劉丹薇， 潘　衛(wèi)， 徐國(guó)賓， 楊國(guó)珍**

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院 生化學(xué)教研室， 貴州 貴陽(yáng)　550004； 2.北京大學(xué)腫瘤醫(yī)院 檢驗(yàn)科， 北京　100142)

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·基礎(chǔ)研究·

1-磷酸鞘氨醇對(duì)雄性小鼠生殖毒性損害的拮抗作用*

劉丹薇1， 潘衛(wèi)1， 徐國(guó)賓2， 楊國(guó)珍1**

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院 生化學(xué)教研室， 貴州 貴陽(yáng)550004； 2.北京大學(xué)腫瘤醫(yī)院 檢驗(yàn)科， 北京100142)

[摘要]目的： 探討1-磷酸鞘氨醇(S1P)對(duì)雄性小鼠生殖細(xì)胞毒性損害的拮抗作用。方法: 健康雄性昆明小鼠40只，隨機(jī)分為正常對(duì)照組、S1P低劑量(0.05 μg/g)、S1P中劑量(0.1 μg/g)、S1P高劑量(0.2 μg/g)組以及環(huán)磷酰胺染毒組；正常對(duì)照組予生理鹽水，后4組予環(huán)磷酰胺，腹腔注射給藥5 d；S1P低、中、高劑量組后再予相應(yīng)劑量S1P腹腔注射，給藥結(jié)束后第30天處死小鼠，分別采集血清、附睪及睪丸樣本，檢測(cè)小鼠睪丸精子計(jì)數(shù)和精子畸形率，比色法測(cè)定LDH活力，彗星實(shí)驗(yàn)檢測(cè)精子DNA損傷。 結(jié)果: 與環(huán)磷酰胺染毒組相比，各S1P劑量組精子計(jì)數(shù)升高，畸形率降低，LDH活力升高，DNA損傷減低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0．05)。結(jié)論: S1P對(duì)雄性小鼠生殖細(xì)胞毒性損害具有一定的拮抗作用，能提高精液質(zhì)量與能量代謝酶LDH的活性，一定程度上抵御細(xì)胞DNA損傷。

[關(guān)鍵詞]小鼠； 生殖細(xì)胞； 藥物拮抗作用； 1-磷酸鞘氨醇

近年來(lái)，我國(guó)不孕不育家庭逐漸增多，不孕不育現(xiàn)狀不禁令人堪憂，男性原因發(fā)生的不育癥占比已經(jīng)超過(guò)了一半。2015年的調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，男性與女性不孕不育的發(fā)病率為3∶2。過(guò)去25年間國(guó)內(nèi)育齡男性精液質(zhì)量分析報(bào)告顯示，精子數(shù)量和精子活力均呈下降趨勢(shì)。目前，不孕不育問(wèn)題已成為一個(gè)重要的醫(yī)學(xué)和社會(huì)問(wèn)題。由于不孕不育癥狀發(fā)現(xiàn)時(shí)，生殖細(xì)胞勢(shì)必已經(jīng)發(fā)生了損傷，故如何修復(fù)和改善這些損傷成為了關(guān)鍵。近年來(lái)，許多研究發(fā)現(xiàn)，1-磷酸鞘氨醇(sphingosine-1-phosphate，S1P)可以抑制包括輻射和化學(xué)藥物等許多應(yīng)激因子所致的成體細(xì)胞、生殖細(xì)胞、胚胎的細(xì)胞凋亡[1-4]。此外，外源性S1P可減少早期胚胎細(xì)胞凋亡，從而改善胚胎發(fā)育潛能[5]。因此，SIP在提高人類輔助生殖技術(shù)臨床結(jié)局方面有潛在的應(yīng)用價(jià)值。本次研究使用的染毒組藥物是環(huán)磷酰胺，它是目前常用的一種烷化劑類抗腫瘤藥物。已經(jīng)有報(bào)道證實(shí)，環(huán)磷酰胺可對(duì)雄性生殖系統(tǒng)造成毒性損害[6]。因此，本研究利用S1P對(duì)環(huán)磷酰胺導(dǎo)致的生殖毒性進(jìn)行干預(yù)，通過(guò)對(duì)精液質(zhì)量的相關(guān)指標(biāo)以及精子DNA損傷情況的檢測(cè)，揭示S1P對(duì)雄性生殖細(xì)胞毒性損害的拮抗作用，從而為生殖毒性損害的防治提供依據(jù)。

