郎 月 綜述 劉志紅 審校

·腎臟病基礎·

MicroRNA-30與腎臟損傷

郎 月 綜述 劉志紅 審校

MicroRNA(miR)是真核動物的一種內(nèi)源性單鏈核苷酸，在細胞內(nèi)起到基因表達的轉錄后調(diào)控作用。micorRNA-30家族由miR-30a～e五個成員組成，不僅在腎臟發(fā)育中起重要作用，而且參與了腎臟損傷。miR-30s通過p53、Notch1、鈣/鈣調(diào)磷酸酶通路抑制凋亡與骨架損傷，進而保護足細胞。在腎小管上皮細胞中，miR-30e可調(diào)控線粒體的功能，緩解腎間質(zhì)纖維化。臨床分子標志物研究提示，尿miR-30a-5p與原發(fā)性局灶節(jié)段腎小球硬化患者及原發(fā)性腎病綜合征患兒疾病活動性相關，并且可預測激素的治療效果。

microRNA-30 腎臟發(fā)育 足細胞損傷 間質(zhì)纖維化 分子標志物

在腎臟中，microRNA-30(miR-30)是一組具有較高表達量的miR家族，它在腎臟的發(fā)育及腎臟病的發(fā)生發(fā)展中具有重要的作用。本文基于現(xiàn)有的研究結果，總結了miR-30與腎臟發(fā)育和損傷之間的關系及其作用機制,重點闡述近年來有關miR-30與足細胞損傷及上下游調(diào)控的分子通路。同時，臨床研究也提示miR-30作為一種腎臟損傷相關分子標志物具有潛在的臨床應用價值。

miR-30家族概述

miR是一種存在于真核細胞中，長約22 nt的內(nèi)源性非編碼單鏈RNA，通過參與調(diào)解下游靶基因翻譯過程而發(fā)揮其生物學功能。在動物體內(nèi)，miR經(jīng)過Drosha酶，exportin-5蛋白及Dicer酶的加工和轉運，在胞質(zhì)中與具有RNA剪切酶活性的Argonaute共同組成RNA誘導的沉默復合體(RNA-induced silencing complex，RISC)[1]。通過miR與靶基因mRNA的3’UTR區(qū)完全或不完全互補結合，進而引起目的mRNA的降解或翻譯停止，在轉錄后水平起到抑制基因表達的作用[2]。目前已知的人類30%以上的基因受到miR的調(diào)控[3]，單個基因同時受到多種miR的調(diào)控， miR也可同時調(diào)控多種基因的表達，從而在組織或細胞中形成復雜的調(diào)控網(wǎng)絡。并且，miR在組織器官中的表達有其時間和空間的特點，參與調(diào)控器官的發(fā)育、結構與功能的維持及疾病的進展[4]。

miR-30家族由miR-30a、miR-30b、miR-30c、miR-30d及miR-30e五個成員組成(圖1)，分別由位于1、6、8三個染色體上的6個基因進行編碼。它們之間有較高的同源性，并且在細胞中有一致的表達模式。miR-30廣泛地表達于神經(jīng)元細胞、足細胞、心肌細胞、肝細胞、淋巴細胞、生殖細胞及部分腫瘤細胞[5]。以往的研究已證實，miR-30可通過調(diào)控上皮-間質(zhì)轉化(EMT)相關基因的表達[6-8]，調(diào)控胚胎的發(fā)育、腫瘤的轉移與侵襲[9]及纖維化過程[10-11]。對包含51個實體腫瘤共4 419個樣本的miR表達調(diào)控進行的研究發(fā)現(xiàn)，miR-30處于調(diào)控網(wǎng)絡的核心位置[12]。提示其在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中具有重要的作用。在腎臟中，miR-30主要表達在足細胞與腎小管上皮細胞[5,13]， 參與了腎臟的發(fā)育及腎臟損傷的過程。

圖1 成熟miR-30序列miR-30：microRNA-30;陰影部分為miR-30與靶基因3’-UTR區(qū)結合的區(qū)域

miR-30與腎臟發(fā)育

在成年小鼠的腎臟中，miR-30s的表達水平高于胚胎期[5]，提示可能與腎臟發(fā)育相關。Agrawal等[14]的研究證實，在胚胎發(fā)育后期的非洲爪蟾腎臟中，miR-30家族特異性富集。Lim1是一組同源盒基因，在腎臟發(fā)育過程中通過調(diào)節(jié)腎上皮細胞的分化促進腎管的延長和輸尿管芽的分支。miR-30在腎臟發(fā)育晚期通過關閉Lim家族轉錄因子Xlim1/Lhx1的活性，來促進前腎的終末發(fā)育形成。并且發(fā)現(xiàn)下調(diào)miR-30與敲除Dicer 或 Dgcr8最終導致前腎發(fā)生幾乎相同的損傷表型，即前腎小管數(shù)量減少與分化延遲，表明在腎臟發(fā)育的過程中，miR-30的時序性表達起到了至關重要的作用。值得注意的是，內(nèi)源性miR對基因表達的抑制作用只有30%～50%[15]，因此它的功能異常并不能改變分化的進程。

