苗玉和，陳生雷，劉 全，劉艷霞，夏春雷，舒秀偉

（1.遼寧益康生物股份有限公司，遼寧 遼陽 111000 2.遼寧省動物衛(wèi)生監(jiān)測預(yù)警中心，遼寧 沈陽 110001）

小鵝瘟病毒W(wǎng)株的分離與鑒定

苗玉和1，陳生雷1，劉 全2，劉艷霞1，夏春雷1，舒秀偉1

（1.遼寧益康生物股份有限公司，遼寧 遼陽 111000 2.遼寧省動物衛(wèi)生監(jiān)測預(yù)警中心，遼寧 沈陽 110001）

從山東省濰坊某鵝場病死雛鵝的心、肝和脾等組織中分離到一株病毒，通過12日齡鵝胚進(jìn)行病毒分離，并對分離病毒進(jìn)行致病性試驗、鵝胚中和試驗、瓊脂擴(kuò)散試驗及分子生物學(xué)鑒定等。結(jié)果證明，所分離的病毒為小鵝瘟病毒，命名為W株。

小鵝瘟病毒；分離；鑒定

小鵝瘟是由小鵝瘟病毒（Goose plague virus），即鵝細(xì)小病毒（Goose parvovirus，GPV）引起，主要侵害20日齡以內(nèi)小鵝和雛番鴨的一種急性、高度接觸性、敗血性傳染病。該病傳染性強(qiáng)、病程短且死亡率高，發(fā)病率和死亡率可達(dá)90%～100%，在我國各地均有流行，是嚴(yán)重威脅養(yǎng)鵝業(yè)健康發(fā)展的一種傳染病。20世紀(jì)50年代，我國學(xué)者方定一在江蘇揚州首次發(fā)現(xiàn)、分離出病原并將其命名為小鵝瘟病毒。

2008年，在山東濰坊一養(yǎng)鵝場發(fā)生疑似小鵝瘟的病例。在鵝群起初為零星發(fā)病，2 d后在鵝群中大面積流行，發(fā)病的雛鵝為3日齡。1 357只雛鵝中發(fā)病1 082只，死亡396只，發(fā)病率約為79.7%，致死

率為100%。病鵝主要表現(xiàn)精神沉郁，行走緩慢，飲欲和食欲下降，鼻腔和口腔流出無色液體；排白色或淡黃色稀糞，肛門四周沾有稀糞。病鵝離群，漸進(jìn)性消瘦，發(fā)病后1～2 d死亡。瀕死期病鵝飲食廢絕，呼吸困難，口、鼻流出無色液體，扭頭，倒地抽搐而死。病死鵝心肌及冠狀脂肪有針尖狀出血點，十二指腸彌漫性出血，腸腔膨大，腸壁變??；盲腸有香腸樣栓；腎腫脹，呈黑紅色，表面有針尖狀出血點。采集病死鵝的心、肝、脾等組織，進(jìn)行小鵝瘟病毒的分離，并進(jìn)行了各項鑒定和檢驗。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料 5日齡病死鵝心、肝、脾組織。

1.1.2 鵝胚和雛鵝 購自遼寧省豁鵝原種場，所選用的鵝場未注射過小鵝瘟疫苗，未發(fā)生過小鵝瘟，血清及卵黃抗體經(jīng)小鵝瘟瓊擴(kuò)抗體效價測定為陰性。

1.1.3 小鵝瘟陽性血清 由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)惠贈，其瓊擴(kuò)效價為1:16。

1.1.4 陽性血清 新城疫、鴨病毒性肝炎、番鴨細(xì)小病毒、鴨瘟病毒等陽性血清，購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所和福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院。

1.1.5 培養(yǎng)基 普通瓊脂平板、巧克力瓊脂平板、麥康凱瓊脂平板、厭氧內(nèi)湯，均為遼寧益康生物股份有限公司制備。

1.1.6 試劑 DNA提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司、2.5 mmol/L dNTP、Marker2000均購自TaKaRa公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.7 引物 根據(jù)GenBank上公布的鵝細(xì)小病毒B株全基因序列，針對GPV的VP3的保守基因設(shè)計了1對引物，引物序列為：

GPV-F：5′-GTGCCGATGGAGTGGGTAATGC-3′

GPV-R：5′-ATGGTGCCTTCCGTAGCCGAG-3′

擴(kuò)增片段長度為436 bp。引物合成均由英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌分離 以無菌操作從發(fā)病雛鵝的肝、脾、腎取樣接種于普通瓊脂平板、巧克力瓊脂平板、麥康凱瓊脂平板，分別于37℃ CO2培養(yǎng)箱和37℃恒溫箱中培養(yǎng)72 h，觀察培養(yǎng)結(jié)果。同時取病死雛鵝的心血、肝臟觸片，革蘭氏染色，鏡檢。

