張思妮，馬小飛，張紅霞，王　震，張自剛，郭　冬，張永鵬，馬翎健*

(1 西北農(nóng)林科技大學(xué)，陜西楊陵 712100；2 山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院小麥研究所,山西臨汾 041000；3 河南省南陽(yáng)市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，河南南陽(yáng) 473000)

F型小麥雄性不育系花粉敗育和恢保關(guān)系研究

張思妮1，馬小飛2，張紅霞1，王震3，張自剛1，郭冬1，張永鵬1，馬翎健1*

(1 西北農(nóng)林科技大學(xué)，陜西楊陵 712100；2 山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院小麥研究所,山西臨汾 041000；3 河南省南陽(yáng)市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，河南南陽(yáng) 473000)

摘要：F型小麥雄性不育系是一種新型“三系”小麥雄性不育系。為研究F型不育系的花粉敗育特點(diǎn)并篩選其恢復(fù)源和保持源，采用I2-KI染色法觀察F、BNS、T、K和V型不育系揚(yáng)花期的花粉敗育類(lèi)型，并以F型不育系為母本與98個(gè)優(yōu)良小麥品種(系)進(jìn)行雜交，檢測(cè)F1代自交結(jié)實(shí)率。結(jié)果顯示：(1) F型不育系的花粉敗育率高達(dá)95.63%。其中，染敗型花粉比例最高，達(dá)到67.66%；圓敗率為19.32%；典敗率最少,僅為8.73%。(2) 5種不育系中，F(xiàn)型與K型不育系的花粉育性特征最接近，其次是V型不育系。(3) 98個(gè)組合F1的自交結(jié)實(shí)率(國(guó)際法)在100%以上11個(gè)，0%～10%有18個(gè)。(4)‘周麥16’、 M510、‘西農(nóng)815’、‘西農(nóng)585’對(duì) F型不育系的恢復(fù)力極強(qiáng)，是其優(yōu)良恢復(fù)系；‘天麥989’、‘存麥4號(hào)’、CY 5475、M460、‘12漯-1’和11GB02可通過(guò)回交培育成F型不育系的保持系。研究認(rèn)為，F(xiàn)型不育系花粉敗育徹底、穩(wěn)定，在常規(guī)小麥品系中較易找到其保持源和強(qiáng)恢復(fù)力品系，是一種良好的新型不育系。

關(guān)鍵詞：小麥；F型不育系；花粉敗育；恢保關(guān)系

細(xì)胞質(zhì)雄性不育性(cytoplasmic male sterility,CMS)是高等植物中廣泛存在的自然現(xiàn)象，是線粒體不育基因和細(xì)胞核基因互作的結(jié)果[1-2]。細(xì)胞質(zhì)雄性不育及育性恢復(fù)的機(jī)理研究證實(shí)細(xì)胞質(zhì)雄性不育的母性遺傳模式與線粒體基因組中的異常開(kāi)放讀碼框(open reading frame,ORF)關(guān)系緊密，而且可由細(xì)胞核編碼的育性恢復(fù)基因(Rf)恢復(fù)[3]，CMS/Rf系統(tǒng)是線粒體基因組和細(xì)胞核基因組互作研究的理想模式[4]。1962年美國(guó)Wilson和Ross成功培育出具有提莫菲維小麥(T.timopheevii)細(xì)胞質(zhì)的小麥雄性不育系。20世紀(jì)70年代中國(guó)成功實(shí)現(xiàn)雜交水稻三系配套，雜交水稻的大面積生產(chǎn)為中國(guó)的糧食增產(chǎn)做出了巨大貢獻(xiàn)[4]。目前雜種優(yōu)勢(shì)利用已在水稻[4](OryzasativaL.)、玉米[5](ZeamaysL.) 、高梁[6](SorghumvulgarePers)、大豆[7](Glycinemax(L.) Merr)等作物上取得重大成就。