miR-30與足細胞損傷

miR-30是維持足細胞結構和功能的關鍵調(diào)控分子 為了研究miR與足細胞結構和功能之間的關系，Shi等[16]，Harvey等[17]，Jacqueline等[18]分別構建了足細胞特異性Dicer酶敲除鼠，純合子在出生后平均2～5周開始出現(xiàn)顯著的蛋白尿，并且在幾周內(nèi)進展為大量蛋白尿甚至死亡。病理形態(tài)學改變?yōu)橐幌盗械淖慵毎麚p傷表現(xiàn)，包括足細胞特異性分子的缺失，足突融合，足細胞凋亡、丟失，基膜斷裂及迅速進展的腎小球硬化，其中以synaptopodin表達下調(diào)為最早發(fā)生的改變，提示敲除miR的可能最先影響足細胞骨架的結構與穩(wěn)定。更重要的是，這種損傷是由miR功能缺失直接導致，而非蛋白尿與足突融合事件所致[17]。進一步對腎小球基因表達譜改變的分析發(fā)現(xiàn)，從mRNA水平上看，有190個基因發(fā)生了顯著上調(diào)，而應用靶基因預測軟件與轉錄組檢測結果進行結合分析提示，miR-30家族調(diào)控了其中最多的基因，說明miR-30家族在miR介導的足細胞損傷中具有重要作用。利用臨床局灶節(jié)段性腎小球硬化(FSGS)大量蛋白尿患者腎活檢病理切片進行原位雜交結果顯示，miR-30a及miR-30d在腎小球足細胞中特異性表達，并且在FSGS患者中顯著下調(diào)，提示miR-30家族在足細胞損傷中可能起到保護作用。體外驗證中，轉化生長因子β(TGF-β)刺激足細胞后引起miR-30a顯著下降，并且對其調(diào)控的靶蛋白進行了驗證，Vim、snail1、Tnrc6a等蛋白均發(fā)生了上調(diào)，其中，Tnrc6a參與組成細胞胞質(zhì)P-body元件GW182，參與mRNA的降解與翻譯抑制[19]，提示這一過程中可能存在的反饋調(diào)節(jié)機制，共同參與調(diào)控基因的表達。miR-30a在Hela 細胞中過表達也同樣會引起蛋白水平的改變，包括與腎臟功能密切相關的分子(如整合素α2)[20]。上述研究證實，miR對維持在足細胞正常功能具有重要作用，其中miR-30可能是非常重要的分子。

miR-30參與足細胞損傷的機制研究 miR-30是通過哪些下游分子機制來介導足細胞損傷的呢？體外足細胞功能的研究提示，miR-30家族可直接靶向抑制Notch1及p53信號通路的活性，從而減少足細胞凋亡[21]。在足細胞損傷過程中，會發(fā)生足細胞肌動蛋白減少與骨架的重構。功能學研究也提示，miR-30家族可維持足細胞肌動蛋白骨架的穩(wěn)定[22]。在足細胞中，鈣/鈣調(diào)磷酸酶信號通路在維持足細胞骨架正常結構與功能中起到重要作用，其中瞬時受體電位通道(TRPC6)的活化導致細胞鈣內(nèi)流增加，鈣調(diào)磷酸酶活性上調(diào)，促進了具有轉錄因子活性的活化T細胞核因子(NFAT)核轉移及Synaptopodin的裂解，導致足細胞下游基因表達的變化與骨架損傷。Wu等[23]在后續(xù)的研究中發(fā)現(xiàn)， miR-30可直接靶向下調(diào)TRPC6、Ppp3ca、Ppp3cb、Ppp3r1、NFATc3從而抑制足細胞鈣/鈣調(diào)磷酸酶通路的活化。損傷條件下，miR-30及鈣調(diào)磷酸酶抑制劑FK506均可抑制足細胞的鈣內(nèi)流，synaptopodin裂解及細胞凋亡等一系列損傷效應，維持足細胞骨架的形態(tài)與功能。同時，miR-30a也可抑制NFATc3的核轉位，間接抑制下游尿激酶型纖溶酶原激活物(uPAR)——整合素β3信號通路，在不影響蛋白水平的情況下抑制足細胞膜蛋白整合素β3的活化(圖2)[23]。

