施曉鋆， 陳士嶺， 鄭海燕， 王樂(lè)樂(lè)， 吳雅琴

(1.貴陽(yáng)市第二人民醫(yī)院 婦產(chǎn)科， 貴州 貴陽(yáng)　550081； 2.南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院 婦產(chǎn)科生殖中心， 廣東 廣州　510515)

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冷凍胚胎印記基因H19的DNA甲基化狀態(tài)研究*

施曉鋆1， 陳士嶺2， 鄭海燕2， 王樂(lè)樂(lè)2， 吳雅琴2

(1.貴陽(yáng)市第二人民醫(yī)院 婦產(chǎn)科， 貴州 貴陽(yáng)550081； 2.南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院 婦產(chǎn)科生殖中心， 廣東 廣州510515)

[摘要]目的： 比較研究常規(guī)慢速冷凍和玻璃化冷凍后的人類(lèi)早期胚胎印記基因H19的DNA甲基化狀態(tài)，初步了解低溫冷凍對(duì)胚胎基因印記的影響。方法： 收集胚胎移植術(shù)后正常受精的低質(zhì)量的第3天胚胎152個(gè)，進(jìn)行冷凍、復(fù)蘇，其中常規(guī)慢速冷凍胚胎78個(gè)，玻璃化冷凍胚胎74個(gè)，另收集70個(gè)新鮮未冷凍胚胎作為對(duì)照；記錄3種類(lèi)型單個(gè)胚胎Bisulfite-PCR擴(kuò)增個(gè)數(shù)，采用結(jié)合重亞硫酸鹽限制性酶分析法檢測(cè)胚胎印記基因H19的DNA甲基化狀態(tài)。結(jié)果： 慢速冷凍胚胎、玻璃化冷凍胚胎及新鮮未冷凍胚胎的單個(gè)胚胎Bisulfite-PCR擴(kuò)增分別成功40、53、58個(gè)；慢速冷凍胚胎、玻璃化冷凍胚胎及新鮮未冷凍胚胎H19基因的平均甲基化程度分別為(44.8±6.4)%、(47.5±5.6)%及(46.7±6.0)%，異常甲基化率分別為10.0%(4/40)、13.2%(7/53)及3.4%(2/58)；3組胚胎的甲基化程度和異常甲基化率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論： 低溫冷凍不增加人類(lèi)胚胎甲基化異常的發(fā)生率。

[關(guān)鍵詞]胚胎研究； 胚胎移植； 甲基化； 生殖技術(shù),輔助； 印記基因，H19； 慢速冷凍； 玻璃化冷凍

輔助生殖技術(shù)(ART)不同于自然妊娠的過(guò)程，較多的學(xué)者關(guān)注ART出生后代的甲基化等表觀遺傳學(xué)風(fēng)險(xiǎn)。有研究認(rèn)為卵細(xì)胞、早期胚胎是DNA甲基化易于變化的敏感時(shí)期，藥物促排卵、體外培養(yǎng)等技術(shù)環(huán)節(jié)可能影響甲基化的擦除、重建和維持，從而誘發(fā)配子、胚胎出現(xiàn)印記基因甲基化異常[1]。國(guó)外的一些流行病學(xué)研究也報(bào)道ART子代可能有較高的基因印記疾病發(fā)病率，例如Beckwith-Wiedemann綜合征(BWS)和Angelman綜合征(AS)[2]。BWS、AS的發(fā)病涉及染色體11p15區(qū)域的一系列印記基因，其中H19基因研究得較為成熟[3-4]。胚胎冷凍是輔助生殖臨床常規(guī)開(kāi)展的技術(shù)，主要包括慢速冷凍和玻璃化冷凍(vitrification)2種方法。低溫、冷凍保護(hù)劑毒性等因素一直受到各種研究的關(guān)注，而有關(guān)冷凍技術(shù)對(duì)胚胎基因印記影響的研究較少，且局限在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。研究冷凍技術(shù)對(duì)人類(lèi)胚胎基因印記的影響有助于評(píng)價(jià)ART技術(shù)的安全性。本研究收集人類(lèi)第3天(Day3)冷凍胚胎和新鮮未冷凍胚胎，檢測(cè)并比較印記基因H19的DNA甲基化狀態(tài)，初步探討冷凍技術(shù)對(duì)胚胎基因印記的影響。

1材料與方法

1.1研究對(duì)象

本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。選擇常規(guī)體外受精(IVF)或者卵胞漿內(nèi)單精子顯微注射(ICSI)治療的患者，經(jīng)知情同意后收集患者選擇丟棄的低質(zhì)量Day3胚胎。冷凍復(fù)蘇胚胎為胚胎移植術(shù)后收集正常受精(2PN)的低質(zhì)量的Day3胚胎進(jìn)行常規(guī)慢速冷凍或玻璃化冷凍保存，其中慢速冷凍胚胎78個(gè)，玻璃化冷凍胚胎74個(gè)，分別解凍后用于印記基因甲基化分析。收集胚胎移植術(shù)后70個(gè)正常受精(2PN)的低質(zhì)量Day3的新鮮未冷凍胚胎作為對(duì)照。

