朱星樽，黎明，袁莉霞，李冰，陳雨詩(shī)，謝雨欣，王日昕

（1.東北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，吉林長(zhǎng)春130024；2.寧波大學(xué)海洋學(xué)院，浙江寧波315211）

鎘脅迫對(duì)黃顙魚(yú)幼魚(yú)抗氧化酶活性及免疫應(yīng)答的影響

朱星樽1，2，黎明2，袁莉霞2，李冰2，陳雨詩(shī)2，謝雨欣2，王日昕2

（1.東北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，吉林長(zhǎng)春130024；2.寧波大學(xué)海洋學(xué)院，浙江寧波315211）

為了研究急性鎘（Cd2+）脅迫對(duì)黃顙魚(yú)幼魚(yú)肝臟抗氧化酶活性及非特異性免疫應(yīng)答的影響，實(shí)驗(yàn)挑選初始體質(zhì)量為（5.94±0.05）g的健康黃顙魚(yú)幼魚(yú)，隨機(jī)分成2個(gè)處理組，每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)，開(kāi)展為期96 h的急性Cd2+脅迫實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明：高Cd2+組實(shí)驗(yàn)魚(yú)肝臟中超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶和谷胱甘肽還原酶活性在6 h時(shí)達(dá)到最高，而硫代巴比妥酸反應(yīng)物含量在12 h時(shí)達(dá)到最高；高Cd2+組實(shí)驗(yàn)魚(yú)肝臟中溶菌酶（LYZ）、堿性磷酸酶（AKP）和酸性磷酸酶（ACP）活性顯著低于低Cd2+組；高Cd2+組實(shí)驗(yàn)魚(yú)肝臟中LYZ、AKP及ACP活性最低值出現(xiàn)在48～96 h。研究表明，急性Cd2+脅迫產(chǎn)生的大量自由基并不能被機(jī)體自身的抗氧化酶體系完全清除；高Cd2+濃度會(huì)對(duì)抗氧化和免疫應(yīng)答體系造成不同程度的抑制。

鎘；抗氧化酶；免疫應(yīng)答；黃顙魚(yú)

環(huán)境中的鎘（Cadmium，Cd）是一種具有遺傳毒性的重金屬，被國(guó)際癌癥研究會(huì)（IARC）列為I級(jí)致癌物[1]。環(huán)境中的Cd2+主要來(lái)源于工、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，由于環(huán)境中的Cd2+不能被微生物降解，隨著工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的發(fā)展，環(huán)境中的Cd2+含量逐年上升，尤其是污染的重災(zāi)區(qū)——江、河、湖泊及地下水等，而它們往往是城市飲用水的主要來(lái)源，監(jiān)測(cè)水環(huán)境中Cd2+污染的程度顯得尤為重要。在環(huán)境評(píng)測(cè)中，生物檢測(cè)的作用日益受到關(guān)注。迄今，有關(guān)重金屬污染的生物檢測(cè)，主要集中在重金屬富集等研究方面，國(guó)內(nèi)鮮有研究從生理學(xué)的角度，將動(dòng)物的代謝紊亂、氧化損傷及免疫抑制等列入評(píng)價(jià)指標(biāo)。事實(shí)上，作為環(huán)境污染的直接參與者，水生動(dòng)物生理的變化，能夠直接或間接在一定范圍人群中表現(xiàn)出來(lái)。