1材料和方法

1．1材料

1．1．1主要試劑與儀器環(huán)磷酰胺(江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司)，S1P(美國(guó)Sigma公司)，乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒(R&D公司)，正常、低熔點(diǎn)瓊脂糖(AMRESCO進(jìn)口分裝)，二甲基亞砜(DMSO)，曲拉通X-100(Triton-X-100，AMRESCO進(jìn)口分裝)，三羥甲基氨基甲烷(Tris)，N-十二烷基肌氨酸鈉(SKL，AMRESCO進(jìn)口分裝)，溴化乙錠(EB，AMRESCO進(jìn)口分裝)，電子精密天平(JJ500，常熟雙杰測(cè)試儀器)，光學(xué)顯微鏡(NIKON YS100，日本尼康公司)，正置熒光顯微鏡(Axio Imager A2，德國(guó)ZEISS公司)。

1．1．2動(dòng)物選擇健康成熟昆明種屬雄性小鼠40只，體重25～30 g，購(gòu)自貴州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，動(dòng)物許可證號(hào)SYXK(黔)2012-0001。

1．2實(shí)驗(yàn)方法

1．2．1動(dòng)物分組與處理將雄性小鼠隨機(jī)分為5組，每組8只，分別為正常對(duì)照組、S1P低、中、高劑量組、環(huán)磷酰胺染毒組。正常對(duì)照組按0.01 mL/10 g體重給予生理鹽水；后4組給予環(huán)磷酰胺40 mg/kg，連續(xù)給藥5 d，染毒期間小鼠自由飲食飲水。S1P低、中、高劑量組在給予環(huán)磷酰胺后，間隔2 h再分別根據(jù)小鼠體重，按0.05、0.1、0.2 μg/g劑量給予S1P腹腔注射。

1．2．2取材及標(biāo)本制作 各組于給藥結(jié)束后第30天，采用摘眼球法收集小鼠血液，離心取血清，待測(cè)LDH；頸椎脫臼后立即打開(kāi)腹腔，取出雙側(cè)附睪、睪丸，附睪研磨后收集精子懸液，測(cè)定精子計(jì)數(shù)、精子活動(dòng)率、精子畸形率以及DNA損傷。

1．2．3小鼠精子計(jì)數(shù)、精子活動(dòng)率、精子畸形率精子活動(dòng)率：完整分離小鼠附睪，將一側(cè)附睪放入盛有1 mL 37 ℃預(yù)溫的生理鹽水的EP管中剪碎，用吸管輕輕吹打混勻數(shù)次，于37 ℃水浴箱中靜置10 min，待精子自由流出；在室溫條件下，取精子懸液于血細(xì)胞計(jì)數(shù)板上鏡檢，連續(xù)計(jì)數(shù)200個(gè)精子中活動(dòng)精子數(shù)，計(jì)算活精子百分率=(活精子數(shù)/200)×100%。小鼠精子計(jì)數(shù)：將精子懸液置于60 ℃水浴箱中孵育10 min殺死精子，取精子懸液于血細(xì)胞計(jì)數(shù)板的計(jì)數(shù)池內(nèi)，按紅細(xì)胞計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)中央大方格內(nèi)5個(gè)中方格中精子數(shù)，計(jì)算精子總數(shù)/mL=5個(gè)中方格精子總數(shù)×5×10×103。小鼠精子畸形率檢查:取1滴精子濾液推片，室溫自然干燥，甲醇固定、干燥，然后用2%伊紅染色1～2 h，流水沖洗、晾干，高倍顯微鏡檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)1 000條精子中的畸形精子數(shù)，精子畸形率(%)=畸形精子數(shù)/1 000×100%。

1．2．4小鼠血清以及睪丸勻漿LDH活性測(cè)定用ELISA法檢測(cè)，具體操作按LDH檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

1．2．5精子DNA損傷測(cè)定彗星實(shí)驗(yàn)檢測(cè)精子DNA損傷。利用小鼠精子懸液根據(jù)Singh彗星實(shí)驗(yàn)基本步驟[7]，參考羅明志[8]等人對(duì)于彗星實(shí)驗(yàn)的改良進(jìn)行操作，熒光顯微鏡下觀察精子拖尾情況并采圖，在200倍物鏡隨機(jī)取10個(gè)視野拍照，圖像輸入Cometscore彗星實(shí)驗(yàn)圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行分析，得到尾矩(TM)以及Olive尾距(OTM)。

1．3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2結(jié)果

2.1小鼠精子數(shù)量、活動(dòng)率和精子畸形率

與正常對(duì)照組相比，S1P低、中、高劑量組、環(huán)磷酰胺染毒組精子數(shù)量及精子活動(dòng)率降低，精子畸形率增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與環(huán)磷酰胺染毒組相比，S1P低、中、高劑量組、正常對(duì)照組精子數(shù)量及精子活動(dòng)率升高，精子畸形率降低差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1　各組小鼠精子數(shù)量、精子活動(dòng)率及畸形率±s)