小麥(TriticumaestivumL.)是中國(guó)主要的糧食作物，在人們的飲食結(jié)構(gòu)中處于不可替代的位置。在中國(guó)糧食生產(chǎn)十二連增的背景下，主栽品種遺傳背景狹窄、單產(chǎn)提高放緩、抗性減弱等難題客觀存在[8-10]。培育和推廣雜交小麥，綜合發(fā)揮其增產(chǎn)、抗逆、適應(yīng)性好等雜種優(yōu)勢(shì)，是保障糧食安全的必然選擇?；謴?fù)源篩選是小麥雄性不育系，特別是“三系法”雜種優(yōu)勢(shì)利用的首要環(huán)節(jié)。經(jīng)過(guò)半個(gè)世紀(jì)的系統(tǒng)研究，研究人員發(fā)現(xiàn)了多個(gè)優(yōu)良的小麥不育系恢復(fù)源材料，三系雜交小麥研究取得巨大進(jìn)展，但T、K、V型等不育系的強(qiáng)恢復(fù)源較少，雜種優(yōu)勢(shì)不顯著等缺陷也顯露出來(lái)，實(shí)際生產(chǎn)中有巨大應(yīng)用價(jià)值的恢復(fù)源卻為數(shù)不多[10-14]。F型小麥雄性不育系是利用六倍體小麥種間雜交和回交育成。開(kāi)展新型小麥不育系材料的恢復(fù)源、保持源鑒定工作，為小麥不育系的生產(chǎn)應(yīng)用提供依據(jù)，也是充分發(fā)揮小麥雜種優(yōu)勢(shì)價(jià)值的有力探索。

1材料與方法

1.1材料

F型小麥雄性不育系由山西運(yùn)城藍(lán)紅雜交小麥研究中心提供；BNS、T、K和V型不育系及國(guó)內(nèi)不同生態(tài)區(qū)的98份小麥優(yōu)良品系由西北農(nóng)林科技大學(xué)雜種優(yōu)勢(shì)課題組提供。

1.2方法

揚(yáng)花期取小麥穗上、中、下部3個(gè)中間小穗各2個(gè)花藥，用解剖針切斷花藥，將花粉粒擠出混合后用2% (g/v) I2-KI溶液染色1 min，用Olympus生物顯微鏡在10×40倍下觀察，統(tǒng)計(jì)10個(gè)視野(樣本>1 500)的典敗、圓敗、染敗及可育花粉個(gè)數(shù)?；ǚ蹟∮?(敗育花粉數(shù)/花粉總數(shù))×100%。

2014年5月以98個(gè)常規(guī)品種(系)為父本與F型小麥不育系母本分別配制10個(gè)雜交穗，收獲雜種F1種子；同年10月將F1代單行種植，采用常規(guī)大田管理；次年抽穗期，每行隨機(jī)選取10穗套玻璃紙袋，充分灌漿后調(diào)查成熟期F1代的穗粒數(shù)、小穗數(shù)；計(jì)算雜交組合的平均自交結(jié)實(shí)率、不育率。

結(jié)實(shí)率(國(guó)際法)=(有效小穗結(jié)實(shí)數(shù)/有效小穗數(shù)×2)×100%

結(jié)實(shí)率(國(guó)內(nèi)法)=(有效小穗基部?jī)蓚?cè)小花結(jié)實(shí)數(shù)/有效小穗基部小花總數(shù))×100%

不育率=1-(有效小穗基部?jī)蓚?cè)小花結(jié)實(shí)數(shù)/有效小穗基部小花總數(shù))×100%

品種(系)的恢復(fù)度以F1代自交結(jié)實(shí)率(國(guó)內(nèi)法)表示，根據(jù)恢復(fù)度大小將其分為5個(gè)等級(jí)：全不育，恢復(fù)度為0；高不育，恢復(fù)度0～20%；半不育，恢復(fù)度20%～50%；高可育，恢復(fù)度50%～80%；全可育，恢復(fù)度在80%以上[15]。