利用魚(yú)體內(nèi)生理反應(yīng)中關(guān)鍵酶的活性來(lái)驗(yàn)證污染物對(duì)生物的影響，將其作為環(huán)境評(píng)價(jià)手段，國(guó)外不少學(xué)者已進(jìn)行了許多有益的探索。近年來(lái)，越來(lái)越多的研究將目光集中到氧化損傷和免疫抑制的評(píng)價(jià)上。超氧化物歧化酶（SOD）是生物體內(nèi)唯一以直接自由基作為底物的酶，能夠?qū)⒊蹶庪x子（Superoxide anion）通過(guò)歧化反應(yīng)轉(zhuǎn)變?yōu)镠2O2，但H2O2是具有細(xì)胞毒性的，一方面，機(jī)體能夠通過(guò)過(guò)氧化物酶（CAT）途徑將H2O2催化生成H2O和O2，另一方面，通過(guò)谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GPX）途徑將H2O2催化生成H2O[2]。然而，徐立紅等[3]推測(cè)，重金屬Cd2+能夠直接作用于抗氧化酶系統(tǒng)，導(dǎo)致氧化損傷、炎性應(yīng)激及免疫抑制，但尚未提供直接的證據(jù)。

黃顙魚(yú)Pelteobagrus fulvidraco是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)，為雜食偏肉食性，在我國(guó)長(zhǎng)江和珠江流域自然水體中分布較為廣泛，其肌肉中含有人體所需的多種必需氨基酸，尤其是沒(méi)有肌間刺的優(yōu)點(diǎn)，深受廣大老百姓的喜愛(ài)。黃顙魚(yú)具有的較強(qiáng)氨氮耐受能力的特質(zhì)，使其成為開(kāi)展本研究絕佳的實(shí)驗(yàn)對(duì)象。本研究以黃顙魚(yú)幼魚(yú)為研究對(duì)象，開(kāi)展為期96 h的急性Cd2+脅迫實(shí)驗(yàn)，試圖探究Cd2+對(duì)魚(yú)類(lèi)抗氧化酶系統(tǒng)及免疫應(yīng)答系統(tǒng)的影響程度，以期對(duì)環(huán)境監(jiān)測(cè)及魚(yú)類(lèi)生理學(xué)研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 預(yù)實(shí)驗(yàn)、養(yǎng)殖管理及取樣

黃顙魚(yú)幼魚(yú)（5.94±0.05）g購(gòu)自浙江嘉興，暫養(yǎng)30 d后，設(shè)置4個(gè)Cd2+水平：0.005，0.05，0.5和5 mg/L（參考國(guó)家漁業(yè)水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)中所規(guī)定的Cd2+離子濃度為0.005 mg/L，3個(gè)濃度組分別為標(biāo)準(zhǔn)濃度的10、100和1 000倍），每個(gè)水平設(shè)置3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)30尾魚(yú)，96 h后統(tǒng)計(jì)累計(jì)死亡率，通過(guò)軟件擬合，獲得半致死濃度為2.4 mg/L Cd2+，用于正式實(shí)驗(yàn)。

挑選大小均勻、體格健壯的魚(yú)苗，隨機(jī)分配到6個(gè)300 L塑料養(yǎng)殖桶中（每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)），每桶40尾。實(shí)驗(yàn)共設(shè)置2個(gè)Cd2+水平：0.005（對(duì)照）和2.4 mg/L Cd2+。養(yǎng)殖過(guò)程中，養(yǎng)殖用水為除氯自來(lái)水，每天更換相同Cd2+濃度的水，日換水量為總體積的1/3，水溫27～29℃，溶氧（7.58±0.15）mg/L，亞硝酸鹽<0.5 mg/L，保持自然光照。脅迫周期為96 h。

取樣時(shí)間點(diǎn)包括：0，6，12，24，48和96 h。在每一個(gè)取樣時(shí)間，每缸隨機(jī)挑選3尾魚(yú)，MS-222（120 mg/ L）麻醉后，解剖獲得肝臟，保存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2 抗氧化酶活性及過(guò)氧化程度分析

稱(chēng)取0.1 g肝臟樣品，放入預(yù)冷的磷酸緩沖液（50 mM，pH 7.4）中勻漿，勻漿液于4℃環(huán)境中2 000 r/min離心15 min分離上清液備測(cè)。超氧化物歧化酶（SOD）的測(cè)定參考BEAUCHAMP,et al[4]報(bào)道的方法；過(guò)氧化氫（CAT）的測(cè)定參考AEBI[5]報(bào)道的方法；谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GPX）的測(cè)定參考FLOH魪,et al[6]報(bào)道的方法；谷胱甘肽還原酶（GR）的測(cè)定參考CHING,et al[7]報(bào)道的方法；硫代巴比妥酸反應(yīng)物（TBARS）的測(cè)定參考BUEGE,et al[8]報(bào)道的方法。所有分析均采用商業(yè)試劑盒（南京建成生物工程研究所），嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行。

