趙興福江山黃曉晶閆福華.南開大學口腔醫(yī)院?天津市口腔醫(yī)院牙體牙髓病二科 天津 0004；.福建醫(yī)科大學附屬口腔醫(yī)院牙體牙髓病科 福州 5000；.南京大學醫(yī)學院附屬口腔醫(yī)院高級專家診療科 南京 0008

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變異鏈球菌臨床株表面相關蛋白表達差異的初步分析

趙興福1江山2黃曉晶2閆福華3
1.南開大學口腔醫(yī)院?天津市口腔醫(yī)院牙體牙髓病二科 天津 300041；
2.福建醫(yī)科大學附屬口腔醫(yī)院牙體牙髓病科 福州 350002；
3.南京大學醫(yī)學院附屬口腔醫(yī)院高級專家診療科 南京 210008

［摘要］目的探討變異鏈球菌臨床株在中性條件下表面相關蛋白的表達差異，進一步了解齲病的發(fā)生和發(fā)展過程。方法在pH7.0條件下采用Homer法提取臨床分離株的表面相關蛋白，經十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳和二維電泳（2DE）確定蛋白質表達的差異條帶及位點，差異位點由基質輔助激光解析電離飛行時間（MALDI-TOF）質譜分析，并結合數據庫進行檢索和鑒定蛋白質。結果經過對電泳圖譜的分析發(fā)現：593號菌株存在14個高表達蛋白質位點和8個特異蛋白質位點，其中丙酮酸激酶、ABC運載體（腺苷三磷酸結合蛋白）特異表達，葡糖基轉移酶高表達。結論兩菌株在中性條件下出現了某些蛋白質的高表達和特異表達，可能是致齲性存在差異的原因。

［關鍵詞］變異鏈球菌；蛋白質組學；臨床分離株；表面相關蛋白

齲病是世界范圍內的常見病和多發(fā)病，變異鏈球菌血清型C型菌株是與齲關系最密切的致齲菌之一，并有研究［1-2］表明該菌株臨床分離株間致齲性存在明顯差異。于是，在前期研究中本課題組從高齲患者和無齲健康人成功分離血清C型變異鏈球菌的臨床分離株，并發(fā)現菌株間黏附能力、產酸能力、胞外多糖合成能力、耐酸能力存在明顯差異［3］。本研究旨在通過對菌株間表面相關蛋白的蛋白質組學差異的初步分析，進一步探討菌株間致齲性存在差異的原因。

1　材料和方法

1.1材料與設備

胰蛋白胨-多價蛋白-酵母提取物培養(yǎng)基（tryptone-pdypeptone-yeast extract，TPY）（1.5%胰蛋白胨，0.4%酵母提取物，1%葡萄糖，0.6% KH2PO4，0.2% K2HPO4·3H2O，0.2% Na2CO3，0.2% NaCl，pH=7.0自配）；兩性洗滌劑（Sigma公司，美國）；兩性電介質（Thomas Global公司，美國）；透析袋（Pierce公司，美國）；0.22 μm濾膜（Acrodisc公司，德國）；固相pH梯度膠條（Bio-Rad公司，美國）；蛋白標志物（廈門泰京生物科技有限公司）；固相pH梯度干膠條覆蓋液（Bio-Rad公司，美國）；苯甲基磺酰氟（phenyl methanesulfonyl fluoride，PMSF）（深圳賽泰克生物科技有限公司）；碘乙酰胺（iodacetamide，IAM）（Amersham公司，美國）；二硫素糖醇（dithiothreitol，DTT）（Genview公司，美國）；固相pH梯度（immobilized pH gradient，IPG）緩沖液（pH3-10NL）（Bio-Rad公司，美國）；低分子量標準蛋白（Sigma公司，美國）；銀染試劑盒（Bio-Rad公司，美國）；二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白濃度測定試劑盒（江蘇省碧云天生物技術研究所）；YQX-Ⅱ厭氧培養(yǎng)箱（上海新苗醫(yī)療器制造有限公司）；IPGphor等電聚焦儀（Amsheram Pharmacia公司，美國）；DYY-6C型電泳儀 （北京市六一儀器廠）；ETTAN Ⅱ垂直板電泳儀（Amsheram Pharmacia公司，美國）；全自動酶聯(lián)免疫測定儀（Human公司，德國）；Power Look 2100xl凝膠成像儀（掃描儀）（Amsheram Pharmacia公司，美國）；GE50超聲處理器（Deerfield公司，美國）；圖象分析軟件ImageMaster 4.01（Amsheram Phar-macia公司，美國）；320-S型p H計（Mettlertoledo公司，瑞士）；ND-1000分光光度計（DanoDrop公司，美國）。