1.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

試驗(yàn)數(shù)據(jù)使用Excel 2007進(jìn)行分析制表，SPSS作圖；Duncan’s法作敗育花粉差異顯著性比較；以Pearson系數(shù)相似性矩陣度量，采用R型聚類(lèi)分析不育系花粉育性特征。

2結(jié)果與分析

2.1F型不育系花粉敗育特點(diǎn)

圖1中典敗率的比較發(fā)現(xiàn)，BNS不育系的花粉典敗率最高，為77.83%，其次是T型(40.15%)，其它3類(lèi)不育系的典敗率比較接近且差異不顯著，F(xiàn)型典敗率僅為8.73%，是5種不育系中最低的。說(shuō)明F型不育系的典敗型花粉很少。5種不育系花粉圓敗率均未超過(guò)50%，T型不育系最高，也只有48.50%，顯著高于其它類(lèi)型，F(xiàn)型不育系圓敗率為19.32%，與BNS接近，但并不是其主要的敗育類(lèi)型。說(shuō)明圓敗花粉是T型不育系花粉的主要類(lèi)型，F(xiàn)型不育系的圓敗花粉比例較低。在染敗花粉方面，F(xiàn)型不育系花粉染敗率最高，達(dá)到67.66%，K型和T型不育系也分別高達(dá)65.03%和48.68%，其余2種不育系染敗花粉率均低于10%。說(shuō)明花粉染敗是F型和K型不育系花粉最主要的敗育特征，也是T型不育系花粉敗育的重要類(lèi)型。F型不育系敗育花粉率高達(dá)95.63%，5種不育系可育花粉率非常接近，且均低于5%。

從表1可知，5種不育系的典敗、圓敗、染敗花粉類(lèi)型的變異系數(shù)分別為0.853、0.650和0.781。說(shuō)明不育系的花粉敗育類(lèi)型差異較大，典敗花粉可以作為鑒別BNS不育系的重要依據(jù)；較高的花粉典敗和圓敗率是T型不育系的特點(diǎn)；圓敗和染敗則是V型不育系花粉敗育的重要類(lèi)型；而F型和K型不育系的主要花粉敗育類(lèi)型均為染敗型。5種不育系的可育花粉率變異系數(shù)僅為0.152，試驗(yàn)調(diào)查的F型不育系自交結(jié)實(shí)率為2.7%，低于5種不育系均值3.59%，說(shuō)明F型不育系育性穩(wěn)定。

對(duì)5種不育系典敗率、圓敗率、染敗率、可育花粉率、自交結(jié)實(shí)率進(jìn)行聚類(lèi)分析(圖2)。聚類(lèi)分析首先將F型和K型不育系聚為一類(lèi)，F(xiàn)型與K型不育系相似系數(shù)最高，達(dá)到0.962；隨后又將V型不育系歸入，F(xiàn)型與V型不育系相似系數(shù)為0.913，與T型不育系相似度最低，僅有-0.144。由上述聚類(lèi)變量推測(cè)，F(xiàn)型不育系與K型不育系育性特征最接近，其次是V型不育系。

2.2F型不育系的恢復(fù)度測(cè)定

由圖3可知，F(xiàn)型不育系雜交組合F1自交結(jié)實(shí)率(國(guó)際法)分布范圍呈現(xiàn)一定的正態(tài)分布特征，結(jié)實(shí)率(國(guó)際法)處于60%～70%、70%～80%的組合數(shù)各有11個(gè)；98個(gè)組合中共有45個(gè)組合結(jié)實(shí)率(國(guó)際法)在60%以上，占全部組合的45.92%；結(jié)實(shí)率(國(guó)際法)在100%以上11個(gè)，占11.22%；結(jié)實(shí)率(國(guó)際法)在0%～10%的最多，為18個(gè)，占到總數(shù)18.37%。說(shuō)明國(guó)內(nèi)不同生態(tài)區(qū)98個(gè)小麥常規(guī)優(yōu)質(zhì)品種(系)中有一半以上不能恢復(fù)F型不育系的育性，能夠部分或較好恢復(fù)其育性的材料占比較低，中等和低恢復(fù)力品系較多；但在低恢復(fù)力的品系中可篩選F型不育系的保持系。

