劉玲玲，張夢曉，張　配，趙素容，劉　浩

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褪黑素聯(lián)合順鉑對人食管癌Eca109細(xì)胞的抑制作用及其機(jī)制

劉玲玲1,2，張夢曉2，張配2，趙素容2，劉浩2

[摘要]目的：觀察褪黑素(Mel)聯(lián)合順鉑(DDP)對人食管癌Eca109細(xì)胞生長的抑制作用，并探討相關(guān)的分子機(jī)制。方法：通過MTT實驗檢測Mel與DDP不同濃度分別單用或兩藥聯(lián)合處理后食管癌Eca109細(xì)胞增殖情況；流式細(xì)胞儀檢測用藥后細(xì)胞凋亡情況；Western blot法檢測Bax、Bcl-2蛋白的表達(dá)。結(jié)果：Mel與DDP聯(lián)用對食管癌Eca109細(xì)胞增殖的抑制率均高于單用Mel與DDP時對食管癌Eca109細(xì)胞的抑制率(P<0.05)；Mel單獨誘導(dǎo)食管癌Eca109細(xì)胞凋亡作用不強(qiáng)，但可增強(qiáng)DDP誘導(dǎo)的食管癌細(xì)胞凋亡(P<0.01)；Mel與DDP聯(lián)用后食管癌Eca109細(xì)胞Bcl-2蛋白表達(dá)減弱，Bax蛋白表達(dá)增強(qiáng)。結(jié)論：Mel可增強(qiáng)DDP對人食管癌Eca109細(xì)胞增殖的抑制作用，并具有增強(qiáng)DDP誘導(dǎo)人食管癌Eca109細(xì)胞凋亡的作用，其機(jī)制可能與上調(diào)Bax表達(dá)和下調(diào)Bcl-2的表達(dá)有關(guān)。

[關(guān)鍵詞]食管腫瘤；褪黑素；順鉑；Eca109細(xì)胞

全球每年新發(fā)食管癌40萬例，其中大約有30萬例來自中國[1]，可以看出我國的食管癌發(fā)病率居世界之首。目前，對食管癌的研究已經(jīng)取得一定的成果，多種化學(xué)治療藥物已在臨床廣泛使用。順鉑(DDP)是這些化療藥物中應(yīng)用最廣范、作用最強(qiáng)的藥物之一[2]，但DDP對消化系統(tǒng)、骨髓、腎臟以及內(nèi)耳的毒性損傷及癌細(xì)胞對DDP的耐藥性等問題嚴(yán)重影響著對食管癌的治療效果。褪黑素(Mel)化學(xué)名N-乙?；?5-甲氧基色胺，是松果體產(chǎn)生的一種天然的吲哚類激素，應(yīng)用于臨床腫瘤治療多年，并且被證明是安全和可以耐受的藥物[3-5]；其除了具有鎮(zhèn)靜催眠和調(diào)節(jié)睡眠覺醒周期的作用外[6]，還與腫瘤的發(fā)生發(fā)展及治療有著密切的關(guān)系[7]。已有研究[8-11]報道Mel能有效抑制多種腫瘤的增殖，與抗腫瘤藥物聯(lián)用具有增強(qiáng)療效和減輕毒性的作用。Mel抗腫瘤的作用機(jī)制和路徑復(fù)雜，至今尚未完全清楚。本研究對Mel增強(qiáng)順鉑抗食管癌活性進(jìn)行分析，觀察Mel與DDP聯(lián)用對食管癌Eca109細(xì)胞株增殖和凋亡的影響，探討Mel增效作用的靶點?，F(xiàn)作報道。

1材料與方法

1.1材料人食管癌細(xì)胞株Eca109,Mel、二甲基亞砜(DMSO)、SDS-PAGE電泳試劑(sigma公司)，DDP(齊魯制藥有限公司)，DMEM培養(yǎng)基(Gibco公司)，胎牛血清(Hyclone公司)，MTT 試劑(Amresco公司)，倒置相差顯微鏡(Olympus公司)，鼠抗人β-actin(Santa Cruz公司)，Bcl-2、Bax兔抗人多克隆抗體(Lab Vision公司)，WBKLS0500底物顯色試劑、聚偏二氯乙烯膜(Millipore公司)，Western一抗稀釋液、BCA蛋白定量試劑盒、蛋白預(yù)染MAKER(碧云天公司)。

1.2方法

1.2.1MTT法檢測人食管癌Eca109細(xì)胞增殖取處于對數(shù)生長期的Eca109細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度每毫升1×105個，然后每孔0.1 mL鋪于96孔培養(yǎng)板中，每組設(shè)5個平行孔。24 h后棄培養(yǎng)液，再依次加入梯度濃度的Mel和DDP 2.5 mg/L聯(lián)合梯度濃度的Mel。繼續(xù)孵育20 h后，加入20 μL MTT，再繼續(xù)培養(yǎng)4 h。后吸棄上清液，每孔各加入150 μL DMSO，置37 ℃恒溫箱孵育，30 min后取出，放入酶標(biāo)儀中設(shè)置振蕩10 min，490 nm波長測定吸光度值。

