王佳美，王勝男，陳江曼，趙　微，李永剛

（遼寧醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，遼寧錦州121000）

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大蒜素體外抗猴甲型輪狀病毒的研究*

王佳美，王勝男，陳江曼，趙微，李永剛

（遼寧醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，遼寧錦州121000）

摘要：目的研究大蒜素體外抗猴甲型輪狀病毒（SA11）的作用。方法通過病毒滴度測定來確定大蒜素能否抗SA11以及最佳濃度。結(jié)果大蒜素對MA104細胞的最大無毒濃度為100 mg/ml，病毒滴度測定可以得出，50 mg/ml的大蒜素可以抑制SA11感染的MA104細胞出現(xiàn)細胞病變效應(yīng)（CPE）。結(jié)論一定濃度的大蒜素在體外有抗SA11的作用。

關(guān)鍵詞：猴甲型輪狀病毒；大蒜素；抗病毒；MA104細胞

輪狀病毒（Rotavirus，RV）為雙鏈RNA病毒，外觀呈20面體結(jié)構(gòu)，RV衣殼由3層同心包裹的結(jié)構(gòu)蛋白構(gòu)成，核心含1個由11條dsRNA構(gòu)成的基因組，后者編碼12種蛋白質(zhì)，包括6種結(jié)構(gòu)蛋白與6種非結(jié)構(gòu)蛋白（nonstructural protein，NSP1-6）［1］。RV屬于呼腸弧病毒屬，是全世界范圍內(nèi)嬰幼兒非細菌性腹瀉的主要病因［2］。RV分為唾液酸非依賴及唾液酸依賴兩大類，前者包含大部分人源RV，如Wa株，后者則包含很多動物來源的RV，如非洲綠猴輪狀病毒株、猴甲型輪狀病毒等［3］。大蒜素是大蒜的有效成分，對多種病毒和致病菌均有良好的抵抗和抑菌能力［4］。研究發(fā)現(xiàn)，大蒜素通過上調(diào)某些轉(zhuǎn)錄因子、如Tbet mRNA表達而促進輔助性T細胞（helper T cell，TH1）類細胞因子干擾素-γ（Interferon-γ，IFN-γ）分泌，誘導(dǎo)和促進TH1優(yōu)勢應(yīng)答反應(yīng)，增強機體特異性細胞免疫功能而發(fā)揮抗病毒作用［5-6］。現(xiàn)通過觀察大蒜素體外對猴甲型輪狀病毒11株（simian rotavirus A，SA11）的增殖抑制作用，希望為臨床抗RV的治療提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1 實驗試劑

大蒜素（北京索萊寶公司），達爾伯克必需基本培養(yǎng)基（dulbecco's minimum essential medium，DMEM），胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS），0.25％胰酶，青霉素，鏈霉素。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)MA104細胞生長液為DMEM培養(yǎng)基，加10％FBS，在37℃、5％二氧化碳CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.2.2 SA11的保存、復(fù)蘇及培養(yǎng)MA104細胞（ATCC CRL-2378.1）廣泛用于動物和人RV的適應(yīng)性培養(yǎng)和特征鑒定。在較高的感染復(fù)數(shù)（multiplicity of infection，MOI）下（MOI≥2），感染后8～10 h可見細胞病變效應(yīng)（cytopathic effect，CPE）。SA11由基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)病原生物學(xué)實驗室儲存。病毒的復(fù)制方法：將MA104細胞以1.5×107鋪于150cm2培養(yǎng)瓶中，用10 ml預(yù)熱的DMEM培養(yǎng)基洗滌細胞。室溫解凍SA11種子液，將相當(dāng)于MOI≤0.1體積的種子液轉(zhuǎn)移到一個離心管中，加入終濃度為20 mg/ml的胰酶活化病毒，瞬時渦輪混勻，將混合物置于37℃水浴箱中孵育1 h?；罨蠹尤霟o血清DMEM培養(yǎng)基稀釋混合物至胰酶濃度＜2μg/ml后，將混合物加入洗滌后的MA104細胞中，將培養(yǎng)瓶置于37℃孵育1 h后吸棄混合物，用預(yù)熱的無血清DMEM培養(yǎng)基洗滌后加入無血清培養(yǎng)基至胰酶濃度為0.5μg/ml。細胞培養(yǎng)3～7 d，直至出現(xiàn)單層細胞完全裂解的CPE現(xiàn)象，將培養(yǎng)瓶中的細胞置入-80℃冰箱冷凍保存。將培養(yǎng)瓶中的感染細胞反復(fù)凍融3次，將細胞裂解物和培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至離心管中1 000 r/min離心5 min，將上清液分裝至1.5 ml離心管中。

