陳　黎，李國勤，田　勇，沈軍達，陶爭榮，徐　堅，曾　濤，盧立志

(浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 畜牧獸醫(yī)研究所，浙江 杭州310021)

北京鴨腹部脂肪組織的轉(zhuǎn)錄組特征分析

陳黎，李國勤，田勇，沈軍達，陶爭榮，徐堅，曾濤，盧立志*

(浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 畜牧獸醫(yī)研究所，浙江 杭州310021)

摘要：鴨的基因組序列雖已釋放，但其基因組信息，尤其是轉(zhuǎn)錄組信息仍需進一步開發(fā)。文章利用轉(zhuǎn)錄組測序分析了鴨的腹部脂肪組織轉(zhuǎn)錄組特征。共獲得203 200 984個高質(zhì)量測序數(shù)據(jù)，鑒定出18 464個基因表達(RPKM≥1)，其中96.9%的基因RPKM值小于1 000。15 070個基因發(fā)生了可變剪切，剪切次數(shù)為35 913次。統(tǒng)計可變剪切類型發(fā)現(xiàn)，內(nèi)含子保留所占比例最低，占所有可變剪切類型的1.17%，而第一外顯子可變剪切、末端外顯子可變剪切、外顯子跳躍依次是3種比例最高的可變剪切類型，比例分別為45.92%， 43.67%和6.23%。此外，利用這批轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)共檢測出229 276個SNPs，其中轉(zhuǎn)換是最主要的突變類型，占所有SNPs的73.28%。對SNP所在基因進行功能注釋(GO)發(fā)現(xiàn)，這些基因涉及細胞組分、分子功能、生物學(xué)過程3大功能類別中廣泛的生物功能，表明該研究開發(fā)的SNPs較為全面；通路分析(KEGG)發(fā)現(xiàn)，SNPs所在基因除了富集于脂類、能量代謝相關(guān)通路，更多的基因則富集于癌癥、免疫以及內(nèi)分泌系統(tǒng)相關(guān)的通路上，表明脂肪組織除了是能量儲備組織，同時也是重要的免疫、內(nèi)分泌組織。這些數(shù)據(jù)拓展了鴨的遺傳信息，建立的SNPs數(shù)據(jù)庫將有助于鴨分子標(biāo)記輔助育種及功能基因定位。與癌癥、免疫相關(guān)的SNPs可為癌癥及免疫學(xué)研究提供候選遺傳標(biāo)記。

關(guān)鍵詞：基因表達；可變剪切；單核苷酸多態(tài)性；脂肪組織

轉(zhuǎn)錄組測序(RNA-seq)是基于二代測序技術(shù)的轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究方法。RNA-seq可在全基因組范圍內(nèi)檢測轉(zhuǎn)錄本表達水平，同時還能發(fā)現(xiàn)未知轉(zhuǎn)錄本和新基因，識別可變剪切位點以及SNP(single nucleotide poly morphism)[1]。與傳統(tǒng)的RNA研究手段(例如芯片)相比，RNA-seq具備靈敏度高、重復(fù)性好等優(yōu)勢。目前，隨著測序技術(shù)發(fā)展及成本降低，RNA-seq已經(jīng)成為轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究的有效手段，借助該技術(shù)，多個物種的轉(zhuǎn)錄組信息得以釋放。

鴨是重要的經(jīng)濟水禽，同時也是免疫研究的模式動物。目前，在鴨中已有利用RNA-seq開展轉(zhuǎn)錄組研究的報道。Li等[2]通過對鴨羽毛組織轉(zhuǎn)錄組測序，篩選出與羽色相關(guān)的候選基因；Tang等[3]對鴨肝臟組織的轉(zhuǎn)錄本進行了組裝、注釋，篩選出一批受甲肝病毒感染后表達變化的基因，為后續(xù)研究甲肝病毒感染的分子機制提供了線索。隨后，Huang等[4]在公布鴨基因組序列的同時，利用RNA-seq檢測了肺部被禽流感病毒感染后的基因表達變化。以上這些研究僅關(guān)注轉(zhuǎn)錄本的表達變化，尚未對可變剪切、SNP等信息進行報道。盡管Chen等[5]利用RNA-seq，比較了北京鴨與綠頭野鴨在基因表達、可變剪切以及SNP方面的差異，但缺乏對鴨基因表達、可變剪切以及SNP的特征分析。 因此，本研究利用北京鴨腹部脂肪組織RNA-seq數(shù)據(jù)，對鴨脂肪組織內(nèi)基因的表達水平及可變剪切特征進行分析，同時利用轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)構(gòu)建SNP數(shù)據(jù)庫，為鴨提供可用的遺傳標(biāo)記。