1.2.2流式細(xì)胞術(shù)檢測人食管癌Eca109凋亡調(diào)節(jié)處于對數(shù)生長期的Eca109細(xì)胞濃度為每毫升2×105個，6孔板每孔鋪1 mL。移入溫箱24 h后吸棄培養(yǎng)液，設(shè)空白對照孔、Mel 1×10-5mol/L孔、DDP 2.5 mg/L孔、DDP 2.5 mg/L +Mel 1×10-5mol/L孔，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，分別收集各組細(xì)胞，1 500 r/min離心8 min后棄上清液，加入75%乙醇1 mL固定，4 ℃冰箱過夜保存。次日以1 000 r/min離心10 min，棄上清液，37 ℃水浴30 min后加600 μL碘化丙啶行DNA染色，避光放置3～4 h后上樣流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞凋亡率。

1.2.3蛋白免疫印跡檢測取對數(shù)生長期的Eca109細(xì)胞，接種于6孔培養(yǎng)板，無血清培養(yǎng)基同步化24 h后，設(shè)空白對照孔、Mel 1×10-5mol/L孔、DDP 2.5 mg/L孔、DDP 2.5 mg/L+Mel 1×10-5mol/L孔，24 h后收集各組的Eca109細(xì)胞，冰PBS洗3次，加入含有蛋白酶抑制劑的細(xì)胞裂解液冰上處理20 min，離心后吸取上清液，常規(guī)提取細(xì)胞蛋白，BCA法定量蛋白后進(jìn)行10% SDS-PAGE電泳分離蛋白，并用電轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)印聚偏二氯乙烯膜。然后用含5%脫脂牛奶的緩沖液封閉，分別加兔抗人Bcl-2、Bax和β-actin單克隆抗體，4 ℃靜置孵育過夜；然后加堿性磷酸酶標(biāo)記的二抗辣根過氧化物酶-羊抗兔IgG，37 ℃搖床上孵育1 h，而后利用Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)獲取圖像。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法采用方差分析和q檢驗。

2結(jié)果

2.1Mel增強(qiáng)DDP對人食管癌Eca109細(xì)胞增殖的抑制作用Mel單獨處理細(xì)胞后，低濃度抑制作用不明顯，直至濃度提升到1×10-5mol/L方顯示出抑制作用(P<0.05)；采用不同濃度的Mel聯(lián)合半數(shù)抑制濃度的DDP后，隨著Mel濃度的逐漸提高，抑制作用明顯提高(P<0.05)(見表1)。

表1　DDP和/或Mel對食管癌Eca109細(xì)胞增殖抑制情況

q檢驗：與單用同樣濃度的Mel組比較*P<0.05；與其他單用Mel組比較△P<0.05

2.2Mel增強(qiáng)DDP誘導(dǎo)食管癌Eca109細(xì)胞凋亡的作用Mel處理后誘導(dǎo)食管癌Eca109細(xì)胞凋亡率明顯高于空白對照組(P<0.01)；2.5 mg/L DDP處理后細(xì)胞的凋亡率顯著低于Mel聯(lián)合DDP處理后的細(xì)胞凋亡率(P<0.01)(見表2)。

q檢驗：與陰性對照組比較**P<0.01；與單用DDP組比較△△P<0.01

2.3Mel誘導(dǎo)后食管癌Eca109細(xì)胞Bcl-2/Bax蛋白表達(dá)的變化檢測結(jié)果顯示，與空白對照組比較，Mel與DDP單用或聯(lián)用后食管癌細(xì)胞Eca109的Bcl-2蛋白表達(dá)減弱，條帶變淡，Bax蛋白表達(dá)增強(qiáng)，條帶加深，其中以兩藥聯(lián)用組表現(xiàn)最為明顯，可見Bcl-2蛋白表達(dá)隨藥物聯(lián)用強(qiáng)度逐漸減弱，而Bax蛋白的表達(dá)隨藥物聯(lián)用逐漸增強(qiáng)(見圖1)。