1.2.2 病毒分離 無菌采取發(fā)病雛鵝的腦、肝、脾、腎等器官，用生理鹽水制成1:5懸液，反復(fù)凍融3次，以2 500 r/min離心10 min，上清液加1 000 IU/mL青鏈霉素，37℃作用30 min，用0.22 μm濾膜過濾除菌，-20℃結(jié)凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2.1 鵝胚增殖病毒 取12日齡易感鵝胚10枚，每枚尿囊腔內(nèi)接種0.3 mL過濾病毒液，接種后置37℃孵化箱孵化，每日照胚2次，觀察216 h，72 h以前死亡的胚胎棄掉，72 h以后死亡的胚胎取出置2～8℃冷卻4～24 h，無菌收取尿囊液，同時觀察胚體病變，尿囊液作無菌檢驗和病毒含量測定。合格后-20℃保存?zhèn)溆?。將分離的病毒命名為W株。

1.2.2.2 毒力 將收獲的鵝胚病毒液用生理鹽水進(jìn)行1:100稀釋，皮下注射5日齡易感雛鵝各10只，每只1.0 mL，設(shè)10只為對照組，皮下注射生理鹽水1.0 mL，同條件下隔離飼養(yǎng)，觀察10 d，記錄雛鵝死亡情況。

1.2.3 特異性鑒定

1.2.3.1 瓊脂擴(kuò)散試驗 常規(guī)方法制備瓊脂板，中央孔加入處理好的鵝胚尿囊液，周圍孔依次加小鵝瘟陽性血清、新城疫陽性血清、鴨病毒性肝炎陽性血清、番鴨細(xì)小病毒陽性血清、鴨瘟陽性血清和健康鵝血清。置濕盒中37℃觀察24～48 h，記錄結(jié)果。

1.2.3.2 中和試驗 將鵝胚尿囊液毒分別加入5倍的新城疫病毒陽性血清、鴨瘟病毒陽性血清、小鵝瘟陽性血清、鴨病毒性肝炎陽性血清、番鴨細(xì)小病毒陽性血清混合均勻后，置37℃中和1 h，尿囊腔內(nèi)接種12日齡鵝胚各10枚，每胚0.3 mL，觀察216 h，記錄鵝胚死亡情況。

1.2.4 分子生物學(xué)鑒定 取收獲的W株鵝胚尿囊液進(jìn)行病毒DNA的提取，以提取得DNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系為：Taq酶0.13 μL，10×PCR Buffer（含MgCl2）2.5 μL，2.5 mmol/L dNTP 2 μL，上游引物和下游引物分別1 μL，小鵝瘟病毒DNA 5 μL，ddH2O 13.37 μL。反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性3 min；95℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s，進(jìn)行30個循環(huán)；72℃延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后取產(chǎn)物進(jìn)行1.0%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

取鑒定陽性的PCR產(chǎn)物送寶生物（大連）公司進(jìn)行測序，測序結(jié)果采用DNASTAR軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌培養(yǎng) 將病死鵝心血、肝臟涂片、染色、鏡檢未觀察到細(xì)菌；病料在普通瓊脂平板、巧克力瓊脂平板、麥康凱瓊脂平板上培養(yǎng)3 d，均無細(xì)菌生長。

2.2 病毒增殖 將過濾的病毒組織懸液接種鵝胚，在接種后72～192 h，鵝胚19/20死亡。48 h死亡的1枚棄掉不計，剩余19枚死亡鵝胚分別收取尿囊液并剖檢胚體，觀察病變。剖檢胚體尿囊膜增厚；頭部和兩脅皮下水腫；死亡胚體充血和出血，尤其在翅尖、兩蹊、喙旁、頸部等處均有嚴(yán)重的出血點；胚肝充血，呈黃褐色；心臟和小腦出血，收獲的E1代尿囊液病毒含量為105.12ELD50/0.3 mL。

2.3 雛鵝接種試驗 將E1病毒液接種5日齡雛鵝，在接種后第2天開始發(fā)病，7 d內(nèi)死亡9只。發(fā)病雛鵝精神萎頓，食欲減退，直至廢絕，鼻腔有黏液，排出綠色混有氣泡糞便；剖檢注射后2 d死亡雛鵝，僅見腸黏膜嚴(yán)重充、出血，肝、脾微腫；注射后第5天死亡雛鵝，小腸黏膜脫落，凝固，剖開回盲部見有灰白色栓子，質(zhì)地堅硬，將腸腔堵塞；膽囊膨大充滿膽汁，肝臟呈黃色，心冠狀脂肪有針尖大小點狀出血。耐過雛鵝生長緩慢，發(fā)育不良；對照組雛鵝健康，未出現(xiàn)臨床癥狀。雛鵝死亡結(jié)果見表2。