1.2菌株

選用的變異鏈球菌臨床分離株分別是來源于高發(fā)齲患者的593號菌株和來源于無齲健康人的18號菌株，由本課題組于四川大學華西口腔醫(yī)學院齲病研究室分離、鑒定及保存，并經體外致齲實驗證實593號菌株的產酸能力、黏附能力、合成胞外多糖的能力和耐酸能力均強于18號菌株［3］。

1.3生長曲線測定

在TPY固體培養(yǎng)基上將凍干粉保存的菌株復蘇，厭氧（80% N2、10% H2、10% CO2）、37 ℃、24 h后傳二代，將平板菌落用無菌消毒棉簽分別收集于預消毒好的TPY培養(yǎng)液（pH7.0）中，通過光密度（optical density，OD）（A630）調節(jié)菌密度均為1.0左右，然后分別以體積比5：100加入預消毒好的TPY（pH7.0）液體培養(yǎng)液中，旋轉混勻，分裝于小試管中，置厭氧條件下37 ℃培養(yǎng)，每小時將2支小試管取出，各測3次OD值后取平均值，列圖表，繪生長曲線，確定對數生長期。

1.4Homer法提取表面相關蛋白

593號和18號菌株常規(guī)復蘇、傳代，將平板菌落用無菌消毒棉簽分別收集于預消毒好的TPY （pH7.0）培養(yǎng)液中，通過OD（A630）調節(jié)菌濃度均為1.0左右，分別以體積比5：100加入預消毒好的TPY（pH7.0）液體培養(yǎng)液中，旋轉混勻，厭氧37 ℃培養(yǎng)，對數生長期時停止培養(yǎng)。將菌液離心（4 000 r·min-1，5 min），重懸于磷酸鹽緩沖液（public broadcasting service，PBS），用吸管輕輕吹打混勻，離心（4 000 r·min-1，5min），再重懸于PBS液，用吸管輕輕吹打混勻，收集于一處，通過OD（A630）調整菌濃度為0.9，將該菌液離心（4 000 r·min-1，5min），重懸于1/5體積含質量體積比0.2：100 Zwittergent 3-12的PBS液，輕輕吹打混勻，分裝于Ep管中，孵育（50 r·min-1，1 h，25 ℃），離心（13 000 r·min-1，10 min），上清液收集于一處。將上清液加入4倍體積的50 mmol·L-1Tris-HCl（pH=7.5），混勻，0.22 μm過濾器過濾，分裝于蛇皮袋（snakeskin）于新鮮配制的50 mmol·L-1Tris-HCl（pH7.5）中透析，4 ℃，磁力慢速攪拌，過夜。將4倍體積-70 ℃預冷的丙酮加入透析液，-20 ℃，過夜，離心（12 000 r·min-1，20 min，4 ℃），干燥，于50 mmol·L-1Tris-HCl （pH=7.5）中重懸，4倍體積-70 ℃預冷的丙酮加入重懸液，-20 ℃，過夜，離心（12 000 r·min-1，20 min，4 ℃），干燥，保存于-70 ℃。