1.2.3 病毒滴度測定將生長狀況良好的MA104細胞用細胞生長液制成濃度為1×106個/ml細胞懸液，每孔接種100μl接種96孔板，放入37℃、5％CO2孵箱培養(yǎng)過夜。將SA11以20 mg/ml的胰酶37℃孵育1 h。采用半對數(shù)稀釋法稀釋病毒液：第1列加入146μl 1∶10稀釋過的病毒液，其他各列每孔加入100μl DMEM培養(yǎng)基。然后用多道加樣器從第1孔吸46μl至第2孔，做系列半對數(shù)稀釋，使之成為1×10-1、1×10-1.5、1×10-2至1×10-6，每孔含有100μl病毒液。將培養(yǎng)板置于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中進行病毒吸附1 h后，吸出病毒液，每孔加入100μl含有終濃度8μg/ml胰酶的病毒維持培養(yǎng)液，另設(shè)一列陰性對照孔，37℃、5％CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。72 h以后用甲醛固定，亞甲基藍染色后觀察記錄細胞CPE情況，并計算出組織細胞半數(shù)感染量（tissue culture infective dose，TCID50）。

1.2.4 不同濃度大蒜素對MA104細胞CPE形成的影響將MA104細胞以1×106個/孔接種在6孔板內(nèi)。用磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer saline，PBS）洗滌細胞。加入以20mg/ml的胰酶37℃孵育1h后的SA11至MOI值為3，吸附1 h后，吸出病毒液。加入含有終濃度8μg/ml胰酶的病毒維持培養(yǎng)液，6孔板中分別加入終濃度為20、30、40和50 mg/ml大蒜素，同時設(shè)置未加病毒和大蒜素的陰性對照組和只加病毒而不加大蒜素的陽性對照組。繼續(xù)將培養(yǎng)板置于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。病毒感染后觀察8、24、48和72 h時的細胞病變情況，并收取各時間點的病毒上清液進行TCID50的測定。

1.2.5 大蒜素對不同MOI值的SA11的影響根據(jù)不同濃度大蒜素對SA11的抑制結(jié)果，選取最佳濃度的大蒜素，加入不同MOI值SA11感染的MA104細胞。感染后觀察8、24、48和72 h時的細胞病變情況，并收取各時間點的病毒上清液進行TCID50的測定。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，進行重復(fù)測量設(shè)計的方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1 大蒜素對MA104細胞的毒性試驗

72 h后通過觀察CPE現(xiàn)象，確定大蒜素對MA104細胞的最大無毒濃度為100 mg/ml。

2.2 病毒滴度測定

選取SA11感染的MA104細胞，用Karber公式計算TCID50。LogTCID50=L-d（s-0.5）。L為病毒滴定時所用的最低稀釋度；d為每log稀釋度的間距；s為被感染細胞的比例之和。

根據(jù)表1中的結(jié)果，代入公式計算得出SA11感染MA104細胞后的TCID50，logTCID50=-1-0.5× （4.625-0.500）=-3.0625。取對數(shù)后得出logTCID50=1×10-3.0625，TCID50=1×103.0625，結(jié)果表示，該病毒經(jīng)稀釋至1/103.0625時，每孔細胞接種0.1 ml，可使50％的細胞出現(xiàn)CPE現(xiàn)象。病毒的效價通常以每ml含有多少TCID50表示。則上述病毒的效價T=1× 103.0625TCID50/0.1 ml=1×104TCID50/ml。

表1　SA11感染MA104細胞后的TCID50值

2.3 不同濃度大蒜素對MA104細胞CPE形成的影響

SA11至MOI值為3時，8 h時各組細胞CPE現(xiàn)象不明顯，24 h時陽性對照組感染孔已出現(xiàn)明顯的CPE現(xiàn)象，添加不同濃度大蒜素的病毒感染孔的CPE現(xiàn)象與單獨病毒感染孔相比較少。48～72 h時添加不同濃度大蒜素的病毒感染孔出現(xiàn)CPE現(xiàn)象，其中大蒜素終濃度為50 mg/ml的病毒感染孔出現(xiàn)CPE現(xiàn)象較少，說明可以抑制SA11感染的MA104細胞出現(xiàn)CPE現(xiàn)象的最適大蒜素濃度為50 mg/ml。