與環(huán)磷酰胺染毒組比較，(1)P<0．05，(2)P<0．01；(3)與正常對(duì)照組比較，P<0．01

2.2LDH活性

隨著S1P劑量的增加，小鼠血清和睪丸LDH的活性均逐漸升高。環(huán)磷酰胺與染毒組相比，S1P中、高劑量拮抗組LDH活性差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，S1P低劑量組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與正常對(duì)照組相比，S1P低、中劑量拮抗組LDH活性降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，與S1P高劑量拮抗組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表2。各組血清和睪丸之間的LDH活性趨勢(shì)見(jiàn)圖1。

表2　各組實(shí)驗(yàn)小鼠血清和睪丸LDH活性±s)

與環(huán)磷酰胺染毒組組比較，(1)P<0．05，(2)P<0．01；與正常對(duì)照組比較，(1)P<0．05，(2)P<0．01

圖1　各組小鼠血清和睪丸LDH活性Fig.1　Effect of S1P on activity of LDH of serum and testis in each experimental group of mice

2.3小鼠精子DNA損傷

熒光顯微鏡下，可見(jiàn)正常對(duì)照組的精子細(xì)胞大小均一，為一圓形熒光團(tuán)，熒光強(qiáng)度均勻，邊緣光滑，基本無(wú)拖尾現(xiàn)象(圖2A)；環(huán)磷酰胺染毒組精子細(xì)胞大部分出現(xiàn)明顯拖尾，尾部熒光強(qiáng)度較強(qiáng)，彗星頭部直徑較正常對(duì)照組減小(圖2B)；S1P劑量組隨著拮抗劑量的增加，出現(xiàn)拖尾的細(xì)胞逐漸減少，拖尾細(xì)胞的拖尾長(zhǎng)度也逐漸縮短(圖2C～E)。隨著S1P劑量的增加，TM和OTM逐漸降低(表3)，S1P中、高劑量組與環(huán)磷酰胺染毒組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，S1P低劑量組與染毒組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，S1P高劑量組與正常對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表3　各組實(shí)驗(yàn)小鼠生殖細(xì)胞DNA損傷情況±s)

(1)與環(huán)磷酰胺染毒組比較，P<0．01;(2)與正常對(duì)照組比較，P<0.01

注：A為染毒組，B為S1P低劑量組，C為S1P中劑量組，D為S1P高劑量組，E為正常對(duì)照組圖2　各組小鼠精子細(xì)胞彗星圖像(×200)Fig.2　Comet image of sperm cells in each experimental group of mice

3討論

精液質(zhì)量是評(píng)價(jià)雄性生育能力的重要指標(biāo)，其中精子數(shù)量、活動(dòng)率、精子畸形率是檢測(cè)各種理化因子對(duì)生殖細(xì)胞影響的敏感指標(biāo)。本次研究結(jié)果顯示，S1P劑量組小鼠雖然與正常對(duì)照組相比仍有差異，但與單純環(huán)磷酰胺染毒組相比，精子數(shù)量、活動(dòng)率顯著增加，精子畸形率顯著降低，精液質(zhì)量已經(jīng)明顯改善。其可能的原因是環(huán)磷酰胺能對(duì)細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路損傷。目前研究表明，S1P能夠通過(guò)與不同受體結(jié)合激活細(xì)胞內(nèi)外信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，通過(guò)與5個(gè)G蛋白耦聯(lián)受體(G-protein coupled receptor，GPCR)家族蛋白相互作用，觸發(fā)不同的細(xì)胞反應(yīng)，促進(jìn)細(xì)胞存活和增殖[9]。故本研究中S1P可能抑制了環(huán)磷酰胺對(duì)細(xì)胞信號(hào)通路的損傷，從而對(duì)小鼠精子數(shù)量和精子畸形率的改變產(chǎn)生了一定的干預(yù)作用。另外，本結(jié)果顯示S1P高劑量組與正常對(duì)照組比較依然有顯著性差異，故下一步將考慮分組時(shí)再設(shè)計(jì)一個(gè)更高的劑量，以便達(dá)到更顯著的效果。