1.3 溶菌酶、堿性磷酸酶、酸性磷酸酶活性分析

稱(chēng)取0.1 g肝臟樣品，放入預(yù)冷的磷酸緩沖液（50 mM,pH 7.4）中勻漿，勻漿液于4℃環(huán)境中2 000 r/min離心15 min，分離上清液備測(cè)。溶菌酶（LYZ）活性測(cè)定參考HULTMARK,et al[9]報(bào)道的方法；堿性磷酸酶（AKP）活性測(cè)定參考ENGSTAD,et al[10]報(bào)道的方法；酸性磷酸酶（ACP）活性測(cè)定參考GROVE,et al[11]報(bào)道的方法測(cè)試分析采用商業(yè)試劑盒（南京建成生物工程研究所），操作步驟嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤（mean±S.E.）表示，差異顯著性設(shè)置P<0.05。鎘脅迫濃度差異采用t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理；鎘脅迫時(shí)間差異采用單因素方差分析（one-way ANOVA），采用鄧肯檢驗(yàn)（Duncan's Multiple Range test）對(duì)顯著性差異進(jìn)行比較。所有分析均采用SPSS 18.0.0（Chicago,USA）在Windows操作系統(tǒng)中進(jìn)行。

2 結(jié)果

低Cd2+組（對(duì)照組）實(shí)驗(yàn)魚(yú)肝臟中SOD、CAT、GPX和GR活性及TBARS含量在96h實(shí)驗(yàn)周期內(nèi)并未檢測(cè)出顯著性差異（表1，P>0.05）；高Cd2+組（實(shí)驗(yàn)組）實(shí)驗(yàn)魚(yú)肝臟中SOD、GPX和GR活性在6 h時(shí)達(dá)到最高，隨后逐漸降低（P<0.05），其中，SOD和GR活性在12～96 h之間無(wú)顯著性差異（P>0.05）；高Cd2+組實(shí)驗(yàn)魚(yú)肝臟中TBARS含量在12 h時(shí)達(dá)到最高，隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)（P<0.05），并未發(fā)生顯著性變化（P>0.05）。高Cd2+組實(shí)驗(yàn)魚(yú)肝臟中CAT活性在各取樣時(shí)間點(diǎn)之間無(wú)顯著性差異（P>0.05）。

表1 鎘脅迫不同時(shí)間黃顙魚(yú)肝臟抗氧化酶活性及脂質(zhì)過(guò)氧化程度Tab.1Liver antioxidant enzyme activities and lipid peroxidation levels at different times in Pelteobagrus fulvidraco during

高Cd2+組實(shí)驗(yàn)魚(yú)肝臟中LYZ、AKP和ACP活性顯著低于低Cd2+組（表2，P<0.05）；低Cd2+組實(shí)驗(yàn)魚(yú)肝臟中LYZ、AKP和ACP活性在96 h實(shí)驗(yàn)周期內(nèi)并未檢測(cè)出顯著性差異（P>0.05）；高Cd2+組實(shí)驗(yàn)魚(yú)肝臟中LYZ活性在3 h時(shí)達(dá)到最高，隨后逐漸降低，最低值出現(xiàn)在48～96 h（P<0.05）；高Cd2+組實(shí)驗(yàn)魚(yú)肝臟中AKP和ACP活性隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)呈下降趨勢(shì)，最低值出現(xiàn)在48～96 h（P<0.05）。

表2 鎘脅迫不同時(shí)間黃顙魚(yú)免疫應(yīng)答能力Tab.2Nonspecific immune responses at different times in P.fulvidraco during 96 h exposure to high or low concentrations of environmental ammonia

