孫光野，張 露，王珊珊，侯喜林

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，黑龍江 大慶 163319）

檢測(cè)牛奶中布魯氏菌套式PCR方法的建立

孫光野，張 露，王珊珊，侯喜林*

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，黑龍江 大慶 163319）

為了建立一種快速檢測(cè)牛奶中布魯氏菌的方法，本研究采用套式PCR的方法，通過(guò)對(duì)PCR條件的優(yōu)化，改進(jìn)布魯氏菌提取DNA方法，經(jīng)驗(yàn)證，最佳退火溫度50.1℃、dNTP最佳濃度為0.2 mM、引物最佳濃度為0.4 μM 、Taq DNA聚合酶最佳濃度為0.1 μL、本方法最小檢測(cè)菌數(shù)為8個(gè)。說(shuō)明用套式PCR的方法提高了檢測(cè)牛奶中布魯氏菌的敏感性。

布魯氏菌；套式PCR；奶樣

布魯氏菌病于1859年由Morston首次報(bào)道[1]，是由布魯氏桿菌引起的一種全世界廣泛分布的人獸共患慢性細(xì)菌傳染病。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）已將其列為B類動(dòng)物疫病，我國(guó)將其列為二類動(dòng)物疫病[2]。

布魯氏菌?。˙rucellosis）病原是布魯氏桿菌（Brucella），它是革蘭氏陰性的兼性細(xì)胞內(nèi)寄生菌，主要侵害動(dòng)物的淋巴系統(tǒng)和生殖系統(tǒng)，可以引發(fā)世界范圍內(nèi)人和牲畜及野生哺乳動(dòng)物的感染[3]。目前，流行病學(xué)、臨床病理變化、細(xì)菌學(xué)和血清學(xué)等方法均能診斷本病[4-5]。血清學(xué)診斷方法有很多，包括平板凝集反應(yīng)、試管凝集反應(yīng)、虎紅平板凝集反應(yīng)、補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)[6]、ELISA等，雖然上述方法均可檢測(cè)布魯氏菌病，但由于檢測(cè)結(jié)果不夠精確，存在假陰性可能，均不能適應(yīng)現(xiàn)代快速檢驗(yàn)檢疫需求。實(shí)際臨床操作時(shí)往往需要多種方法結(jié)合應(yīng)用，成本較高，耗費(fèi)時(shí)間。因此，尋求一種快速檢測(cè)奶樣布魯氏菌的方法迫在眉睫，本文利用CTAB/NaCl方法提取牛奶樣品的布氏桿菌染色體DNA，以特異性引物進(jìn)行套式PCR擴(kuò)增，建立牛奶樣品布氏桿菌套式PCR檢測(cè)方法，對(duì)奶牛感染布氏桿菌病進(jìn)行普查和監(jiān)測(cè)，為牛奶制品的食品安全監(jiān)測(cè)提供新的技術(shù)手段。建立一種高效準(zhǔn)確的布魯氏菌診斷方法，為在實(shí)際生產(chǎn)中檢測(cè)奶樣中布魯氏菌病奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株 S2型豬布魯氏菌疫苗株由黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院預(yù)防獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室保存

1.2 引物 根據(jù)GenBank中公布豬型布魯氏菌外膜蛋白 25ku基因序列（GenBank 登錄號(hào)為：AM712381），應(yīng)用Oligo 6.0軟件設(shè)計(jì)2對(duì)引物。由上海生工生物工程有限公司合成。

外部上游OMP1：5’-CGTGCCGCAATACCCTC-3’

外部下游OMP2：5’-CCGTCAGCTTGGCTTCGA-3’

內(nèi)部上游OMP3：5’-GATGCTGCCCGCCCGATAA-3’

內(nèi)部下游OMP4：5’-GCACCGAGCGAGCCTTGAAA-3’

2 試驗(yàn)方法

2.1 細(xì)菌培養(yǎng) 在布氏桿菌培養(yǎng)基平板上劃線接種S2型豬布魯氏菌，在37℃保溫箱里放置24 h，挑取單菌落接種到液體培養(yǎng)基，37℃溫箱培養(yǎng)OD600≈0.5。

2.2 細(xì)菌計(jì)數(shù) 取50 μL細(xì)菌培養(yǎng)物，以液體培養(yǎng)基進(jìn)行連續(xù)10倍的倍比稀釋，取10-5、10-6、10-7稀釋的菌液各100 μL均勻涂布于瓊脂平板，置37℃溫箱培養(yǎng)24 h，對(duì)各稀釋度進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。