LDH 是睪丸間質(zhì)細(xì)胞、支持細(xì)胞和生精上皮細(xì)胞膜和精子的標(biāo)志酶，其活力改變導(dǎo)致睪酮分泌減少，精細(xì)胞生長(zhǎng)因子減少，精子的發(fā)生和發(fā)育受阻，生精功能受損[10]。LDH幾乎存在于所有體細(xì)胞中，且有多種同工酶，分別為L(zhǎng)DH1～LDH5，睪丸和精子中則是LDHX，其電泳遷移率介于LDH4和LDH5之間。本研究還同時(shí)檢測(cè)了血清LDH，發(fā)現(xiàn)S1P各組血清總LDH活性與睪丸LDH的活性變化相一致，都呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，且從變化趨勢(shì)線斜率上看，睪丸LDH活性較血清總LDH活性稍大，說(shuō)明血清總LDH活性的升高是由于睪丸LDH活性的升高所致。本研究結(jié)果顯示，環(huán)磷酰胺染毒組小鼠血清和睪丸LDH 活性顯著降低，提示環(huán)磷酰胺可干擾生精細(xì)胞能量生成，從而導(dǎo)致成熟精子減少，活力下降。實(shí)驗(yàn)小鼠睪丸LDH隨S1P劑量的增加，活性明顯升高，推測(cè)S1P具有一定抗氧化作用，故對(duì)于環(huán)磷酰胺造成的小鼠睪丸組織損傷具有改善作用。其中，低S1P劑量組睪丸LDH活性雖然與染毒組相比未有明顯差異，但聯(lián)系該組的精子活力與畸形率結(jié)果，發(fā)現(xiàn)已經(jīng)與染毒組有差異，說(shuō)明低劑量S1P已經(jīng)對(duì)環(huán)磷酰胺的毒性作用產(chǎn)生了一定的抵御作用，而該抵御作用有可能是通過(guò)其他途徑來(lái)實(shí)現(xiàn)。

根據(jù)相關(guān)報(bào)道，彗星實(shí)驗(yàn)對(duì)于探索毒物對(duì)DNA 的直接損傷、DNA 或染色體突變的可能性的價(jià)值較高[11]。本研究在傳統(tǒng)的彗星實(shí)驗(yàn)方法步驟的基礎(chǔ)上增加了梯度脫水的環(huán)節(jié)，發(fā)現(xiàn)膠體在脫水后明顯變薄，使視野中觀察到的精子細(xì)胞基本上位于同一平面，提高了采圖效率和結(jié)果的可靠性。本研究結(jié)果顯示，環(huán)磷酰胺染毒組彗星拖尾明顯，證明環(huán)磷酰胺在停藥后對(duì)睪丸細(xì)胞DNA仍有持續(xù)的損傷作用，推測(cè)是環(huán)磷酰胺通過(guò)激活活性氧類物質(zhì)(reactive oxygen species，ROS)，使其超過(guò)了機(jī)體的抗氧化能力，直接氧化精子DNA堿基，造成精子DNA鏈損傷和斷裂[12]。可能是為保持遺傳分子的完整性，生殖細(xì)胞啟動(dòng)了DNA修復(fù)系統(tǒng)。然而當(dāng)修復(fù)失敗，DNA損傷會(huì)激活細(xì)胞凋亡的發(fā)生，以保持基因組的穩(wěn)定性。而高、中劑量的S1P可以明顯抑制由環(huán)磷酰胺引起的DNA損傷。低劑量S1P組與染毒組沒(méi)有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，因本次結(jié)果只統(tǒng)計(jì)200個(gè)細(xì)胞，猜想可能是由于實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)細(xì)胞量不夠大，致使最終結(jié)果未能看出明顯差異。推測(cè)如若將細(xì)胞量擴(kuò)大3～5倍，有可能會(huì)產(chǎn)生統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，此項(xiàng)內(nèi)容將在以后的研究中進(jìn)行。此外本次研究使用的是睪丸細(xì)胞混合懸液細(xì)胞，無(wú)法指出睪丸細(xì)胞中具體哪種細(xì)胞對(duì)環(huán)磷酰胺引起的遺傳損傷比較敏感，下一步將分離睪丸組織中的各類細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞凝膠電泳，以便區(qū)分哪類睪丸細(xì)胞對(duì)環(huán)磷酰胺最為敏感。

綜上，S1P對(duì)雄性小鼠的生殖毒性損傷有一定的拮抗作用，該作用可能與抗氧化有關(guān)，S1P可能活化了因環(huán)磷酰胺而降低的能量代謝酶LDH，提高精子的運(yùn)動(dòng)能力。S1P作用的具體機(jī)制及其與凋亡蛋白的相關(guān)性，仍有待下一步研究。

4參考文獻(xiàn)

[1] Suomalainen L，Pentikiinen V，Dunkel L．Sphingosine-1-phosphate inhibits nuclear factor KB activation and germ cell apoptosis in the human testis independently of its receptors[J]．Am J Pathol， 2015(3)：773-781.