1.5蛋白樣品BCA法定量及十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE）電泳分析

將蛋白質樣品溶解，用CurveExpert 1.3軟件計算蛋白質濃度，并將蛋白質制備成濃度一致的樣本。分別取適量的蛋白質樣品，混勻于1/4體積5倍加樣緩沖液中，沸水（100 ℃）浴10 min，離心（12 000 r·min-1，10 min）。用12%分離膠和5%積層膠采取垂直不連續(xù)板狀法進行SDS-PAGE電泳，制備7 cm×7 cm凝膠。將等量蛋白質樣品上樣，30 mA，約4 h冰浴?？捡R斯亮藍溶液中將電泳完畢的凝膠染色，置脫色液（10%乙酸-5%乙醇）中脫色，觀察電泳結果，照相。

1.6蛋白樣品改良的Bradford法定量及二維電泳（two-dimensional gel electrophoresis，2DE）分析

改良的Bradford法繪制標準曲線，計算出蛋白質樣品溶解液蛋白質含量。根據樣品的具體情況和所選擇的strip條帶長度、pH梯度范圍選擇上樣量，再根據上樣量確定樣品體積，上樣后根據pH范圍和strip的長度設定等電聚焦電泳參數，在電泳中應隨時監(jiān)測電壓的情況，若電壓不達到要求，電泳時間要適當延長，必須達到所要求的伏小時數。電泳結束，取出strip條帶，進行平衡，或-80 ℃保存于塑料管內。二次膠條平衡后進行SDS-PAGE電泳，電泳結束取出凝膠，銀染，于1%冰乙酸中將染色好的凝膠脫色，4 ℃保存，照相。用軟件ImageMaster 2D Platinum 5.0對染色好的凝膠膠圖蛋白質表達量差異點進行分析。

1.7差異蛋白質位點的基質輔助激光解析電離飛

行時間（matris assisted laser desorption ionizationtime of flight，MALDI-TOF）質譜分析選取及切取差異蛋白質位點，放置于潔凈Ep管，準備陰陽性對照，將切取的差異蛋白質位點用胰蛋白酶消化，MALDI-TOF質譜法分析差異蛋白質位點，得到各蛋白質位點的肽質量指紋譜（peptide mass fingerprinting，PMF），在NCBInr數據庫中用Mascot（http：//www.matrixscience.cn）軟件檢索相匹配的蛋白質。

2　結果

2.1在pH7.0條件下兩菌株TPY液體培養(yǎng)基中的生長曲線

593、18號菌株在pH7.0 TPY液體培養(yǎng)基中的生長曲線詳見圖1：在pH7.0液體培養(yǎng)基中兩菌株接種后無停滯期，生長迅速，4 h左右便進入對數生長期，由于菌間黏附在生長到一定階段時出現沉積，但593號菌株生長稍快于18號菌株，早0.5 h左右出現黏附沉積。

圖1　593、18號菌株在pH7.0 TPY液體培養(yǎng)基中的生長曲線Fig1　The growth curve of Streptococcus mutans 593 and Streptococcus mutans 18 at pH7.0 in TPY fluid medium

2.2兩菌株表面相關蛋白SDS-PAGE電泳結果

593和18號菌株在pH7.0條件下表面相關蛋白質的SDS-PAGE電泳結果詳見圖2：593號菌株在36、38、110 ku左右存在特異條帶，在28 ku左右蛋白質表達量比18號菌株大，18號菌株在16、32 ku左右的蛋白質表達量比593號菌株大。

圖2　在pH7.0條件下593號菌株和18號菌株表面相關蛋白的SDSPAGE電泳圖Fig2　The surface-associated protein electrophoresis of clinical-isolated Streptococcus mutans 593 and Streptococcus mutans 18 at pH7.0 by SDS-PAGE

2.3兩菌株表面相關蛋白2DE結果

593和18號菌株在pH7.0條件下表面相關蛋白的2DE結果詳見圖3。

圖3　593號菌株在pH7.0條件下表面相關蛋白的2DE電泳圖Fig3　The surface-associated protein electrophoresis of Streptococcus mutans 593 at pH7.0 by 2DE