1材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1試驗動物

本研究所用北京鴨來自湖州卓旺養(yǎng)鴨場。試驗用鴨采用玉米豆粕型飼糧，自由采食和飲水。喂養(yǎng)至8周齡時進行屠宰，并立即取其腹部脂肪組織待提取RNA用。實驗動物屠宰標(biāo)準(zhǔn)按照國家實驗動物處理行為準(zhǔn)則執(zhí)行。

1.1.2主要試劑

提取RNA所用TRIzol試劑購自Life Technologies公司。

1.2試驗方法

1.2.1RNA-seq測序、數(shù)據(jù)組裝及注釋

3只8周齡北京鴨，每只個體取300 mg腹脂，按照RNAeasy Lipid Tissue Mini Kit (QIAGEN，Germany)說明書分別提取總RNA。每個個體總RNA單獨建庫，隨后利用Illumina HiSeq 2000 (Illumina， America) 平臺進行雙末端測序。測序數(shù)據(jù)過濾掉低質(zhì)量數(shù)據(jù)及無用序列，包括測序接頭、rRNA、tRNA以及miRNA等非編碼RNA序列。獲得高質(zhì)量數(shù)據(jù)后，利用TopHat v2.0.9[6]將數(shù)據(jù)比對到鴨參考基因組上(BGI_duck_1.0)，隨后利用Cufflinks v2.1.1[7]默認參數(shù)對比對上的序列進行組裝、注釋及表達量的計算。

1.2.2SNP的挖掘及可變剪切鑒定

以鴨基因組(BGI_duck_1.0)做參考序列，利用SAMtools 0.1.19[8]尋找SNPs(single nucleotide polymorphisms)，并利用BEDTOOLS 2.17.0對SNP進行篩選?？勺兗羟袇⒄誇lorea 等[9]的方法利用ASprofile 進行分析。所有軟件參數(shù)設(shè)置為默認參數(shù)。

1.2.3基因注釋

GO(gene ontology)注釋來源于GO數(shù)據(jù)庫(http://www.geneontology.org/)；通路分析采用KEGG(kyoto encyclopedia of genes and genomes)數(shù)據(jù)庫。

2結(jié)果與分析

2.1北京鴨腹部脂肪組織基因表達分析

共獲得203 200 984個高質(zhì)量的北京鴨腹脂轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，3個樣本的Q20均大于95%，GC含量均接近50%，表明測序數(shù)據(jù)質(zhì)量較好(表1)。RPKM(reads per kilo bases per million reads)是每百萬reads 中來自某一基因每千堿基長度的reads 數(shù)目，是目前最常用的基因表達水平估算方法[10]。本研究以RPKM≥1作為基因表達標(biāo)準(zhǔn)，在北京鴨腹部脂肪組織中共鑒定出18 464個基因表達，其中11 047個基因在基因組上已有注釋。對不同RPKM區(qū)間的基因數(shù)量進行統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，多數(shù)基因的RPKM值在1 000以下，其中RPKM值在1～10的基因最多，為8 600個；其次是RPKM值位于10～100的基因，數(shù)量為7 478個；RPKM值位于100～1 000的基因有1 806個，而RPKM值大于1 000的基因最少，有580個，占所有表達基因的3.1%。

表1測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計表

Table 1Statistics of RNA-seq data

樣本名稱高質(zhì)量數(shù)據(jù)Q20值/%GC含量/%PD310935514297.3449.27PD44499186697.3549.31PD54885397697.3549.48

注：PD3，PD4，PD5分別代表北京鴨的3個生物學(xué)重復(fù)。下同。

2.2北京鴨可變剪切分析

可變剪接是調(diào)節(jié)基因表達和產(chǎn)生蛋白質(zhì)多樣性的重要機制。本研究分析了5種主要的可變剪切類型，包括內(nèi)含子保留(intron retention， IR)、5’或3’可變剪切(alternative exon ends， AE)、外顯子跳躍(skipped exon， SE)、第一外顯子可變剪切(alternative first exons， AF)、末端外顯子可變剪切(alternative last exons， AL)。利用轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，本研究共鑒定出約35 913次可變剪切，這些可變剪切由15 070個基因產(chǎn)生。在這5種可變剪切類型中IR所占比例最低，AF及AL比例最高，分別占所有可變剪切事件的45.92%及43.67%(表2)。