病毒感染后收取8、24、48和72 h的病毒上清液進行TCID50的測定。SA11至MOI值為3時，8 h 時20、30、40和50 mg/ml組與對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.000），30、40和50mg/ml組與20mg/ml組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.000）；24～72 h時添加各濃度大蒜素對比單獨病毒感染孔TCID50，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，添加不同濃度大蒜素的病毒感染孔的病毒滴度低于單獨病毒感染孔，其中大蒜素終濃度為50 mg/ml的病毒感染孔TCID50值低于添加其他濃度大蒜素組，與之前CPE現(xiàn)象基本相同。見圖1和表2。

圖1　不同濃度大蒜素對MA104細胞CPE形成的影響

表2　不同時間點不同濃度大蒜素感染MA104細胞后的TCID50比較（±s）

表2　不同時間點不同濃度大蒜素感染MA104細胞后的TCID50比較（±s）

注：1）與對照組比較，P＜0.05；2）與20 mg/ml組比較，P＜0.05；3）與30 mg/ml組比較，P＜0.05；4）與40 mg/ml組比較，P＜0.05

組別　8 h　24 h　48 h　72 h　F時間值F組間值P時間值P組間值對照組　1.54±0.04　2.65±0.05　2.81±0.02　4.14±0.04 20 mg/ml組　1.37±0.031）2.57±0.03　2.7±0.011）3.76±0.091）30 mg/ml組　1.3±0.011）2）2.25±0.061）2）2.31±0.021）2）3.52±0.031）2）4 776.766 1 417.603　 0.000　 0.000 40 mg/ml組　1.27±0.031）2）2.15±0.031）2）3）2.18±0.021）2）3）3.38±0.11）2）3）50 mg/ml組　1.25±0.051）2）1.74±0.081）2）3）4）1.99±0.051）2）3）4）3.05±0.011）2）3）4）

2.4 大蒜素對不同MOI值的SA11的影響

根據(jù)不同濃度大蒜素對SA11的抑制結(jié)果，選取最佳濃度的大蒜素，即50 mg/ml，加入MOI值為1、2、3和5的SA11感染的MA104細胞，8 h時MOI值為1、2、3和5的SA11病毒感染的MA104細胞CPE現(xiàn)象不明顯（見圖2），24 h開始CPE現(xiàn)象逐漸明顯（見圖3），且隨著MOI值的加大，CPE現(xiàn)象增強（見圖4、5），說明隨著病毒量的加大，大蒜素的抑制作用減弱。

圖2 8 h時大蒜素對不同MOI值的SA11的影響

圖3　24 h時大蒜素對不同MOI值的SA11的影響

圖4　48 h時大蒜素對不同MOI值的SA11的影響

圖5　72 h時大蒜素對不同MOI值的SA11的影響

如圖6所示，病毒感染后收取8、24、48和72h的病毒上清液進行病毒TCID50的測定。24、48和72 h時添加大蒜組（+）與未添加大蒜素組（-）不同MOI值的TCID50比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），8 h添加大蒜素組與未添加大蒜素組MOI值的TCID50比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（見表3～6），與之前CPE的測定結(jié)果基本相同。見圖6。

表3　MOI=1時各時間點的比較（±s）

表3　MOI=1時各時間點的比較（±s）

注：1）與8 h比較，P＜0.05；2）與24 h比較，P＜0.05；3）與48 h比較，P＜0.05

組別　8 h　24 h　48 h　72 h　F時間值　F組間值　P時間值　P組間值MOI=1（+）　1.13±0.03　 1.33±0.031）1.63±0.031）2）2.38±0.031）2）3）1 662.247　 217.598　 0.000　 0.000 MOI=1（-）　1.12±0.01　 1.5±0.041）2.13±0.061）2）2.4±0.031）2）3）

表4　MOI=2時各時間點的比較（±s）

表4　MOI=2時各時間點的比較（±s）

注：1）與8 h比較，P＜0.05；2）與24 h比較，P＜0.05；3）與48 h比較，P＜0.05

組別　8 h　24 h　48 h　72 h　F時間值　F組間值　P時間值　P組間值MOI=2（+）　1.18±0.03　 1.5±0.011）1.83±0.111）2）2.6±0.031）2）3）802.509　 93.684　 0.000　 0.001 MOI=2（-）　1.12±0.01　 1.81±0.061）2.35±0.051）2）2.79±0.091）2）3）

表5　MOI=3時各時間點的比較（±s）

表5　MOI=3時各時間點的比較（±s）

注：1）與8 h比較，P＜0.05；2）與24 h比較，P＜0.05；3）與48 h比較，P＜0.05

組別　8 h　24 h　48 h　72 h　F時間值　F組間值　P時間值　P組間值MOI=3（+）　1.25±0.05　 1.74±0.081）1.99±0.051）2）3.05±0.011）2）3）1 892.854　 5 174.738　 0.000　 0.000 MOI=3（-）　1.24±0.04　 2.65±0.051）2.81±0.021）2）4.14±0.041）2）3）

