王 振，申小云，盤(pán)道興，謝海強(qiáng)，劉若余

（1.貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院/貴州大學(xué)高原山地動(dòng)物遺傳育種與繁殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng) 550025；2.貴州省扶貧辦公室外資項(xiàng)目管理中心，貴州 貴陽(yáng) 550004；3.西南科技大學(xué)生命科學(xué)院，四川 綿陽(yáng) 621010）

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威寧綿羊和貴州半細(xì)毛羊FecB基因SNP分析

王 振1，申小云2，3，盤(pán)道興1，謝海強(qiáng)1，劉若余1

（1.貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院/貴州大學(xué)高原山地動(dòng)物遺傳育種與繁殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng) 550025；2.貴州省扶貧辦公室外資項(xiàng)目管理中心，貴州 貴陽(yáng) 550004；3.西南科技大學(xué)生命科學(xué)院，四川 綿陽(yáng) 621010）

摘 要：利用威寧綿羊和貴州半細(xì)毛羊構(gòu)建DNA池，設(shè)計(jì)11對(duì)引物擴(kuò)增其FecB基因外顯子和部分內(nèi)含子的序列，對(duì)純化后的PCR產(chǎn)物雙向測(cè)序，分析確定多態(tài)性位點(diǎn)。然后利用生物信息學(xué)軟件分析SNPs位點(diǎn)對(duì)FecB基因RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)、FecB蛋白結(jié)構(gòu)的影響。結(jié)果顯示，在擴(kuò)增的FecB基因中篩選到10個(gè)SNPs，其中exon5-A39G、exon9-C37A、exon11-C87A、intron2-A62G、intron4-A1023G、intron10-G24A 突變?yōu)橥幘d羊和貴州半細(xì)毛羊中所共有，而exon9-A8G和intron1-G243A 突變?yōu)橥幘d羊所特有，intron3-G177A和exon8-T86C 突變?yōu)橘F州半細(xì)毛羊所特有。上述的SNPs中，exon5-A39G 和exon9-A8G為錯(cuò)義突變，exon5-A39G突變導(dǎo)致編碼的異亮氨酸（Ile）變?yōu)槔i氨酸（Val），exon9-A8G突變導(dǎo)致編碼的天冬酰胺（Asn）變?yōu)樘於彼幔ˋsp）； exon9-C37A和exon11-C87A多態(tài)位點(diǎn)均未改變氨基酸的編碼，為同義突變。

關(guān)鍵詞：FecB基因；威寧綿羊；貴州半細(xì)毛羊；單核苷酸多態(tài)性（SNP）

威寧綿羊主產(chǎn)于貴州省威寧縣，為粗毛羊，體質(zhì)結(jié)實(shí)，特別能適應(yīng)貴州威寧等海拔較高的山區(qū)養(yǎng)殖，但其個(gè)體較小，生長(zhǎng)速度十分緩慢，繁殖率低，產(chǎn)單羔。因此，提高威寧綿羊的繁殖率育種工作具有重要意義。

貴州半細(xì)毛羊是20世紀(jì)80年代畢節(jié)市牧科所參與培育出的第1個(gè)綿羊品種，由新疆細(xì)毛公羊與貴州本地粗毛母羊雜交組合，將雜交二代母羊考力代公羊作級(jí)進(jìn)雜交，育成考細(xì)雜羊，進(jìn)而在考細(xì)雜和部分羅細(xì)雜、羅考細(xì)雜組合的后代中選擇理想型公母羊橫交固定，最終育成達(dá)到育種目標(biāo)的貴州半細(xì)毛羊。貴州半細(xì)毛羊繁殖率低，因此有必要對(duì)貴州半細(xì)毛羊作進(jìn)一步培育，提高其繁殖率，使其成為同時(shí)符合肉用市場(chǎng)和毛用市場(chǎng)需求的毛肉兼用型貴州半細(xì)毛羊品種［1］。

FecB基因是Davis［2］在20世紀(jì)80年代從布魯拉美利奴（Booroola Merino）綿羊中發(fā)現(xiàn)的。當(dāng)時(shí)，Davis認(rèn)為該基因有可能是增加布魯拉美利奴綿羊排卵數(shù)和產(chǎn)羔數(shù)的一個(gè)染色體突變基因。在綿羊的高繁殖力的主效基因中，F(xiàn)ecB基因是第1個(gè)被識(shí)別出的。該基因在1989年被綿、山羊遺傳命名委員會(huì)正式命名為FecB基因［3］。Lord 等［4］利用微衛(wèi)星BM1329和OarAE101作標(biāo)記對(duì)FecB基因進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)FecB基因位于6號(hào)染色體的BM1329和OarAE101之間10 cM連鎖群中。