表2可變剪切類型統(tǒng)計表

Table 2Statistics of the alternative splicing (AS) events

樣本名基因數(shù)/個可變剪切次數(shù)/次5種可變剪切類型的基因數(shù)/個(比例/%)IRAESEAFALPD31579638028552(1.45)1183(3.11)2394(6.30)17429(45.83)16470(43.31)PD41462934566370(1.07)988(2.86)2136(6.18)15887(45.96)15185(43.93)PD51478635146350(0.99)1064(3.03)2186(6.22)16162(45.98)15384(43.77)

2.3SNP鑒定

利用SAMtools，共挖掘出229 276個SNP，其中168 028個為轉(zhuǎn)換，61 248個為顛換。轉(zhuǎn)換發(fā)生比例為73.28%，是最主要的突變類型(圖1)。

圖1　SNPs類型統(tǒng)計Fig.1　Statistics of types of SNPs

GO注釋發(fā)現(xiàn)SNP所在基因共歸入到9 814個GO term中。根據(jù)富集的基因數(shù)量，分別統(tǒng)計分子功能、生物學(xué)過程、細胞組件中位于前10位的GO term(圖2)。在分子功能中，與蛋白綁定(protein binding)、ATP綁定(ATP binding)以及鋅離子綁定(zinc ion binding)相關(guān)的基因最多，分別為5 262，798，653個；在細胞組件中，位于細胞核(nucleus)、細胞質(zhì)(cytoplasm)和細胞膜(membrane)的基因最多，分別有2 151，2 017和904個；生物學(xué)過程中，歸入DNA依賴的轉(zhuǎn)錄調(diào)控(regulation of transcription， DNA-dependent)、RNA聚合酶Ⅱ啟動子的轉(zhuǎn)錄正調(diào)控(positive regulation of transcription from RNA polymerase Ⅱ promoter)以及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)(signal transduction)3個GO term的基因最多，分別有473，401，392個。

三大類別分別列出了富集基因數(shù)量位于前10位的GO term。圖2　SNP所在基因的GO分類Fig.2　GO classifications of genes containing SNPs

同時，為確定SNP參與的主要生化代謝途徑和信號通路，對SNP所在基因進行KEGG(kyoto encyclopedia of genes and genomes)通路分析，共鑒定出25個通路(圖3)，其中歸入癌癥的基因最多，為1 031個，其次是信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及免疫系統(tǒng)，分別有956個及812個基因；歸入內(nèi)分泌系統(tǒng)及脂肪代謝的基因也較多，分別有466和235個；歸入碳水化合物代謝及能量代謝中的基因分別有138和66個。

3討論

RNA-seq原始數(shù)據(jù)需要進行嚴格的質(zhì)控。本研究在獲得鴨轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)后，首先對原始數(shù)據(jù)進行質(zhì)控。Q20與GC含量是衡量測序質(zhì)量的重要指標(biāo)。Q20表示質(zhì)量數(shù)大于20的堿基占總體堿基的比例，Q20越高表明測序錯誤率低于1%的堿基比例越高。GC含量則用于分析建庫或測序過程是否帶來堿基偏離，正常情況下，4種堿基的出現(xiàn)頻率接近。本研究3個樣本的Q20及GC%的平均值分別為97.35%和49.35%，表明測序質(zhì)量較高，為后續(xù)數(shù)據(jù)分析的可靠性奠定了基礎(chǔ)。

圖3　SNPs所在基因的KEGG通路分析Fig.3　KEGG pathways of genes including SNPs

可變剪接是真核生物基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的重要機制?；蛲ㄟ^可變剪切產(chǎn)生不同的轉(zhuǎn)錄本，使遺傳信息得到放大。最近，Chen等[5]利用RNA-seq在鴨中鑒定出6 980個基因發(fā)生了23 393次可變剪切，發(fā)生可變剪切的基因數(shù)量遠低于本研究中鑒定出的基因數(shù)量，這可能是因為可變剪切分析方法與鑒定標(biāo)準(zhǔn)不同。本研究利用北京鴨腹脂轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)共鑒定出18 464個基因表達，其中15 070個基因發(fā)生了35 913次可變剪切，可變剪切發(fā)生率約為82%，低于人類的95%[11]，高于果蠅的60%[12]，與越是高等生物可變剪切比例越高的報道一致[13]。在本研究中，IR在所有可變剪切類型中比例最低，與目前報道的動物中IR是比例最低的可變剪切類型[13-15]的觀點一致。