F.F型不育系；BNS.BNS不育系；K.K型不育系；T.T型不育系；V.V型不育系；CK.西農(nóng)979;下同 不同小寫(xiě)字母代表同一指標(biāo)不同不育系間差異達(dá)到顯著水平(P<0.05)

表1　5種不育系自交結(jié)實(shí)率和花粉育性特征的變異系數(shù)

圖2　5種小麥不育系的相似系數(shù)聚類(lèi)

表2中F1結(jié)實(shí)率(國(guó)內(nèi)法)在80%以上的組合為F(A)/周麥16、F(A)/M510、F(A)/西農(nóng)815和F(A)/西農(nóng)585，其中F(A)/M510組合的自交結(jié)實(shí)率最高，達(dá)到92.17%(國(guó)內(nèi)法)和149.41%(國(guó)際法)；4個(gè)組合F1表現(xiàn)為全可育，M510、‘周麥16’、‘西農(nóng)815’、‘西農(nóng)585’對(duì) F型不育系的恢復(fù)度達(dá)到83.35%以上，是F型不育系的優(yōu)良恢復(fù)系；自交結(jié)實(shí)率>100%(國(guó)際法)的材料，如：M288和‘西農(nóng)165’，可作為F型不育系的候選恢復(fù)源。國(guó)內(nèi)法和國(guó)際法結(jié)實(shí)率相關(guān)系數(shù)為0.978，為極顯著相關(guān)，二者均能作為篩選恢保源的依據(jù)，兩者兼用能提高篩選準(zhǔn)確性。另發(fā)現(xiàn)國(guó)際法結(jié)實(shí)率都高于國(guó)內(nèi)法，F(xiàn)(A)/M396、F(A)/11GC01組合的國(guó)內(nèi)法結(jié)實(shí)率為0，國(guó)際算法卻不為0。說(shuō)明小穗中部小花易結(jié)實(shí)，國(guó)際法對(duì)此恢復(fù)系特性能很好地保留和解釋。F(A)/天麥989、F(A)/存麥4號(hào)、F(A)/CY5475、F(A)/M460、F(A)/11GB02和F(A)/12漯-1組合的國(guó)內(nèi)法和國(guó)際法自交結(jié)實(shí)率均為0，表現(xiàn)為全不育，恢復(fù)度為0，可以穩(wěn)定地保持F型不育系，說(shuō)明‘天麥989’、‘存麥4號(hào)’、CY 5475、M460、11GB02和‘12漯-1’可通過(guò)回交轉(zhuǎn)育為F型不育系的保持系。而‘西農(nóng)2208’、N0381及M326的雜交F1不育率都在97.5%以上，通過(guò)不育基因的累加可使雜交種全不育，是潛在的保持系資源。

圖3　F1自交結(jié)實(shí)率(國(guó)際法)范圍分布

表2　31個(gè)組合的F1自交結(jié)實(shí)率(國(guó)際法>100%或國(guó)內(nèi)法<10%)

注：國(guó)內(nèi)法和國(guó)際法結(jié)實(shí)率相關(guān)系數(shù)為0.978；F(A)表示F型不育系；Cf、Hf、HS、CS分別表示F1為全可育、高可育、高不育、全不育。

Note:Related coefficient between national and international self-seedset ratio is significant at 0.01 level;F(A) represents F-type sterile line;Cf.Complete fertility;Hf.High fertility;HS.High sterility;CS.Complete sterility.