表1 鵝胚死亡結(jié)果Table1 The results of goose embryo death

從表2結(jié)果可以看出，分離的小鵝瘟病毒鵝胚尿囊液E1代病毒注射5日齡雛鵝9/10死亡，對照組10/10健活。

2.4 病毒鑒定

表2 鵝胚尿囊液接種雛鵝死亡情況Table2 The results of inoculation of goose embryo allantoic fluid of goslings death

2.4.1 在瓊脂擴(kuò)散試驗中，待檢病毒抗原與小鵝瘟陽性血清間出現(xiàn)清晰白色沉淀線，而與新城疫陽性血清、鴨病毒性肝炎陽性血清、番鴨細(xì)小病毒陽性血清、鴨瘟病毒陽性血清和健康鵝血清均未出現(xiàn)沉淀線。

2.4.2 分離的小鵝瘟病毒與各陽性血清中和后接種鵝胚，結(jié)果見表3。

從表3結(jié)果可以看出，鵝胚尿囊液毒可被小鵝瘟陽性血清中和，但不能被新城疫陽性血清、鴨瘟病毒陽性血清、鴨肝炎病毒陽性血清、番鴨細(xì)小病毒陽性血清中和。

2.5 分子生物學(xué)鑒定 根據(jù)GenBank上公布的鵝細(xì)小病毒B株全基因序列，針對GPV的VP3的保守基因設(shè)計了1對引物GPV-F/GPV-R經(jīng)PCR擴(kuò)增后得到436 bp目的片段，結(jié)果見圖1。測序結(jié)果通過NCBI BLAST后，與小鵝瘟病毒序列比對，該分離病毒與國內(nèi)GDa株，SH株同源性為100%，與國外分離株B株同源性為95%。進(jìn)一步確定該病毒株為鵝細(xì)小病毒毒株。

3 討論與小結(jié)

3.1 采用山東濰坊某鵝場發(fā)病鵝病料接種12日齡鵝胚，經(jīng)雛鵝回歸試驗、瓊脂擴(kuò)散試驗、鵝胚中和試驗，結(jié)果顯示，該病毒能引起雛鵝發(fā)病，能被小鵝瘟病毒陽性血清中和，不被新城疫病毒、鴨瘟病毒、鴨肝炎病毒和番鴨細(xì)小病毒等抗血清中和。證明該分離病毒為小鵝瘟病毒，鵝胚尿囊液病毒含量為105.12ELD50/0.3 mL。

3.2 通過PCR檢測、基因測序與分析，所分離的病毒基因序列與GenBank上公布的鵝細(xì)小病毒基因序列比對，基因同源性達(dá)95%以上。證明該分離株為小鵝瘟病毒，將其命名為W株。

3.3 對小鵝瘟的預(yù)防主要是采用疫苗進(jìn)行免疫，目前廣泛使用的是小鵝瘟鵝胚化活疫苗，然而，隨著預(yù)防接種的母鵝越來越多，鵝胚化疫苗株不斷通過和適應(yīng)于母鵝而增強(qiáng)毒力，同時由于水禽免疫的復(fù)雜性，母鵝的免疫效果十分不理想，雛鵝產(chǎn)生的母源抗體有限，不能有效抵抗小鵝瘟病毒的感染，初生雛鵝往往需要采用抗體制劑進(jìn)行預(yù)防和治療。小鵝瘟病毒W(wǎng)株的分離鑒定，為進(jìn)一步研制針小鵝瘟的抗體制劑、疫苗等工作奠定了基礎(chǔ)。

表3 中和試驗結(jié)果Table3 The results of neutralization test

圖1 病毒液PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 PCR amplification results of Virus

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Isolation and identification of Gosling Plague virus W strain

Miao Yuhe1,Chen Shenglei1,Liu Quan2,Liu Yanxia1, Xia Chunlei1,Shu Xiuwei1
（1.Liaoning Yikang Blological Corporation Limited,Liaoning Liaoyang 111000; 2.Liaoning Province animal health monitoring and early warning center,Liaoning Shenyang 110001）

A virus was isolated from goose heart,liver and spleen tissues by 12 day old goose embryo.The virus was identificated by Pathogenicity test,neutralization test,agar diffusion test and molecular biology.The results show that the isolated virus was gosling plague virus, named W strain.

Gosling Plague virus;Isolation;Identification

S852.65

：B

：1672-9692(2016)09-0006-05

2016-08-09

苗玉和（1966-），男，博士，研究方向為獸醫(yī)免疫學(xué)，研究員，副總經(jīng)理，主要負(fù)責(zé)獸用生物制品技術(shù)研究開發(fā)和質(zhì)量檢驗管理等工作。