[2] Mofita Y，Perez GI，Paris F，et al．Oocyte apoptosis is suppressed by disruption of the acid sphingomyelinase gene or by sphingosine-1-phosphate therapy [J]．Nat Med， 2010(10)：1109-1114．

[3] Ruth Z，Hansen PJ．Sphingosine-1-phosphate protects bovine oocytes from heat shock during maturation．Biol Rcprod， 2004(6)：2072-2078．

[4] Jee BC，Jo JW，Suh CS，et al．Dose-dependent effect of sphingosine-1-phosphate in mouse ooeyte maturation medium on subsequent embryo development[J]．Gynecol Obstet Invest， 2011(1)：32-36.

[5] Hannoun A，Ghaziri G，Musa AA，et al．Addition of sphingosine-1-phosphate to human oocyte culture medium decreases embryo fragmentation[J]．Reprod Biomed Online， 2010(3)：328-334．

[6] 楊群芳. 環(huán)磷酰胺對(duì)雄性生殖系統(tǒng)毒性損傷的研究進(jìn)展[J]. 兒科藥學(xué)雜志， 2013(3):62-65.

[7] Singh NP，MT，Tice RR，et al. A simple technique for quantification of low levels of DNA damage in dividual cells[J]. Exp Cell Res， 1988(175):184-191.

[8] 羅明志，齊浩，屈穎，等. 傳統(tǒng)單細(xì)胞凝膠電泳方法的改良[J]. 中華勞動(dòng)衛(wèi)生職業(yè)病雜志， 2007 (11)：674-675.

[9] 丁玉松，牛強(qiáng)，李述剛，等. 原花青素對(duì)氟致雄性小鼠精子數(shù)和畸形的改變[J]. 毒理學(xué)雜志， 2013 (3)：197-200.

[10]Fyrst H，Saba JD．An update on sphingosine-1-phosphate and other sphingolipid mediators．Nat Chem Biol， 2010 (7)：489-497．

[11]Marchlewica M，Michslska T，Wiszniewska B． Detection of leadinduced oxidative stress in the rat epididymis by chemil uminescence[J]．Chemosphere， 2004(10)：1553-1562．

[12]Simon L，Lutton D，McManus J，et al. Sperm DNA damage measured by the alkaline comet assay as an independent predicto of male infertility andinvitrofertilization success．Fertil Steril， 2011 (2) :652-657．

(2016-02-01收稿，2016-04-25修回)

中文編輯： 周凌； 英文編輯： 劉華

Study on Antagonistic Effect of S1P on Toxicity Damage to Male Mice' Reproductive Cells by Cyclophosphamide

LIU Danwei1， PAN Wei1， XU Guobing2， YANG Guozhen1

(1.DepartmentofMedicalLaboratory,GuizhouMedicalUniversity,Guiyang50004,Guizhou,China;2.DepartmentofMedicalLaboratory,BeijingCancerHospital,Beijing100142,China)

[Abstract]Objective: To study the antagonistic effect of S1P on toxicity damage to male mouse reproductive cells. Methods: Forty healthy male Kunming mice were randomly divided into 5 groups: normal control group( physiological saline), low S1P dose group(0.05 μg/g), middle S1P dose group(0.1 μg/g), high S1P dose(0.2 μg/g) and cyclophosphamide exposure control group.Mice in each group were given intraperitoneal injection for 5 days and killed on the 30th day after the first treatment. The serum, epididymis and testis of the mice were collected. The sperm count and the rate of sperm deformity were detected. The colorimetric method was adopted to detect LDH activity and the comet assay adopted to detect DNA damage of sperm. Results： Compared with cyclophosphamide exposure control group，sperm count increased, deformity rate decreased, LDH activity and cell DNA damage decreased in each experimental S1P group, and the differences between the two groups were statistically significant(P<0.05). Conclusion: S1P has antagonistic effect on toxicity damage to male mouse reproductive cells, can improve semen quality, activate energy metabolism enzyme LDH and resist DNA damage of sperm to some degree.

[Key words]mice; cerm cells; drug antagonism; sphingosine-1-phosphate

*[基金項(xiàng)目]國(guó)家自然科學(xué)基金(81560720)

[中圖分類號(hào)]R321

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

[文章編號(hào)]1000-2707(2016)05-0515-05

DOI:10.19367/j.cnki.1000-2707.2016.05.005

**通信作者 E-mail:yangguozhen-kong@hotmail.com

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2016-05-13網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20160513.2040.024.html