FecB 基因?qū)d羊的的生理有多方面的影響，其中最為顯著的生理作用體現(xiàn)在對(duì)卵巢排卵卵泡數(shù)量和大小的影響。有研究發(fā)現(xiàn)，不攜帶 FecB基因的野生型母羊成熟并排卵的卵泡直徑都顯著大于攜帶有FecB基因的母羊（基因純合和基因雜合）［5］，并且不攜帶FecB基因的野生型母羊小卵泡所含有的顆粒細(xì)胞比攜帶FecB基因純合的母羊多得多。Wilson等［6］發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ecB基因第7外顯子發(fā)生1處突變（A746G），突變導(dǎo)致了第249位氨基酸由谷氨酰胺（Gln）突變?yōu)榫彼幔ˋrg），造成布魯拉美利奴綿羊排卵數(shù)明顯增加。李達(dá)等［7］利用PCR－SSCP以及PCR－RFLP方法對(duì)湖羊、小尾寒羊、阿勒泰羊、洼地綿羊的FecB基因進(jìn)行SNP分析，研究結(jié)果顯示，上述4個(gè)綿羊品種均攜帶FecB突變，且能證明FecB 基因?yàn)橥莸鼐d羊高繁殖力的主效基因。

本試驗(yàn)構(gòu)建威寧綿羊、貴州半細(xì)毛羊進(jìn)行DNA池［8］，對(duì)FecB基因的SNP多態(tài)性位點(diǎn)進(jìn)行篩選，并作生物信息學(xué)分析，估算基因頻率，探究SNP位點(diǎn)對(duì)RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的影響，為研究該基因?qū)d羊生產(chǎn)性能的影響奠定基礎(chǔ)，同時(shí)還為威寧綿羊和貴州半細(xì)毛羊的選種選育工作提供依據(jù)。

1　材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

威寧綿羊血樣61個(gè)由威寧縣畜禽品種改良站提供；貴州半細(xì)毛羊血樣60個(gè)采自貴州省畢節(jié)市威寧縣威寧種羊場(chǎng)。Ezup柱式基因組DNA抽提試劑盒（血液）購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 DNA提取與DNA池構(gòu)建 本試驗(yàn)采用血液Ezup柱式基因組DNA抽提試劑盒提取威寧綿羊和貴州半細(xì)毛羊血樣的DNA，綿羊血樣DNA基因組的提取效果通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢驗(yàn)，DNA濃度則利用紫外分光光度計(jì)進(jìn)行檢測(cè)，并將DNA基因組的濃度分別調(diào)整到100 ng/μL。然后分別將威寧綿羊和貴州半細(xì)毛羊的DNA樣品每個(gè)各取5μL混合，構(gòu)建兩個(gè)DNA池。

1.2.2 引物設(shè)計(jì)和DNA擴(kuò)增 通過(guò)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)查找綿羊FecB基因的DNA序列（GenBank登錄號(hào)：NC_019463.1），再利用NCBI的在線軟件Primer-BLAST設(shè)計(jì)11對(duì)特異性引物。各對(duì)特異性引物對(duì)應(yīng)的最適退火溫度見(jiàn)表1。PCR擴(kuò)增采用鼎國(guó)生物公司生產(chǎn)的Mix，反應(yīng)體系總體積為30μL，將擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物利用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，再運(yùn)用凝膠成像儀對(duì)試驗(yàn)的凝膠電泳結(jié)果進(jìn)行拍照，并觀察各對(duì)特異性引物PCR擴(kuò)增的效果。

表1　引物序列、退火溫度及目的片段長(zhǎng)度

1.2.3 序列分析 PCR產(chǎn)物純化后由北京諾薩基因公司對(duì)其進(jìn)行雙向測(cè)序，運(yùn)用DNAstar軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行校正對(duì)比，再通過(guò)BLAST軟件分析確定單核苷酸多態(tài)性。

1.2.4 測(cè)序圖峰高測(cè)量及等位基因頻率估算 試驗(yàn)所測(cè)得結(jié)果圖峰采用MWSnap軟件測(cè)量等位基因?qū)?yīng)的峰高，再根據(jù)公式Ai=Bi/（B1+B2），估算等位基因頻率［9］。式中i=1，2，Ai表示SNP位點(diǎn)等位基因頻率，B1和B2分別表示測(cè)序結(jié)果上該SNP等位基因1、2相對(duì)應(yīng)的峰高。

1.2.5 FecB的RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)及蛋白結(jié)構(gòu)分析 利用http：//rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAfold.cgi在線軟對(duì)RNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)；通過(guò)https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_sopma.htm l在線軟件對(duì)蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)；通過(guò)http：//www.sbg.bio.ic.ac.uk/ phyre2/htm l/page.cgi？id=index在線軟件對(duì)蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)。

