精密量取3.0 mL，置于50 mL容量瓶中，分別精密加入混合對照品溶液20、25、30 mL各3份，用50%乙醇溶液稀釋至刻度，振搖均勻，濾過，取續(xù)濾液，作為加樣樣品試液。參照“2.1”項下的色譜條件，計算各組分回收率，結(jié)果上述成分的平均加樣回收率(n=6)分別為96.94%、99.14%、98.09%、96.87%，RSD分別為0.75%、0.52%、1.18%、1.02%。

4樣品測定

取3個不同批號的壯血藥酒樣品，參照“2.3.1”項下制備樣品溶液的處理方法，按“2.1”項下的色譜條件進行分析、測定，結(jié)果見表3。

表3　樣品含量測定結(jié)果(mg/mL)

5討論

5.1流動相的選擇分別采取乙腈-水[6,13]、甲醇-水[7]、乙腈-0.4%冰醋酸溶液[4]、甲醇-0.2%磷酸溶液[9]、乙腈-甲醇(1∶2)與0.4%冰醋酸溶液不同比例梯度洗脫，通過對各色譜峰的保留時間、峰形和分離度效果的對比，優(yōu)選出最佳的檢測用流動相，結(jié)果表明，在乙腈-甲醇(1∶2)與0.4%冰醋酸溶液為流動相按照文中比例洗脫時，各色譜峰的分布、峰形和分離度效果最佳，故選取乙腈-甲醇(1∶2)與0.4%冰醋酸溶液為壯血藥酒中新北美圣草苷、柚皮苷、補骨脂素和佛手柑內(nèi)酯同時測定的流動相。

5.2多組分同時測定中藥制劑的活性成分含量是反映其有效性的重要指標，壯血藥酒現(xiàn)行標準僅對處方中當歸進行了薄層色譜定性研究，未對所含成分進行定量測定，本研究建立的壯血藥酒中新北美圣草苷、柚皮苷、補骨脂素和佛手柑內(nèi)酯含量測定方法，可以實現(xiàn)同時對處方中多味藥材、多個指標成分的定量測定，不僅方法簡便、可靠，且對其他含類似成分的中成藥質(zhì)量控制也具有借鑒作用。

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High-performance liquid chromatography for simultaneous determination of four components in zhuangxue yaojiu

XING Wen-fen*,XIAO Li

(the People′s Liberation Army 198 Hospital,Chenzhou 423000,China)

[Abstract]ObjectiveTo establish a high-performance liquid chromatography (HPLC) method for the simultaneous determination of four main components (neoeriocitrin,naringin,psoralen and bergapten) in zhuangxue yaojiu.MethodsThe HPLC separation was performed on an Hypersil C18column eluted,with a mobile phase consisting of acetonitrile-methanol (1∶2) as mobile phase A,and 0.4% acetic acid glacial solution as mobile phase B.The flow rate was 1.1 mL/min.The column temperature was at 25 ℃.Neoeriocitrin and naringin were detected at 283 nm,and psoralen and bergapten were detected at 222 nm.ResultsThe chromatographic peaks of 4 main components and the corresponding spectra were ideal under the optimal conditions.Neoeriocitrin,naringin,psoralen and bergapten had good linearity at 6.52～130.40 μg/mL (r=0.999 7),6.61～132.20 μg/mL (r=0.999 3),6.75～135.00 μg/mL (r=0.999 6),4.05～81.00 μg/mL(r=0.999 9),and the average recoveries and RSD were 96.94% (0.75%),99.14% (0.52%),98.09% (1.18%) and 96.87% (1.02%),respectively.ConclusionThe method is simple,economical and accurate with good reproducibility for the determination of neoeriocitrin,naringin,psoralen and bergapten.

Key words：Zhuangxue yaojiu;Neoeriocitrin;Naringin;Psoralen;Bergapten

收稿日期：2015-08-24

DOI:10.14053/j.cnki.ppcr.201604025