1.2方法

1.2.1胚胎的冷凍和復(fù)蘇胚胎的慢速冷凍復(fù)蘇采用試劑盒Quinns Advantage Embryo Freeze Kit 和Quinns Advantage Thaw Kit (Sage, Pasadena, CA, USA)，按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。玻璃化冷凍復(fù)蘇以冷凍環(huán)為胚胎載體，冷凍保護(hù)劑使用丙二醇和乙二醇，按照文獻(xiàn)[5]方案步驟進(jìn)行操作。

1.2.2H19甲基化狀態(tài)檢測(cè)采用結(jié)合重亞硫酸鹽的限制性酶分析(combined bisulfite restriction analysis, COBRA)法對(duì)單個(gè)胚胎進(jìn)行DNA甲基化分析[6]：(1)使用低熔點(diǎn)瓊脂糖(LMP)，配合CpGenome DNA Modification Kit (Chemicon International, Temecula, CA)對(duì)胚胎細(xì)胞DNA進(jìn)行Bisulfite轉(zhuǎn)化；(2)以轉(zhuǎn)化的DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增(H19基因 Genbank號(hào)為AF125183, 起止位置為7870～8100)，上游引物F1為5′- AGGTGTTTTAGTTTTATGGATGATGG -3′，上游引物F2為5′-TGTATAGTATATATATGGGTATTTTTGGAGGTTT -3′，下游引物R為5′-TCCTATAAATATCCTATTCCCAAATAACC-3′；(3)PCR產(chǎn)物為230 bp片段(代表母系非甲基化等位基因)或130 bp和100 bp片段(代表父系甲基化等位基因)，甲基化程度為130 bp和100 bp條帶灰度的百分比。正常胚胎應(yīng)同時(shí)具有母系和父系H19等位基因，甲基化程度約為50%。采用TaqI酶切后，以4%瓊脂糖凝膠電泳分離(電壓為110 V，時(shí)間30 min)，電泳結(jié)束后采用GAS76WL-T20凝膠成像系統(tǒng)拍照。甲基化狀態(tài)分析采用Labworks image acquisition and analysis software (Ultra-violet Products, Ltd., Cambridge, UK) 對(duì)凝膠圖片進(jìn)行灰度掃描計(jì)算。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2結(jié)果

2.1單個(gè)胚胎Bisulfite-PCR擴(kuò)增結(jié)果

3種類(lèi)型的胚胎PCR成功率顯著不同(χ2=17.58，P=0.000)。慢速冷凍胚胎的PCR成功率低于新鮮胚胎(χ2=16.44，P=0.000)和玻璃化冷凍胚胎(χ2=6.61，P=0.01)； 玻璃化冷凍胚胎與新鮮胚胎的PCR成功率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=2.57，P=0.10)。見(jiàn)表1、圖1。

2.2H19 基因DNA甲基化程度與甲基化率

慢速冷凍胚胎、玻璃化冷凍胚胎及新鮮未冷凍胚胎H19基因的平均甲基化程度比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.127)，見(jiàn)表2。慢速冷凍胚胎、玻璃化冷凍胚胎及新鮮未冷凍胚胎H19基因的異常甲基化發(fā)生率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=3.48，P=0.175)，見(jiàn)表3。

表1　3種類(lèi)型的單胚胎bisulfite-PCR的擴(kuò)增結(jié)果

注： Slow-freezing embryos所示為慢速冷凍胚胎檢測(cè)結(jié)果，15、16、39及42號(hào)胚胎僅出現(xiàn)230 bp，為母系非甲基化片段，屬異常低甲基化狀態(tài)(甲基化程度為0%)，其余胚胎為正常甲基化狀態(tài)；Vitrified embryos所示為玻璃化冷凍胚胎檢測(cè)結(jié)果，7號(hào)胚胎的甲基化程度為8.7%(甲基化片段明顯弱)，為異常低甲基化；14、28、35及37號(hào)胚胎僅出現(xiàn)230bp的非甲基化片段，為異常低甲基化狀態(tài)(甲基化程度為0%)。圖1　慢速冷凍及玻璃化冷凍胚胎H19甲基化結(jié)果(COBRA)Fig.1　The COBRA results for frozen embryos in slow-freezing and vitrification freezing

胚胎類(lèi)型nH19甲基化程度(%)慢速冷凍3644.8±6.4玻璃化冷凍4547.5±5.6新鮮未冷凍5646.7±6.0

表3　3種類(lèi)型胚胎H19基因的異常甲基化率

3討論

低溫冷凍對(duì)早期胚胎的影響一直存在爭(zhēng)議，冷凍后胚胎的基因表達(dá)、細(xì)胞凋亡等方面已有較多研究。早期胚胎植入前容易發(fā)生甲基化的改變，H19基因?qū)儆诟赶导谆∮浕?，全長(zhǎng)3 kb，共含有5個(gè)外顯子，4個(gè)內(nèi)含子。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)玻璃化冷凍后的小鼠胚胎出現(xiàn)H19基因甲基化狀態(tài)異常和表達(dá)量的顯著增加，提示冷凍技術(shù)可能影響DNA甲基化狀態(tài)[7]。