3討論

小麥雄性不育系小孢子敗育主要發(fā)生在花粉細(xì)胞形成階段，線粒體基因組中與CMS相關(guān)的ORF表達(dá)，導(dǎo)致線粒體供能匱乏，花粉囊結(jié)構(gòu)缺失，花粉粒保護(hù)層被削弱[16-17]?；ㄋ幇l(fā)育后期MADS3參與調(diào)解活性氧(reactive oxygen species,ROS)代謝平衡[18]，不育系穗部POD、SOD和CAT等活性氧代謝酶活性異常，線粒體定位蛋白COX11被抑制，引發(fā)花藥細(xì)胞膜脂過(guò)氧化[19-20]?；ǚ鄢⒔Y(jié)構(gòu)觀察發(fā)現(xiàn)，小麥不育二胞花粉的營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞中自體吞嗜泡形成并融入大液泡，營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞未積累淀粉粒、脂類(lèi)等能量物質(zhì)，導(dǎo)致核分裂異常[21-22]。趙卜等[23]發(fā)現(xiàn)F型小麥雄性不育系花粉母細(xì)胞在二核期生殖核和營(yíng)養(yǎng)核先后降解，產(chǎn)生大量無(wú)核小孢子。T型不育系在小孢子后期藥室合并，花粉典敗、圓敗[24]；K型不育系花粉在單核晚期染敗；V型不育系的花粉則以圓敗和淺染敗為主；BNS不育系花粉在雄性完全敗育階段以典敗為主[19,24-25]。本研究中，F(xiàn)型不育系染敗花粉比例最高，與K型不育系的花粉育性特征最為接近，這與前人研究結(jié)果基本一致，可能是兩者的核質(zhì)基因互作模式具有一定的遺傳相似性；5種小麥雄性不育系的花粉敗育差異，可能與其敗育機(jī)理以及敏感時(shí)期存在聯(lián)系；F型不育系具備T、K、BNS不育系徹底不育特性；較低的自交結(jié)實(shí)率說(shuō)明F型不育系的育性基因遺傳模式存在特異性。通過(guò)花粉育性比較初步鑒定不育系類(lèi)型是不育系細(xì)胞結(jié)構(gòu)觀察和分子機(jī)理研究的基礎(chǔ)。

CMS恢復(fù)基因影響不育基因轉(zhuǎn)錄或翻譯水平上的調(diào)控，使不育基因的表達(dá)受到抑制[16]。BoroII型水稻細(xì)胞質(zhì)雄性不育相關(guān)的2個(gè)PPR蛋白基因中的任何一個(gè)均可破壞或降解由線粒體編碼的細(xì)胞

毒素肽，使植株育性恢復(fù)[26]。育種家一直致力于小麥不育系的恢復(fù)源篩選工作，并在強(qiáng)恢復(fù)系基礎(chǔ)上選配出了強(qiáng)優(yōu)勢(shì)組合，‘西雜5號(hào)’、‘綿雜麥168’等雜交小麥已在生產(chǎn)上得到推廣應(yīng)用[10-11,27-28]。T型小麥雄性不育系的育性恢復(fù)由2對(duì)主效恢復(fù)基因和多對(duì)微效基因共同控制，且不育系恢復(fù)源比較狹窄[14,29]。曾俊莉等[13]研究發(fā)現(xiàn)K型小麥不育系易恢復(fù)性A116>A306/A1129>KJ23A，RE9、R92、RE6、R45233的平均恢復(fù)度超過(guò)70%；SN33與KTP116A的F1結(jié)實(shí)率高達(dá)95.96%[30]。鑒于K型、F型小麥雄性不育系的花藥育性特征相似，上述恢復(fù)力強(qiáng)且穩(wěn)定的K型不育恢復(fù)系可與F型不育系測(cè)恢選配。BNS/周麥16、BNS/天麥989的F1自交結(jié)實(shí)率(國(guó)際法)分別為2.31%和134.72%[31-32]。而本試驗(yàn)中，‘周麥16’是F型不育系的恢復(fù)源，‘天麥989’則是保持源，推測(cè)F型不育系與BNS溫敏型不育系的育性恢復(fù)機(jī)理存在巨大差異。細(xì)胞質(zhì)不育恢復(fù)性受異源細(xì)胞質(zhì)和染色體核型共同影響[33]。本試驗(yàn)中F型小麥雄性不育系的不育特性較好、可恢復(fù)性適中，現(xiàn)代育成品系中較易找到其恢復(fù)源，具有小麥雜種優(yōu)勢(shì)利用和雄性不育機(jī)理研究?jī)r(jià)值；M510、‘周麥16’、‘西農(nóng)815’、‘西農(nóng)585’是F型不育系的優(yōu)良恢復(fù)系?！茺?6’是小麥分蘗穗不育系(male sterility in tillers ears,MSTE)和DSV型小麥雄性不育系的理想恢復(fù)系[14,34]，對(duì)多種小麥雄性不育系均具有一定的育性恢復(fù)能力，可能攜帶小麥核質(zhì)不育主效恢復(fù)基因。鑒于環(huán)境與基因互作的影響，M288和‘西農(nóng)165’等F型不育系的潛在強(qiáng)恢復(fù)源可進(jìn)一步利用；‘天麥989’、‘存麥4號(hào)’、CY5475等F型不育系的保持系，能在不育系繁殖中發(fā)揮價(jià)值；其F1代可結(jié)合F型不育系的恢復(fù)系，轉(zhuǎn)化創(chuàng)制出不育系新類(lèi)型。