表6　MOI=5時各時間點的比較（±s）

表6　MOI=5時各時間點的比較（±s）

注：1）與8 h比較，P＜0.05；2）與24 h比較，P＜0.05；3）與48 h比較，P＜0.05

組別　8 h　24 h　48 h　72 h　F時間值　F組間值　P時間值　P組間值MOI=5（+）　1.35±0.04　 1.89±0.021）2.56±0.071）2）4.01±0.051）2）3）1 348.661　 19 451.36　 0.000　 0.000 MOI=5（-）　2.52±0.07　 2.95±0.11）3.67±0.081）2）4.97±0.071）2）3）

圖6　大蒜素對不同MOI值的SA11的影響

3　討論

輪狀病毒是一種雙鏈核糖核酸病毒，屬于呼腸孤病毒科。輪狀病毒是引起嬰幼兒腹瀉的主要病原體之一，其主要感染小腸上皮細胞，從而造成細胞損傷，引起腹瀉［7］。它是嬰兒與幼兒腹瀉的單一主因。然而，每一次感染后人體免疫力會逐漸增強，后續(xù)感染的影響就會減輕，因而成人很少受其影響［8］。輪狀病毒總共有7個種，以英文字母編號為A、B、C、D、E、F和G。其中，A種是最為常見的一種，人類超過90％的輪狀病毒感染案例也都是由A種造成的［9］。大蒜是藥食同源，作為民間藥物歷史悠久，近年來大蒜素試劑不斷研制和開發(fā)。大蒜素作為其有效成分之一，具有抗菌、抗炎、抗病毒、免疫調(diào)節(jié)等多方面的作用。臨床上有很多報道大蒜素注射液對輪狀病毒腹瀉患兒有較好的退熱和止瀉作用［10］，可能與其提高患者免疫力或清除自由基功能有關(guān)，其抗病毒機制有待進一步研究，本實驗觀察大蒜素體外對SA11的感染是否有抑制作用，為確保細胞的安全性，避免在實驗過程中發(fā)生細胞死亡現(xiàn)象，實驗前先進行大蒜素的細胞毒性實驗，確定大蒜素對MA104細胞的最大無毒濃度為100 mg/ml。

病毒感染細胞是個動態(tài)的過程，感染的效果隨病毒量及感染時間改變而差異顯著。確定一個合適的感染狀態(tài)，是研究病毒宿主相互作用的一個重要前提，既要保證足夠的感染效率，又要有合適的病理改變。實驗提示隨著病毒MOI值的加大，感染細胞凋亡及壞死情況逐漸嚴(yán)重；從感染時間上看，感染8 h后細胞壞死不明顯，隨著感染時間延長，感染細胞凋亡及壞死情況逐漸嚴(yán)重。而病毒感染量及感染時間的確定，為下一步對大蒜素體外抗輪狀病毒感染和拓寬大蒜素的臨床應(yīng)用提供部分理論依據(jù)。

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（申海菊編輯）

Effect of garlicin on Simian rotavirus A in vitro*

Jia-mei Wang，sheng-nan Wang，Jiang-man Chen，Wei Zhao，Yong-gang Li
（Basic Medical College，Liaoning Medical University，Jinzhou，Liaoning 121000，China）

Abstract:Objective To investigate the effect of garlicin on Simian rotavirus A（SA11）in vitro. Methods Various concentrations of garlicin were used to inhibit SA11 replication so as to find out the best concentration for the inhibition. Results The maximal nontoxic concentration of garlicin for MA104 cells was 100 mg/ml. Tissue culture revealed that 50 mg/ml garlicin could inhibit the cytopathic effect of MA104 cells infected by SA11. Conclusions Garlicin could produce obvious inhibitory effects on Simian rotavirus A in vitro.

Keywords:Simian rotavirus A；garlicin；antivirus；MA104 cell

中圖分類號：R373

文獻標(biāo)識碼：A

DOI:10.3969/j.issn.1005-8982.2016.11.001

文章編號：1005-8982（2016）011-0001-06

收稿日期：2015-11-10

*基金項目：國家自然基金青年基金（No：81201285）；遼寧省博士啟動基金（No：20141134）；遼寧醫(yī)學(xué)院領(lǐng)軍人物創(chuàng)新團隊（No：173615007）

［通信作者］李永剛，E-mail：lygjo@hotmail.com；Tel：0416-4673418