本研究中僅有51.3%的慢速冷凍胚胎能成功的通過(guò)bisulfite-PCR擴(kuò)增分析，其原因可能是慢速冷凍產(chǎn)生的冰晶對(duì)細(xì)胞造成了機(jī)械性損害。玻璃化冷凍由于不產(chǎn)生冰晶，對(duì)細(xì)胞的機(jī)械性破壞小，因而PCR成功率與新鮮胚胎無(wú)顯著差別。由于溫度、pH值以及培養(yǎng)液營(yíng)養(yǎng)成分等因素，體外培養(yǎng)的早期胚胎存在一定比例的甲基化異常[8]。本研究亦發(fā)現(xiàn)3.4%的新鮮胚胎出現(xiàn)H19甲基化異常；慢速冷凍、玻璃化冷凍胚胎H19基因甲基化異常率分別為10.0%、13.2%，與新鮮胚胎比較無(wú)顯著差別(P=0.175)；定量分析提示3組胚胎的H19基因甲基化程度亦無(wú)顯著差別(P=0.127)。

DNA甲基化的建立和維持是依賴(lài)DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶類(lèi)(DNA methyltransferases, Dnmts)和甲基化結(jié)合蛋白(methyl-binding domain proteins)[8-10]。推測(cè)體外培養(yǎng)環(huán)境、冰晶、高濃度保護(hù)劑等因素可能影響了Dnmts的活性，從而導(dǎo)致胚胎出現(xiàn)甲基化異常。冷凍胚胎與新鮮胚胎比較，甲基化異常率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差別，初步認(rèn)為冷凍操作可能不增加胚胎甲基化異常的發(fā)生率，但冷凍胚胎的甲基化異常率有增高的趨勢(shì)，需要擴(kuò)大樣本量，擴(kuò)展基因種類(lèi)進(jìn)一步研究。

本研究檢測(cè)的胚胎為不適合移植的低質(zhì)量胚胎。低質(zhì)量的胚胎一般作放棄處理，但在臨床實(shí)踐中，缺乏優(yōu)質(zhì)胚胎的情況下，部分患者仍會(huì)選擇質(zhì)量差的胚胎進(jìn)行移植。低質(zhì)量胚胎獲得妊娠的機(jī)率較低，且出生子代的健康狀況尚未見(jiàn)系統(tǒng)的研究報(bào)道，根據(jù)本研究的結(jié)果可初步推測(cè)，使用低質(zhì)量胚胎可能會(huì)增加子代印記缺陷的風(fēng)險(xiǎn)。

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(2015-12-15收稿，2016-04-23修回)

中文編輯： 吳昌學(xué)； 英文編輯： 劉華

Research of DNA Methylation Status of Frozen Embryonic ImprintingH19 Gene

SHI Xiaoyun1, CHEN Shiling2, ZHENG Haiyan2, WANG Lele2, WU Yaqin2

(1.DepartmentofGynaecologyandObstetrics,theSecondPeople'sHospitalofGuiyang,Guiyang550081,Guizhou,r">China; 2.Reproductivecenter,DepartmentofGynaecologyandObstetrics,NanfangHospitalofSouthernmedicalUniversity,Guangzhou510515,Guangdong,China)

[Abstract]Objective: To investigate the DNA methylation status of human early embryonic imprinting H19 gene after slow-freezing or vitrification freezing, and preliminarily explore the effect of low temperature freezing on embryonic imprinting gene. Methods: 152 Day3-embryos (2PN, bad quality) with normal fertilization after embryo transplantation were collected and underwent freezing and resuscitation, of which 78 embryos were conducted by slow-freezing, 74 embryos by vitrification freezing. Besides, 70 fresh non-frozen embryos were collected as controls. The number of Bisulfite-PCR amplification of a single embryo was recorded in the three types. The Combined Bisulfite Restriction Analysis (COBRA) was used to determine H19 methylation status after embryos thawing. Results: The number of Bisulfite-PCR amplification of a single embryo in the three groups was 40 (slow-freezing), 53 (vitrification freezing) and 58 (fresh non-frozen), respectively. The average degree of H19 methylation in the three groups was (44.8±6.4)% (slow-freezing), (47.5±5.6)% (vitrification freezing) and 46.7%±6.0% (fresh non-frozen), respectively. The rate of abnormal methylation was 10.0% (slow-freezing), 13.2% (vitrification freezing) and 3.4% (fresh non-frozen), respectively. There was no statistical difference of H19 methylation degree and rate of abnormal methylation between three groups. Conclusion: The freezing technique may not increase the incidence of abnormal methylation in human embryos.

[Key words]embryo research； embryo transplantation; methylation; reproductive technology,auxiliary; imprinted genes,H19; slow-freezing; vitrification freezing

*[基金項(xiàng)目]國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81460237)

[中圖分類(lèi)號(hào)]R714.8

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

[文章編號(hào)]1000-2707(2016)05-0524-03

DOI:10.19367/j.cnki.1000-2707.2016.05.007

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2016-05-13網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20160513.2129.048.html