2　結(jié)果與分析

2.1 DNA池的PCR產(chǎn)物測(cè)序

圖1　PCR擴(kuò)增電泳結(jié)果

運(yùn)用PCR技術(shù)擴(kuò)增出威寧綿羊和貴州半細(xì)毛羊的FecB基因的部分序列（圖1）。將擴(kuò)增產(chǎn)物常規(guī)純化，然后進(jìn)行雙向測(cè)序。利用BLAST軟件分析測(cè)序結(jié)果，共發(fā)現(xiàn)10個(gè)SNPs（圖2），以各個(gè)外顯子第1位堿基數(shù)分別為1，SNPs分別為：exon5-A39G、exon9-C37A、exon11-C87A、intron2-A62G、intron4-A1023G、intron10-G24A 、exon9-A8G、intron1-G243A、intron3-G177A和exon8-T86C。上述的SNPs中exon5-A39G 和exon9-A8G為錯(cuò)義突變，exon5-A39G突變導(dǎo)致編碼的異亮氨酸（Ile）變?yōu)槔i氨酸（Val），exon9-A8G突變導(dǎo)致編碼的天冬酰胺（Asn）變?yōu)樘於彼幔ˋsp）；exon9-C37A和exon11-C87A多態(tài)位點(diǎn)均未改變氨基酸的編碼，為同義突變；intron2-A62G、intron4-A1023G、intron10-G24A、intron1-G243A和intron3-G177A均在內(nèi)含子區(qū)，不參與氨基酸編碼。

2.2 SNPs等位基因頻率估算

運(yùn)用MWSnap軟件測(cè)量威寧綿羊和貴州半細(xì)毛羊等位基因峰的高度，估算等位基因的頻率。從表2可以看出，除exon11-C87A位點(diǎn)兩種綿羊差異較小外，不同綿羊品種同一突變位點(diǎn)和不同突變位點(diǎn)突變頻率相差較大。

2.3 FecB的RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)分析

預(yù)測(cè)各SNP突變位點(diǎn)突變前和突變后FecB基因的RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)，通過(guò)預(yù)測(cè)結(jié)果可以看出，突變引起RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的自由能發(fā)生變化，突變前最小自由能為-2564.92 kJ/mol，突變后exon5-A39G、exon8-T86C、exon9-A8G、exon9-C37A、exon11-C87A最小自由能分別為-2630.02、-2169.11、-2593.91、-2502.16、-2505.67 kJ/mol。 RNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)及最小自由能的變化可能會(huì)使其穩(wěn)定性受到影響，進(jìn)一步影響蛋白質(zhì)的翻譯過(guò)程。

2.4 FecB蛋白二級(jí)分析

通過(guò)在線軟件分析預(yù)測(cè)威寧綿羊和貴州半細(xì)毛羊FecB蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)突變前后的變化。結(jié)果表明，exon5-A39G在突變前后β轉(zhuǎn)角、α螺旋、自由卷曲和延伸鏈均沒(méi)有發(fā)生變化，而exon9-A8G在突變前后α螺旋、β轉(zhuǎn)角和延伸鏈發(fā)生了變化，自由卷曲則沒(méi)有發(fā)生變化（表3）。

2.5 突變前后FecB蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)分析

預(yù)測(cè)突變前后蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)分析蛋白質(zhì)的功能具有重要的意義，利用蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)的在線預(yù)測(cè)軟件對(duì)FecB蛋白突變前后的三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，結(jié)果（圖3）表明突變后多態(tài)位點(diǎn)導(dǎo)致FecB蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)有所改變。

圖2　PCR產(chǎn)物測(cè)序及BLAST分析結(jié)果

圖3　FecB蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)變化

表2　等位基因頻率估算結(jié)果

表3　FecB蛋白質(zhì)突變前后二級(jí)結(jié)構(gòu)分析結(jié)果

3　討論

FecB基因的生物學(xué)功能十分重要，對(duì)綿羊的顯著生理作用體現(xiàn)在對(duì)卵巢排卵卵泡數(shù)量和大小的影響，此外，F(xiàn)ecB基因還促進(jìn)綿羊排卵和發(fā)情。FecB基因?qū)?dòng)物的生長(zhǎng)性能具有非常大的影響。因此，對(duì)FecB基因的深入研究有助于改善威寧綿羊和貴州半細(xì)毛羊繁殖率低，個(gè)體間差異較大的現(xiàn)狀，同時(shí)對(duì)加快威寧綿羊和貴州半細(xì)毛羊的遺傳育種工作和提高相關(guān)產(chǎn)業(yè)的生產(chǎn)效益具有重大科學(xué)和社會(huì)經(jīng)濟(jì)價(jià)值意義。