3討論

目前已知細(xì)胞凋亡存在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)信號途徑、死亡受體途徑和線粒體途徑3 種[12]。本實驗是從線粒體途徑來探討Mel對DDP增效作用的可能作用靶點。Bcl-2家族中的Bcl-2基因通過阻止細(xì)胞色素C從線粒體的釋放來抑制凋亡；而Bax基因通過與線粒體上的膜通道結(jié)合促使細(xì)胞色素C的釋放而促進(jìn)凋亡[13]。也就是說Bcl-2有抗凋亡作用，為凋亡抑制基因，Bax有促凋亡作用，為凋亡誘導(dǎo)基因[14]。Bax/Bcl-2的比值與腫瘤細(xì)胞凋亡密切相關(guān)，決定了促凋亡因子caspase-3的激活程度[15]，并且Bcl-2的表達(dá)水平常常還與腫瘤的耐藥性呈正相關(guān)[16]。曾有研究發(fā)現(xiàn)食管正常上皮無Bcl-2表達(dá)，而癌旁上皮中Bcl-2與Bax均有少量表達(dá)，Bcl-2基因表達(dá)則與腫瘤分化程度有關(guān)，腫瘤分化程度越低Bcl-2基因陽性表達(dá)率也越高[17]。

本實驗在得到Mel可以增強(qiáng)DDP對人食管癌Eca109細(xì)胞的增殖抑制和凋亡誘導(dǎo)作用的結(jié)果后，進(jìn)一步嘗試從Bax和Bcl-2的表達(dá)方面來了解這一作用背后可能存在的分子機(jī)制。

本研究將不同濃度的Mel和DDP分別單獨處理人食管癌Eca109細(xì)胞后，隨藥物濃度加大，細(xì)胞內(nèi)Bcl-2表達(dá)較空白對照組有所下降，而Bax表達(dá)較空白組有所增強(qiáng)。二藥聯(lián)用后，凋亡相關(guān)蛋白水平的改變也較單獨用藥更為明顯，可能是由于Mel對Bcl-2表達(dá)的抑制作用，增加了細(xì)胞對DDP的敏感性，且由于聯(lián)合用藥后Bax/Bcl-2的比值明顯上升，利于促凋亡因子caspase-3的激活，因此Mel對DDP的抗腫瘤活性起到增效的作用。

本研究證實Mel對DDP抗腫瘤活性有明顯增效作用，其機(jī)制可能與下調(diào)Bcl-2的表達(dá)，上調(diào)Bax表達(dá)明有關(guān)。但是這些Bcl-2家族成員的上游蛋白表達(dá)情況如何，在接下來的研究中本課題組將圍繞這一問題繼續(xù)研究。

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(本文編輯劉夢楠)

Effect of Melatonin combined with cisplatin on proliferation and apoptosis of human esophageal carcinoma 109 cells

LIU Ling-ling1,2,ZHANG Meng-xiao2,ZHANG Pei2,ZHAO Su-rong2,LIU Hao2

(1.DepartmentofPharmacy,TheSecondAffiliatedHospitalofBengbuMedicalCollege,BengbuAnhui233004; 2.FacultyofPharmacy,BengbuMedicalCollege,BengbuAnhui233030,China)

[Abstract]Objective:To explore the effects of melatonin combined with cisplatin on the proliferation and apoptosis of Eca109 cell and study the molecular mechanism.Methods:Eca109 cells were con-cultured with different concentrations of melatonin with or without cisplatin for 24 h.The inhibitory rate of Eca109 cells were examined using MTT assay,and the cell apoptosis was analyzed using flow cytometry with propidium iodide staining.Western blot for apoptosis-related protein Bcl-2 and Bax were used to analyze possible mechanisms of the synergistic anti-proliferation effect of melatonin in combination with cisplatin.Results:Different concentrations of melatonin combined with cisplatin showed an obviously enhanced inhibitory effect on colony formation of Eca109 cells.When melatonin combined with cisplatin,the cell apoptosis rate increased to 29%,significantly higher than that in cells with cisplatin treatment alone(9.7%)(P<0.01).The expression of Bcl-2 was high but Bax was low in Eca109 cells,after stimulating with melatonin and cisplatin,the expression of Bcl-2 decreased but expression of Bax increased.Conclusions:Melatonin can enhance the anti-proliferative effect of cisplatin on Eca109 cell and can enhance cisplatin-induced apoptosis.The possible mechanism may related to the downregulation of Bcl-2 and upregulation of Bax protein expression.

[Key words]esophageal neoplasms;melatonin;cisplatin;esophageal carcinoma 109 cells

[文章編號]1000-2200(2016)03-0281-03·基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)·

[收稿日期]2015-01-05

[基金項目]國家自然科學(xué)基金項目(81372899)；安徽省自然科學(xué)

[作者簡介]劉玲玲(1985-)，女，碩士，主管藥師，講師.[通信作者] 劉浩，教授，碩士生導(dǎo)師.E-mail:liuhao 6886@foxmail.com

[中圖法分類號]R 735.1

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

DOI:10.13898/j.cnki.issn.1000-2200.2016.03.001

基金項目(1508085MH166)；蚌埠醫(yī)學(xué)院校自然科學(xué)項目(Byky1384)

[作者單位] 1.蚌埠醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院 藥劑科，安徽 蚌埠 233040；2.蚌埠醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)系，安徽 蚌埠 233030