通過ImageMaster 2D Platinum 5.0軟件對593 和18號菌株在pH7.0條件下表面相關蛋白的2DE圖分析后發(fā)現：593號菌株存在14個高表達蛋白質位點和8個特異蛋白質位點，其中，在36、38 ku左右存在841、958、973、1021等高表達蛋白位點和669、853、907、935、975、982等特異蛋白位點，同時在28 ku左右存在1070、1074、1152、1161等高表達蛋白位點和1097、1121等特異蛋白位點。18號菌株存在4個高表達蛋白位點和9個特異蛋白位點，其中，18號菌株在16、32 ku左右存在964、1046等高表達蛋白位點和875、963、1099、1136、1203等特異蛋白位點。

2.4部分特殊蛋白位點質譜分析結果

MALDI-TOF質譜法得到669、1074、1097蛋白位點的PMF，在NCBInr數據庫中用Mascot軟件根據各蛋白位點的PMF檢索相匹配的蛋白，結果發(fā)現：669點為丙酮酸激酶，1074點為葡糖基轉移酶，1097點為ABC運載體（ATP結合蛋白）（表1）。

表1　593號菌株部分表面相關蛋白的鑒定結果Tab1　The identification result of the surface-associated protein of Streptococcus mutans 593

3　討論

變異鏈球菌是多數學者公認的主要致齲菌，是牙菌斑生物膜的重要組成成分，以及具備在牙面定植的多種特性，在人類口腔中占有重要的生態(tài)地位。研究［4］發(fā)現：革蘭陽性菌的膜表面具有許多與細菌毒力因子相關的重要蛋白。革蘭陽性變異鏈球菌膜表面相關蛋白同樣含有許多毒力因子相關蛋白［5］，與其致齲性密切相關。因此，筆者推測研究此類蛋白可能會有助于深入了解變異鏈球菌致齲的發(fā)生和發(fā)展過程。

浮游狀態(tài)下變異鏈球菌在對數生長期的代謝能力強，死菌數量低，且Wilkins等［6］通過比較提取變異鏈球菌膜表面相關蛋白發(fā)現：在對數時期蛋白相對完整，以及蛋白純度不會受細菌裂解的影響，可重復性好。593號菌株和18號菌株在pH7.0條件下的生長曲線顯示：兩菌株在4 h左右開始進入浮游狀態(tài)下的對數生長期，因此本實驗擬提取兩菌株4 h左右的膜表面相關蛋白，但593號菌株生長稍快于18號菌株，出現沉積物要早于18號菌株，這可能提示593號菌株的代謝能力強于18號菌株，與前期研究結果一致［3］。

SDS-PAGE電泳是蛋白分析中最常用的方法之一，其原理是根據蛋白質分子量大小而分成遷移率不同的條帶，并經染色液染色后用肉眼即可觀察，同時其獲得的電泳圖譜有助于蛋白組學差異初步分析。再者，2DE是可將數千種蛋白同時分離與展示的分離技術，是蛋白組學和差異蛋白組學研究中的首選分離技術［7］。

本研究通過采用SDS-PAGE和2DE分析593號和18號菌株在中性條件下膜表面相關蛋白發(fā)現：兩菌株蛋白表達存在明顯差異。SDS-PAGE結果顯示：593號菌株在36、38 ku左右存在特異條帶，與此相符的是在2DE結果亦顯示在36、38 ku左右存在特異蛋白位點，但2DE同時還發(fā)現在此區(qū)域又出現了高表達蛋白位點，分析其原因可能與2DE中所用的銀染分辨率高于SDS-PAGE中所用的考馬斯亮藍染色有關。另外，2DE結果還顯示：593號菌株在28 ku左右蛋白表達量大于18號菌株，同時此區(qū)域亦存在高表達蛋白位點和特異蛋白位點。其中，葡糖基轉移酶高表達，丙酮酸激酶、ABC運載體（ATP結合蛋白）特異表達。