利用轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)挖掘SNP已有多篇報道。Chen等[5]利用轉(zhuǎn)錄組測序比較了北京鴨與綠頭野鴨腹部脂肪組織中的差異SNP，但未對全基因組SNP進行特征分析。本研究利用北京鴨腹部脂肪組織轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)共檢測出229 276個SNP，這是目前鴨中首次在全基因組范圍內(nèi)挖掘SNP的報道，對SNP所在基因進行功能注釋，發(fā)現(xiàn)這些基因涉及細胞組分、分子功能及生物學(xué)過程3大功能類別中廣泛的生物功能，表明本研究開發(fā)出的SNP較為全面，與多種生物功能關(guān)聯(lián)，方便了后續(xù)的基因定位及分子標(biāo)記育種。對SNP所在基因通路分析發(fā)現(xiàn)，歸入癌癥以及免疫、內(nèi)分泌系統(tǒng)的基因最多，這與脂肪組織除了是能量儲備組織，同時也是重要的免疫、內(nèi)分泌組織的報道相符[5，16]，這些SNP可作為癌癥、免疫相關(guān)的候選SNP。

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(責(zé)任編輯盧福莊)

Transcriptome analysis of abdominal fats from Peking ducks by RNA-seq

CHEN Li， LI Guo-qin， TIAN Yong， SHEN Jun-da， TAO Zheng-rong， XU Jian， ZENG Tao， LU Li-zhi*

(InstituteofAnimalHusbandryandVeterinaryScience，ZhejiangAcademyofAgriculturalSciences，Hangzhou310021，China)

Abstract:Although the duck genome sequence has been released， its genomic structure， especially its transcriptome characterization needs to be further studied. This study characterized the transcriptome of abdominal fat in ducks by using RNA-seq. In total， 203 200 984 clean reads were obtained， and 18 464 genes were identified to be expressed in abdominal fat， among which 96.9% genes’ RPKM values were lower than 1 000. 15 070 genes had alternative splicing (AS)， and the splicing times were 35 913. Intron retention was found to be the rarest AS type， while alternative first exons， alternative last exons and skipped exon were the three major types， with the proportions of 45.92%， 43.67% and 6.23%， respectively. Using these transcriptome data， 229 276 SNPs were called， among which transitions were the main type， accounting for 73.28% of all the SNPs. Gene ontology(GO) annotation analysis revealed that genes including these SNPs took part in numerous functions belonging to the three categories of cellular component， molecular function， and biological process， and further kyoto encyclopedia of genes and genomes(KEGG) pathway analysis showed that most of these genes were related to cancer， immune system， and endocrine system， suggesting that the adipose tissue was an important immune and endocrine tissue， as well as an energy store tissue. These data could enlarge the genetic information of ducks. The numerous SNPs identified in this study would contribute to the molecular breeding and help in mapping the genes associated with important economic traits. The SNPs related with cancers and immune systems would serve as useful markers in related studies.

Key words:gene expression; alternative splicing; single nucleotide polymorphism; adipose tissue

基金項目：國家自然科學(xué)基金項目(31402065)；浙江省自然科學(xué)基金項目(LQ14C170003)

作者簡介：陳黎(1984—)，女，江蘇徐州人，博士，助理研究員，從事家禽遺傳育種方面的研究。E-mail： chenli0429@163.com

*通信作者，盧立志，E-mail：lulizhibox@163.com

DOI:10.3969/j.issn.1004-1524.2016.05.05

中圖分類號：S834+.81；Q789

文獻標(biāo)志碼：A

文章編號：1004-1524(2016)05-0743-05

投稿日期：2016-01-28

浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報ActaAgriculturaeZhejiangensis， 2016，28(5): 743-747

http://www.zjnyxb.cn

陳黎，李國勤，田勇，等. 北京鴨腹部脂肪組織的轉(zhuǎn)錄組特征分析[J].浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報，2016，28(5): 743-747.