龔利洋，王才益，陳玎玎，應(yīng)志豪，黃淑芳，陳　琳，陳　彬

(杭州市虎跑路杭州動物園，浙江杭州 310008)

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杭州市區(qū)救護鳥類禽流感病原學(xué)檢測結(jié)果

龔利洋，王才益，陳玎玎，應(yīng)志豪，黃淑芳，陳琳，陳彬

(杭州市虎跑路杭州動物園，浙江杭州 310008)

摘要：為了解杭州市區(qū)救護野生鳥類禽流感病毒(AIV)的攜帶感染情況，2013 年-2015年期間，本研究對35種75只救護鳥類采集的口咽拭子樣品，采用RT-PCR 方法并用AIV通用引物M-229進行了病原學(xué)檢測，結(jié)果均為陰性。

關(guān)鍵詞：禽流感； 病原檢測；救護鳥類

禽流感(AI)是由禽流感病毒(AIV)引起的一種禽類烈性傳染病，近年來在多個國家持續(xù)發(fā)生，造成重大經(jīng)濟損失的同時也嚴重威脅著人類的健康和安全。目前普遍認為野生鳥類是禽流感病毒的重要宿主及攜帶者[1-5]。

杭州市陸生野生動物救護中心救護的鳥類多為生活于市區(qū)的野鳥，與市民有著各種接觸機會，如果攜帶有禽流感病毒，對市民和其它動物的健康和安全影響極大。筆者于2013-2015年間對杭州市區(qū)救護鳥類進行口咽拭子、肛拭子、血液樣本采集，進行禽流感病原學(xué)檢測和血清抗體檢測，現(xiàn)將其中35種75只救護鳥類的口咽拭子病原學(xué)檢測情況作一簡要介紹，供參考。

1材料與方法

1.2樣本處理在保證救護鳥類不受二次傷害的情況下，采用無菌棉簽插入鳥類咽喉部擦拭，采集后置于裝有500 μL lPBS溶液的1.5 mL離心管中，-70℃保存。

采集的口咽拭子經(jīng)充分震蕩，12000 rpm離心15 min，取上清液1.5 mL于離心管中，存入-70℃或即用。

1.3RT-PCR鑒定

1.3.1引物設(shè)計根據(jù)中華人民共和國農(nóng)業(yè)行業(yè)標準NY/T772-2013，設(shè)計禽流感病毒的通用引物(詳見表2)，送至上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成。

表1　2013-2015年杭州市區(qū)救護鳥類禽流感

表2　禽流感病毒鑒定引物表

1.3.2RNA抽提參照《WHO動物流感診斷監(jiān)測手冊》，應(yīng)用Trizol LS法直接從拭子浸出液中進行病毒總RNA提取。具體操作如下。

1.3.2.1250 μL樣本上清液加入750 μL Trizol LS Reagent,混勻,室溫靜置5 min。

2)采用預(yù)先配制NaOH 10g-50 mLH2O溶液與K3Fe(CN)610g-50 mLH2O按1：1比例混合使用，金相試樣腐蝕的時間為60 s。

1.3.2.2加入200 μL氯仿,振蕩搖勻15 s，4℃ 12000 rpm離心10 min。

1.3.2.3取上清液于另一新Rnase-free離心管中,加同體積異丙醇,搖勻,靜置10 min,12000 rpm離心10 min；棄上清,加1 mL 75%乙醇搖勻洗滌；12000 rpm離心5 min,棄上清,倒置于吸水紙上干燥5-10 min。

1.3.2.4取適量DEPC水于干燥后的離心管中搖勻溶解(必要時可55℃-60℃助溶10 min)。

1.3.3反轉(zhuǎn)錄合成cDNA

1.3.3.1取加入滅菌DEPC處理水的RNA 11 μL，加入12堿基通用引物(AGCAAAAGCAGG,12 μmol)1 μL，70℃溫浴5 min后，立即置于冰上。

1.3.3.2加入5×reaction buffer 4 μL，RNA酶抑制劑1 μL，dNTP(10 mmol/L)2 μL，37℃溫浴5 min。

1.3.3.3加入1 μL鼠源反轉(zhuǎn)錄酶，42℃溫浴1 h，然后70℃ 10 min滅活反轉(zhuǎn)錄酶。

1.3.4PCR擴增在25 μL PCR體系中加入以下試液：10×PCR buffer 2.5 μL，rTaq 0.5 μL，dNTP(10 mM)0.5 μL，滅菌雙蒸水19.5 μL，上引物(10 μM)0.5 μL，下引物(10 μM)0.5 μL，模板DNA 1 μL。PCR反應(yīng)的循環(huán)參數(shù)為：94℃ 5 min；進入循環(huán)，94℃ 45 s，52℃ 45 s，72℃ 45 s，35個循環(huán)；72℃延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后，取4.5 μL PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠進行電泳(含0.5 μg/mL EB)，根據(jù)片段大小進行結(jié)果判斷。