3 討論

前人的研究認(rèn)為，水生動(dòng)物重金屬中毒效應(yīng)主要體現(xiàn)在自由基介導(dǎo)的氧化損傷[3,12]。環(huán)境中的Cd2+通過(guò)鰓、皮膚等組織進(jìn)入動(dòng)物體內(nèi)，能夠激活N-甲基-D-天冬氨酸受體（NMDA），繼而產(chǎn)生大量的自由基（ROS），導(dǎo)致蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)破壞[13]及細(xì)胞膜過(guò)氧化[14]，主要原因是過(guò)氧化產(chǎn)物—醛酮類(lèi)物質(zhì)的過(guò)度積累，它能夠與蛋白質(zhì)、核酸及磷脂發(fā)生交聯(lián)聚合，導(dǎo)致細(xì)胞毒性，加速細(xì)胞和組織功能的喪失[8]。本研究發(fā)現(xiàn)，高Cd2+組實(shí)驗(yàn)魚(yú)肝臟中TBARS含量隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，呈不斷升高趨勢(shì)，表明組織過(guò)氧化程度與Cd2+毒性積累存在明顯的劑量依賴(lài)效應(yīng)，這種現(xiàn)象很可能是造成魚(yú)類(lèi)Cd2+中毒死亡的主要原因之一。正常情況下，魚(yú)類(lèi)清除ROS依賴(lài)一些抗氧化酶類(lèi)，包括：超氧化物歧化酶、過(guò)氧化物酶及谷胱甘肽過(guò)氧化物酶[15]。SOD能夠?qū)⒊蹶庪x子轉(zhuǎn)變?yōu)镠2O2，阻止ROS對(duì)機(jī)體的直接傷害，隨后，機(jī)體通過(guò)CAT途徑（催化H2O2生成H2O和O2）和GPX途徑（催化H2O2生成H2O）進(jìn)一步清除有毒的H2O2[2]。本研究發(fā)現(xiàn)，肝臟中抗氧化酶活性隨著脅迫時(shí)間的延續(xù)，呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)。徐立紅等[3]研究認(rèn)為，Cd2+能夠直接作用與細(xì)胞的抗氧化酶系統(tǒng)。因此本研究發(fā)現(xiàn)的高Cd2+組實(shí)驗(yàn)魚(yú)肝臟中SOD、GPX和GR活性在前6 h內(nèi)表現(xiàn)出的升高趨勢(shì)，很可能是一種毒性興奮效應(yīng)。然而，隨著Cd2+脅迫時(shí)間的延續(xù)，高Cd2+組實(shí)驗(yàn)魚(yú)肝臟中抗氧化酶活性逐漸趨于穩(wěn)定，這種肝臟組織中抗氧化酶活性出現(xiàn)的“飽和”現(xiàn)象很可能是動(dòng)物應(yīng)對(duì)“重金屬中毒”進(jìn)化出的一種適應(yīng)性保護(hù)機(jī)制[16]。