2.3 布魯氏菌基因組的提取 參照邱昌慶等[5]和杜振昆等[2]報(bào)道的方法，應(yīng)用CTAB/NaCl[6]方法，并在此基礎(chǔ)上加以改進(jìn)。具體方法如下：取1 mL不同稀釋度的布魯氏菌奶樣于離心管中，10 000 r/ min離心10 min，棄掉上清液，加100 μL NET懸浮沉淀；加入100 μL 24%SDS，置于80℃孵育10 min，冰上冷卻3 min；在邱昌慶的步驟中提到了使用蛋白酶K和RNaseA的終濃度為325 μg/μL和75 μg/μL，分別作用2 h。本研究將蛋白酶K和RNaseA的終濃度都定為800 μg/mL，置于50℃水浴2 h。加入預(yù)熱至65℃的CTAB/NaCl 300 μL，置于65℃水浴鍋中10 min。加入600 μL酚-氯仿-異戊醇，顛倒混勻，10 000 r/min離心5 min，將上清液移入另一離心管中，加入600 μL酚-氯仿-異戊醇，重復(fù)操作；在上清液中加入400 μL的異丙醇，混勻，室溫放置5 min，10 000 r/min離心10 min，棄上清液。用1 mL 70%的乙醇洗2次，混勻，l0 000 r/ min離心2 min。加100 μL無(wú)菌去離子水，溶解DNA。

2.4 套式PCR擴(kuò)增體系及循環(huán)參數(shù) PCR一擴(kuò)反應(yīng)體系。10×PCR buffer 2.5 μL，2.5 mM dNTP 2 μL，上下游引物各0.5 μL，模板0.5 μL；TAKARA Taq DNA聚合酶0.2 μL；補(bǔ)水至25 μL；循環(huán)參數(shù)為：PCR反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性5 min；94℃變性1 min，50℃退火1 min，72℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min。

二擴(kuò)反應(yīng)體系采用25 μL反應(yīng)體系，10×PCR buffer 2.5 μL，2.5 mM dNTP 2 μL，上下游引物各0.5 μL，模板1 μL；TAKARA Taq DNA聚合酶0.2 μL；補(bǔ)水至25 μL；循環(huán)參數(shù)為：95℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，50℃退火1 min，72℃延伸1 min，20個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸6 min。

2.5 套式PCR條件的優(yōu)化

2.5.1 退火條件的優(yōu)化 選擇8個(gè)溫度進(jìn)行優(yōu)化，分別為46、47.1、47.9、48.8、50.1、51、52.6和54℃，其他條件按上述參數(shù)設(shè)置，進(jìn)行套式PCR反應(yīng)，確定最佳的退火溫度。

2.5.2 dNTP最佳濃度優(yōu)化 選取dNTP終濃度分別為0.05、0.1、0.2、0.4、0.8、1.2和1.6 mm，7個(gè)梯度，其他條件不變，進(jìn)行套式PCR反應(yīng)，確定最佳的dNTP濃度。

2.5.3 引物濃度的優(yōu)化 引物的終濃度分別為0.08、0.16、0.24、0.32、0.4、0.48、0.56和0.62 μm，其他條件不變，進(jìn)行套式PCR反應(yīng)，確定最佳引物濃度。

2.5.4 Taq DNA聚合酶濃度優(yōu)化 體系中Taq DNA聚合酶分別為0.05、0.1、0.15、0.2、0.25和0.3 μL，其他條件不變，進(jìn)行套式PCR反應(yīng)，確定最佳的Taq DNA聚合酶濃度。分別取4 μL上樣進(jìn)行1.2%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像儀中觀察擴(kuò)增結(jié)果。

2.5.5 敏感性試驗(yàn) 對(duì)菌液進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)，確定細(xì)菌數(shù)為8×106CFU/mL，然后利用奶樣對(duì)菌液進(jìn)行10倍連續(xù)稀釋，分別取1 mL進(jìn)行基因組DNA提取和套式PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳、凝膠成像儀檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果。

3 結(jié)果

3.1 PCR條件優(yōu)化結(jié)果

3.1.1 退火溫度的優(yōu)化 最佳退火溫度為50.1℃，結(jié)果見(jiàn)圖1。

3.1.2 dNTP濃度優(yōu)化 dNTP最佳濃度為0.2 mm（2 μL），結(jié)果見(jiàn)圖2。

3.1.3 引物濃度優(yōu)化 引物最佳濃度為各0.4 μM（0.5 μL），結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖1 退火溫度優(yōu)化Fig.1 Annealing temperature optimization

圖2 dNTP濃度優(yōu)化Fig.2 dNTP Concentration optimization

圖3 引物濃度優(yōu)化Fig.3 Optimization of primer concentration

3.1.4 Taq DNA聚合酶濃度優(yōu)化 Taq DNA聚合酶最佳濃度為0.1 μL，結(jié)果見(jiàn)圖4。

3.2 敏感性試驗(yàn)結(jié)果 應(yīng)用上述最優(yōu)的套式PCR方法，最佳退火溫度50.1℃、dNTP最佳濃度為0.2 mm、引物最佳濃度為0.4 μm、Taq DNA聚合酶最佳濃度為0.1 μL，進(jìn)行的敏感性試驗(yàn)檢測(cè)布魯氏菌的最少菌數(shù)為8 CFU/mL，結(jié)果見(jiàn)圖5。。