2結(jié)果與分析

對75只救護鳥類的口咽拭子樣本進行禽流感病原學(xué)檢測，結(jié)果均為陰性。詳見圖1。

圖1　禽流感病原檢測的RT-PCR核酸電泳圖備注：M：marker ；1、2：為其中的2個樣本；+：陽性對照；-：陰性對照

3小結(jié)與討論

3.1目前對野鳥禽流感的流行病學(xué)調(diào)查對象主要是郊區(qū)、野外環(huán)境下的鳥類[6-10]，這些鳥類與人類的接觸相對較少。而在杭州市區(qū)活動的野生鳥類與人類接觸機會較多，一旦感染流感病毒對人、畜構(gòu)成的安全威脅遠遠大于郊區(qū)鳥類。且浙江地區(qū)(包括杭州市區(qū))的野鳥禽流感流行病學(xué)調(diào)查目前還未見報道。故本文將杭州市區(qū)野生鳥類作為研究對象可以從另一方面說明目前禽流感的流行狀況，為禽流感的防控工作提供科學(xué)依據(jù)，并為救護中心的日后工作提供有效幫助。

3.2資料顯示，杭州有鳥類306 種，隸屬17 目49科[10]，本次檢測對象有鳥類35種，隸屬11目13科。雖然種類只占總數(shù)的11.4%(35/306)，但占總目數(shù)的64.7%(11/17)，說明本次研究對象在本地鳥類中有較廣泛的代表性。隼形目和鸮形目各有19只，猛禽類占研究總數(shù)的50.6%(38/75)，超過半數(shù)。這與傳統(tǒng)觀念略有出入，分析原因可能有二：一是猛禽個體相對較大，受傷或患病后易被市民發(fā)現(xiàn)；二是在市區(qū)作為猛禽主要食物的小型嚙齒類動物和小型鳥類較多，食物充沛導(dǎo)致大量猛禽移進市區(qū)。

3.3本次實驗對75例樣本進行檢測，結(jié)果均為禽流感病原陰性，這與有關(guān)文獻報道結(jié)果基本一致[9]?？赡苡腥缦略蛩拢阂皇呛贾菔袇^(qū)鳥類確實沒有感染禽流感病毒，是現(xiàn)實狀況的真實反映；二是樣本數(shù)量較少，據(jù)趙全邦等報道(2008)[7]在青海湖地區(qū)2403份樣本中才檢出10份病原陽性，檢測率僅為0.4%。

參考文獻

[1]Olsen B, Munster V J, Wallensten A, et al. Global patterns of influenza a virus in wild birds[J].Science,2006(312):384-388.

[2]Ellisa M T, Bousfieldb R B, Bissetta A L, et al. Investigation of outbreaks of highly pathogenic H5N1 avian influenza in waterfowl and wild birds in HONG KONG in late 2002[J]. Avian Pathol,2004(335):492-505.

[3]Chen H, Smith D G, Zhang S Y, et al. Avian flu: H5N1 virus outbreak in migratory waterfowl[J]. Nature,2005(436):191-192.

[4]Arzey G. The role of wild aquatic birds in the epidemiology of avian influenza in Australia[J]. Aust Vet J,2004,82(6):377-378.

[5]郭亮，柴洪亮，張?zhí)m蘭，等.野鴨源H3N8亞型禽流感病毒NS 基因的分子克隆及序列分析[J].東北林業(yè)大學(xué)學(xué)報，2009(7)：115-118.

[6]王湘予，楊文林，張彥明.青海湖地區(qū)野禽禽流感監(jiān)測與分析[J].動物醫(yī)學(xué)進展，2009，(7)：20-22.

[7]趙全邦，馬睿麟，蔡金山，等.青海湖地區(qū)野(候)鳥禽流感流行病學(xué)監(jiān)測[J].中國動物檢疫，2008,25(11)：39-40.

[8]范仲鑫，劉道新，唐小明，等.野生鳥類禽流感病毒感染情況的調(diào)查[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報，2012,34(2)：96-99.

[9]孫泉云，王天厚，劉佩紅，等.上海地區(qū)野鳥中禽流感的流行病學(xué)監(jiān)測[J]．動物醫(yī)學(xué)進展，2007，(6)：19-23.

[10]朱曦，陳勤娟，詹偉君，等. 杭州市鳥類區(qū)系研究[J].浙江林學(xué)院學(xué)報,2002，19(1)：36-47.

收稿日期：2015-12-15

作者簡介：龔利洋(1980-)，男，浙江上虞人，獸醫(yī)師，碩士，主要從事野生動物疾病防治工作。E-mail:lygong2004@aliyun.com

中圖分類號：S858.9

文獻標識碼：A

文章編號：1005-7307(2016)03-0006-003