本研究在威寧綿羊和貴州半細(xì)毛羊的FecB基因中檢測(cè)得到10個(gè)SNPs位點(diǎn)，其中exon5-A39G、exon9-C37A、exon11-C87A、intron2-A62G、intron4-A1023G、intron10-G24A 的突變?yōu)橥幘d羊和貴州半細(xì)毛羊中所共有，而exon9-A8G和intron1-G243A 的突變?yōu)橥幘d羊所特有，intron3-G177A和exon8-T86C 的突變?yōu)橘F州半細(xì)毛羊所特有。而exon5-A39G 和exon9-A8G為錯(cuò)義突變，exon5-A39G突變導(dǎo)致編碼的異亮氨酸（Ile）變?yōu)槔i氨酸（Val），exon9-A8G突變導(dǎo)致編碼的天冬酰胺（Asn）變?yōu)樘於彼幔ˋsp）； exon9-C37A和exon11-C87A多態(tài)位點(diǎn)均未改變氨基酸的編碼，為同義突變。另外，在擴(kuò)增的威寧綿羊和貴州半細(xì)毛羊FecB基因序列中，并未發(fā)現(xiàn)A746G突變。比較10個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)等位基因頻率，發(fā)現(xiàn)除exon11-C87A位點(diǎn)兩種綿羊差異較小之外，不同綿羊品種同一突變位點(diǎn)和不同突變位點(diǎn)突變頻率相差較大。exon5-A39G和exon9-A8G發(fā)生錯(cuò)義突變導(dǎo)致RNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)和自由能發(fā)生改變，最終可能會(huì)導(dǎo)致編碼蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，這一變化最終是否對(duì)蛋白質(zhì)的功能產(chǎn)生影響進(jìn)而影響個(gè)體的生產(chǎn)性能還有待進(jìn)一步驗(yàn)證。此多態(tài)位點(diǎn)對(duì)研究FecB基因?qū)d羊繁殖率的影響具有重要科學(xué)意義，為后續(xù)科學(xué)研究和生產(chǎn)實(shí)踐奠定了一定的理論基礎(chǔ)。

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（責(zé)任編輯崔建勛）

SNP analysis of FecB in Guizhou sem i-fine wool sheep and Weining sheep

WANG Zhen1，SHEN Xiao-yun2，3，PAN Dao-xing1，XIE Hai-qiang1，LIU Ruo-yu1

（1.College of Animal Sciences，Guizhou University/ Key Laboratory of Animal Genetics，Breeding and Reproduction in the Plateau Mountainous Region，Ministry of Education，Guiyang 550025，China；2.Foreign Project Management Center of Guizhou Provincial Poverty Alleviation Office，Guiyang 550004，China；3.College of Life Science，Southwest University of Science and Technology，Mianyang 621010，China）

Key words：FecB gene；Weining sheep；Guizhou semi-fine wool sheep；single nucleotide polymorphism（SNP）

Abstract：The DNA pond was constructed by using Weining sheep and Guizhou sem i-fine wool sheep.11 pairs of primers were designed to amplify exons and part of intron sequences of FecB gene，then the purified PC R products were bi-directional sequenced to analyze polymorphic sites.Bioinformatic software was used to analyze the influences of SNPs sites on RNA secondary structure and protein structure.The results showed that 10 SNPs were screened，of which exon5-A39G，exon9-C37A，exon11-C87A，intron2-A62G，intron4-A1023G，intron10-G24A mutations were located in both Weining sheep and Guizhou semi-fine wool sheep，however，exon9-A8G and intron1-G243A mutations were peculiar to Weining sheep，and exon8-T86C and intron3-G177A mutations were peculiar to Guizhou semi-fine wool sheep.Exon5-A39G and exon9-A8G were missense mutations in the above SNPs.The exon5-A39G mutation led to encoding isoleucine （Ile） into valine （Val） and the exon9 - A8G mutation led to encoding asparagine （Asn） into aspartic acid （Asp）.The exon9-C37A and exon11-C87A polymorphisms which were synonymous mutations did not change amino acid encoding.

中圖分類(lèi)號(hào)：S813.3；Q346+.5

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1004-874X（2016）01-0130-06

收稿日期：2015-08-27

基金項(xiàng)目：貴州省優(yōu)秀教育人才省長(zhǎng)專(zhuān)項(xiàng)（黔省專(zhuān)合字［2009］129）；國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（CARS-40-30）

作者簡(jiǎn)介：王振（1991-），男，在讀碩士生，E-mail：614430446@qq.com

通訊作者：劉若余（1963-），男，博士，教授，E-mail：liury04@163.com