圖4 Taq DNA聚合酶濃度優(yōu)化Fig.4 Taq DNA Optimization of polymerase concentration

圖5 套式PCR敏感性檢測(cè)Fig.5 Nested PCR sensitivity test

4 討論

在布魯氏菌病研究中，用PCR的方法檢測(cè)布魯氏菌病始見(jiàn)于1990年，F(xiàn)ekete等[8]最早利用PCR擴(kuò)增布魯氏菌外膜蛋白基因。1997年首次將PCR應(yīng)用于中國(guó)布病患者的診斷。Bosnakovsk等首次建立了牛乳中布魯氏菌外膜蛋白（OMP）25 Ku套式PCR檢測(cè)技術(shù)，試驗(yàn)結(jié)果表明，此方法具有較強(qiáng)的特異性，只擴(kuò)增布魯氏菌DNA。據(jù)Lucer報(bào)道也有人用其他的布魯氏菌基因區(qū)設(shè)計(jì)引物進(jìn)行試驗(yàn)，均能特異性地檢測(cè)到布魯氏菌核酸。

鑒于此國(guó)內(nèi)外學(xué)者開(kāi)展了利用PCR方法檢測(cè)布魯氏菌的研究。2005年邱昌慶等[7]通過(guò)擴(kuò)增布魯氏菌外膜蛋白建立了套式PCR檢測(cè)奶樣中布魯氏菌，其檢測(cè)的靈敏度為50 CFU/mL。本研究根據(jù)邱昌慶發(fā)表的奶牛布魯氏菌病PCR診斷技術(shù)的提取DNA方法的基礎(chǔ)上優(yōu)化了提取DNA的步驟。在邱昌慶的提取DNA步驟中提到了使用蛋白酶K和RNaseA的終濃度為325 μg/μL和75 μg/μL，分別作用2 h。本研究應(yīng)用CTAB/NaCl，并且將蛋白酶K和RNaseA的終濃度都定為800 μg/mL，共同作用2 h，提取DNA效果較好，然后對(duì)套式PCR條件進(jìn)行了優(yōu)化，優(yōu)化后套式PCR的靈敏度8 CFU/mL，證明本研究建立的方法結(jié)果可靠，靈敏度高，節(jié)省成本，節(jié)省時(shí)間。本研究為以后實(shí)際生產(chǎn)中檢測(cè)奶樣奠定基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)

[1]Aleixo M J,erreira M L,Antunes F.Brucellosis[J].1999,12(12):323-330.

[2]杜振昆，郭軍慶，張妙仙，等.牛奶樣品布氏桿菌套式PCR檢測(cè)方法的建立[J].浙江大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，34（2）：169-174.

[3]何明清.畜禽傳染病的防治[M].成都：四川科學(xué)技術(shù)出版社，1985：167-168.

[4]Mantur B G,Mangalgi S S,Mulimaig B.Burcella melitensis-a sexually transmissible agent [J].Lancet,1996,347:1763.

[5]Ruben B,Band J D,Wong P,et al.Person-toperson tras-mission of burcella melitensis [J].Lancet,1991,337:14-5.

[6]孫耀貴，黃姜生，陳佳.三種血清學(xué)方法檢測(cè)奶牛布魯氏桿菌病的比較試驗(yàn)[J].黑龍江畜牧獸醫(yī)，2005（1）：42-43.

[7]邱昌慶，曹小安.乳牛布魯氏菌病病原DNA快速檢測(cè)技術(shù)的研究[J].中國(guó)獸醫(yī)科技，2005，35（2）：85-89.

[8]Fekete A,Bantle J A,Halling S M,et al.Preliminary development of a diagnostic test for Brucella using polymerase chain reaction [J].Journal of Applied Bacteriology,1990, 69(2）:216-227.

For detection of Brucella in milk nested PCR methods

Sun Guangye,Zhang Lu,Wang Shanshan,Hou Xilin*
(College of animal science and technology,Heilongjiang Bayi Agricultural University,Heilongjiang Daqing 163319)

In order to establish a method for Brucella in milk rapid detection,this study nested PCR method,by optimizing PCR conditions,improved Brucella DNA extraction method,proven,optimal annealing temperature of 50.1℃,best dNTP concentration is 0.2 mM,optimum primer concentration was 0.4 μM,Taq DNA polymerase,the optimal concentration was 0.1 μL,the present method is the minimum number of detected bacteria 8.The results show that by nested PCR method to improve the sensitivity of detection of Brucella in milk.

Brucella;Nested-pcr;Milk sample

S852.61+9

：B

：1672-9692(2016)09-0001-05

2016-07-09

孫光野（1992-），男，碩士研究生，研究方向?yàn)閯?dòng)物傳染病診斷。

侯喜林（1965-），男，博士，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)閯?dòng)物傳染病診斷與防治。