合成胞外多糖的能力是變異鏈球菌致齲的重要條件之一。變異鏈球菌產生的葡糖基轉移酶可利用蔗糖合成細胞外多糖。細胞外多糖可促進變異鏈球菌在牙面的附著以及變異鏈球菌之間的集聚，同時在維持生物膜結構、提供營養(yǎng)等方面均有重要作用。有研究表明：在同一pH條件下，不同齲敏感口腔變異鏈球菌葡糖基轉移酶的活性存在差異，齲敏感性越高，葡糖基轉移酶活性越大。本研究中，593號菌株葡糖基轉移酶蛋白表達量是18號菌株的9.1倍，可見593號菌株合成胞外多糖能力遠大于18號菌株，導致了593號菌株致齲能力遠大于18號菌株，與本課題組前期研究結果一致［8］。再者，丙酮酸激酶和ABC運載體（ATP結合蛋白）在593號菌株特異表達。丙酮酸激酶是變異鏈球菌糖酵解的關鍵酶，其特異表達可能使得593號菌株的糖酵解能力強于18號菌株。另外，研究發(fā)現：結合蛋白ABC運載體可與ATP結合，其與該菌的耐酸能力、黏附能力、與其他細菌的競爭能力、抵抗外界環(huán)境或者宿主免疫能力等密切相關?？梢姡@些蛋白特異表達可能導致593號菌株上述相應能力強于18號菌株。

綜上所述，變異鏈球菌臨床分離株菌株間致齲性存在差異與菌株間蛋白表達差異密切相關。至于該菌株臨床分離株在各種應激條件下的蛋白表達變化以及各蛋白間協(xié)調作用情況還有待深入研究。

4　參考文獻

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（本文編輯王姝）

Differential expression of surface-associated proteins in clinical isolations of Streptococcus mutans

Zhao Xingfu1，Jiang Shan2，Huang Xiaojing2，Yan Fuhua3.（1.Dept.of Conservative Dentistry and Endodontics II，Tianjin Stomatological Hospital，Stomatological Hospital of Nankai University，Tianjin 300041，China；2.Dept.of Conservative Dentistry and Endodontics，Hospital of Stomatology，Fujian Medical University，Fuzhou 350002，China；3.Dept.of Senior Expert Diagnosis and Treatment，Hospital of Stomatology，Medical School of Nanjing University，Nanjing 210008，China）

This study was supported by the National Natural Science Foundation of China（30500564）.

［Abstract］ObjectiveThis study aims to investigate the changes in the expression of surface-associated protein at pH7.0 in Streptococcus mutans isolated from clinical samples.MethodsThe proteins were extracted from the cells at pH7.0 by using the Homer method.The proteins were separated by sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis（SDSPAGE） and 2D gel electrophoresis（2DE） followed by image analysis.The proteins were identified by matrix-assisted laser desorption time of flight（MALDI-TOF） mass spectrometry and computer-assisted protein sequence analysis.Results Image analysis revealed that 14 high expression protein loci and 8 specific protein loci exist in Streptococcus mutans 593.Specifically，pyruvate kinase and adenosine triphosphate-binding cassette transporter were modulated，and glucose transferase was highly modulated in Streptococcus mutans 593.ConclusionThe difference in protein expression of the two clinical isolations may indicate their distinct cariogenic characters.

［Key words］Streptococcus mutans；proteomics；clinical isolation；surface-associated protein

［收稿日期］2015-06-12；［修回日期］2015-11-16

［基金項目］國家自然科學基金（30500564）

［作者簡介］趙興福，主治醫(yī)師，碩士，Email：xingfu_108@126.com

［通信作者］黃曉晶，教授，博士，Email：hxiaoj@163.com

［中圖分類號］Q 51

［文獻標志碼］A［doi］ 10.7518/gjkq.2016.03.005