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(編輯:宋亞珍)

Pollen Abortion of F-type Male Sterile Line and Its Restorer and Maintainer Lines

ZHANG Sini1,MA Xiaofei2,ZHANG Hongxia1,WANG Zhen3,ZHANG Zigang1,GUO Dong1,ZHANG Yongpeng1,MA Lingjian1*

(1 College of Agronomy,Northwest A & F University,Yangling,Shaanxi 712100,China;2 Wheat Research Institute of Agricultural Sciences,Linfen,Shanxi 041000,China;3 Nanyang Agricultural Science Research Institute,Nanyang，Henan 473000,China)

Abstract:F-type wheat male sterile line is a new “three lines” with karyoplasm interaction.For study the pollen characteristics of F-type sterile line and screening its restorers and maintainers,the I2- KI staining method is used to observe pollens of F,BNS,T,K and V-type wheat male sterile lines at blooming stage,and using 98 hybrid combinations that F-type sterile line was female and 98 quality wheat lines were male to detect the self seedset ratios on F1of combinations.Results showed that:(1) pollen sterility rate of F-type sterile line reached 95.63% including the highest 67.66% stained aborted rate,19.32% spherical aborted rate and only 8.73% typical aborted.(2) The pollen sterility characteristics of F-type was most similar to K-type,the second was V-type in 5 kinds of sterile lines.(3) In 98 hybridized combinations,11 self-seedset ratios (international) were more than 100% and 18 at 0%-10%.(4)‘Zhoumai16’,M510,‘Xinong 815’ and ‘Xinong 585’ were excellent restorer lines to F-type sterile line.‘Tianmai 989’,‘Cunmai 4’,CY5475,M460,‘12 Luo-1’ and 11GB02 were good maintainers for F-type sterile line by backcross cultivation.Research suggests that F-type male sterile line has thorough and stable pollen abortion and easily sought its maintainer resources and excellent restorers on fertility.

Key words:wheat;F-type sterile line;pollen abortion;restorer and maintainer line

文章編號(hào):1000-4025(2016)04-0667-07

doi:10.7606/j.issn.1000-4025.2016.04.0667

收稿日期：2016-01-11；修改稿收到日期：2016-03-08

基金項(xiàng)目：國(guó)家科技支撐計(jì)劃(2013BAD04B02)；“948”項(xiàng)目(K312021505)；陜西省重點(diǎn)產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新項(xiàng)目(K3320215198)

作者簡(jiǎn)介：張思妮(1992-)，女，在讀碩士研究生，主要從事小麥雄性不育和雜種優(yōu)勢(shì)利用研究。E-mail:1448919772@qq.com *通信作者：馬翎健，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事小麥雄性不育和雜種優(yōu)勢(shì)利用研究。E-mail:malingjian@nwsuaf.edu.cn

中圖分類(lèi)號(hào)：Q343.3+4

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A