劉艷平等[17]認(rèn)為，隨著環(huán)境中Cd2+濃度升高，鳙魚(yú)血細(xì)胞的微核細(xì)胞率升高，表現(xiàn)出明顯的量效關(guān)系。陳昌玉等[18]發(fā)現(xiàn)，Cd2+能誘導(dǎo)胭脂魚(yú)血細(xì)胞發(fā)生典型的凋亡，而且細(xì)胞凋亡率與Cd2+的濃度和處理時(shí)間成明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系。本研究也獲得了相同的結(jié)果，高Cd2+組實(shí)驗(yàn)魚(yú)肝臟中LYZ、AKP和ACP活性顯著低于對(duì)照組。本研究還發(fā)現(xiàn)，高Cd2+組實(shí)驗(yàn)魚(yú)肝臟中LYZ、AKP和ACP活性在48 h前并未出現(xiàn)顯著下降趨勢(shì)，而48 h后均表現(xiàn)出不同程度的下降趨勢(shì)，本研究推測(cè)可能是魚(yú)類(lèi)遭受Cd2+刺激后，外圍淋巴組織中會(huì)產(chǎn)生大量免疫抑制因子，隨著脅迫程度加劇，免疫抑制因子會(huì)被逐漸釋放到血液中，影響淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的含量和活性，使得免疫應(yīng)答受到抑制。本研究結(jié)果與LI Ming,et al[19]在環(huán)境氨氮對(duì)黃顙魚(yú)免疫力影響研究中的發(fā)現(xiàn)是一致的：從0 h到7 d，暴露在氨氮環(huán)境中的黃顙魚(yú)免疫應(yīng)答并未發(fā)現(xiàn)顯著性差異，但14 d后，免疫應(yīng)答活性突然降低，他們認(rèn)為這可能是因?yàn)槊庖咭种频陌l(fā)生需要一定的時(shí)間。當(dāng)魚(yú)類(lèi)暴露到氨氮環(huán)境中，大量的免疫抑制因子在外圍淋巴組織中產(chǎn)生后被逐漸被釋放到血液中。然而，由于受到實(shí)驗(yàn)魚(yú)種類(lèi)、大小及環(huán)境脅迫因子不同等影響，要徹底闡明Cd2+脅迫對(duì)魚(yú)類(lèi)免疫應(yīng)答能力的影響機(jī)制，尚需要更多的證據(jù)。

綜上，黃顙魚(yú)幼魚(yú)遭受半致死濃度的急性Cd2+脅迫，高Cd2+組黃顙魚(yú)肝臟中硫代巴比妥酸反應(yīng)物的過(guò)度積累表明，應(yīng)激產(chǎn)生的大量自由基并不能被機(jī)體自身的抗氧化酶體系完全清除；高Cd2+濃度還會(huì)對(duì)抗氧化體系造成不同程度的抑制，而抗氧化酶體系出現(xiàn)的“飽和”現(xiàn)象很可能是動(dòng)物應(yīng)對(duì)“重金屬中毒”進(jìn)化出的一種適應(yīng)性保護(hù)機(jī)制；半致死濃度的急性Cd2+脅迫會(huì)對(duì)黃顙魚(yú)幼魚(yú)的免疫應(yīng)答體系造成抑制，免疫抑制的發(fā)生需要一個(gè)過(guò)程，與免疫抑制因子是逐漸釋放的機(jī)制有關(guān)。

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Effect of Ammonia Stress on Antioxidant Enzyme Activity and Immune Response in Juvenile Pelteobagrus fulvidraco

ZHU Xing-zun1,2,LI Ming2,YUAN Li-xia2,et al
(1.School of Life Sciences,Northeast Normal University,Changchun130024;2.College of Marine Science, Ningbo University,Ningbo315211,China)

A study was carried out to test the responses of juvenile Pelteobagrus fulvidraco to Cd2+stress. The catfish(5.94±0.05)g were randomly allocated to 2 groups(control group and exposure group)in triplicate for 96 h Cd2+exposure.In high Cd2+group,the highest significant liver SOD,GPX and GR activities were found at hour 6,but TBARS was found at hour 12.Liver LYZ,AKP and ACP activities of fish in the treatment of high Cd2+were lower than those of fish in the treatment of low Cd2+.In high Cd2+group,the highest significant liver LYZ,AKP and ACP activities were found at hours 48-96.This study indicated that Cd2+-induced ROS generation is not fully counteracted by antioxidant enzymes.High Cd2+exerts its toxic effects by interfering with antioxidant enzyme and immune response system.

Cd;antioxidant enzyme;immune response;Pelteobagrus fulvidraco

S917.4

A

1008－830X(2016)06－0478－05

2016-09-10

國(guó)家自然科學(xué)基金（31502176）

朱星樽（1990-），男，吉林通化人，碩士研究生，研究方向：生態(tài)學(xué).

王日昕.E-mail:wrx_zjou@163.com