圖2 miR-30介導的足細胞損傷示意圖miR-30：microRNA-30;TGF-β：轉化生長因子β；GC：糖皮質(zhì)激素；HDAC3：組蛋白去乙酰化酶3； NCoR Complex：核受體共抑制因子復合體；NFATc3：活化T細胞核因子3；TRPC6：瞬時受體電位通道6；Calcineurin：鈣調(diào)磷酸酶

miR-30表達水平的變化受多種上游分子所調(diào)控。體外TGF-β誘導的足細胞損傷可顯著下調(diào)miR-30的表達水平[22]。Liu等[24]進一步探討其機制發(fā)現(xiàn)，TGF-β/smad2/3可通過Smad結合元件(SBE)招募組蛋白去乙酰化酶3(Histone 3 Deacetylase，HDAC3)，與NCoR形成轉錄抑制復合體，降低miR-30d啟動子的轉錄活性，從而下調(diào)miR-30d的表達。在組蛋白去乙?；敢种苿?trichostatin,TSA)或HDAC3抑制劑RGFP966的作用下，可逆轉TGF-β導致的足細胞骨架的損傷和足細胞凋亡，并且抑制下游信號通路p53及Notch1的活化。此外，在體外培養(yǎng)的血管內(nèi)皮細胞中，轉錄因子Krüppel樣因子2(Krüppel-like factor 2,KLF2)可上調(diào)miR-30的表達，從而抑制E選擇素、細胞間黏附分子ICAM、VCAM等一系列促炎因子的表達，起到抗炎作用[25]。血管緊張素Ⅱ(Ang Ⅱ)也可下調(diào)miR-30家族的表達水平[23]，這也可能是AngⅡ直接導致足細胞損傷的原因之一。嘌呤霉素大鼠及體外足細胞損傷模型均已證實，糖皮質(zhì)激素可維持miR-30的表達水平，并且，miR-30參與到糖皮質(zhì)激素對足細胞的保護作用中[22]。應用生物信息學的方法，使用預測軟件miRanda、TargetScan 及PicTar對miR-30a作用的靶基因進行分析，結果提示miR-30均被預測可以靶向作用于糖皮質(zhì)激素受體。綜上可推測糖皮質(zhì)激素受體與miR-30之間可能存在相互調(diào)控關系，其機制有待進一步實驗證實。

miR-30與小管-間質(zhì)損傷

除足細胞外，在腎臟中miR-30也表達于近端小管上皮細胞中，并且參與了腎纖維化的過程。線粒體解偶聯(lián)蛋白2(UCP2)是一種表達于線粒體內(nèi)膜上的陰離子轉運體。miR-30e可直接靶向作用于UCP2，在小鼠UUO模型及體外TGF-β1腎小管上皮細胞損傷過程中，miR-30e表達的減少直接上調(diào)UCP2，從而導致細胞外基質(zhì)的增多與腎臟纖維化的發(fā)生[26]。這一研究結果也提示，除足細胞外，miR-30在腎小管上皮細胞中也具有保護作用。在順鉑誘導的近端腎小管上皮損傷中，miR-30e的水平發(fā)生了顯著的下調(diào)，過表達miR-30e可減少細胞的凋亡及線粒體的損傷[27]。同時，miR-30e也可直接調(diào)控snail1基因，影響TGF-β1引起的腎小管EMT(未發(fā)表資料)。Gutiérrez-Escolano等[28]對造影劑腎病的分子標志物進行研究。通過碘苯六醇誘導大鼠產(chǎn)生造影劑腎病，并且對血漿及腎組織進行芯片分析，結果提示miR-30a、miR-30c及miR-30e均發(fā)生了顯著上調(diào)。

miR-30作為腎臟損傷臨床分子標志物的研究

FSGS是一種以足細胞損傷、足突融合、蛋白尿為主要特征的一組臨床病理綜合征[29]。Zhang等[30]對活動期及治療后完全緩解的FSGS患者尿液中分子標志物的研究提示，miR-30a-5p不僅在FSGS患者的尿液中上調(diào)，并且，激素治療敏感的患者在接受治療8周后顯著下降。提示尿液miR-30水平與FSGS疾病活動狀態(tài)相關。更重要的是，miR-30a-5p基線水平在預測FSGS的治療反應上具有較高的敏感度和特異度(67.6%，56.3%)。此外，miR-30a-5p在膜性腎病及糖尿病腎病中也發(fā)生了上調(diào)，但是不能預測激素治療的效果。上述結果表明，miR-30可能是一種損傷相關的分子標志物，并且可以預測激素的治療效果。在損傷狀態(tài)下，miR-30可能通過細胞壞死增加被動釋放進入循環(huán)和尿液中，也可能是以細胞外囊泡(EV)的形式，在損傷刺激下細胞主動分泌EV的數(shù)量增多，其具體的機制有待進一步探索。在另一項研究中，針對微小病變腎病患兒的尿液分子標志物研究中發(fā)現(xiàn)，miR-30a-5p在尿液與血液中均發(fā)生了顯著的上調(diào)[31]。此外，miR-30e-5p在糖尿病患者的血清中發(fā)生上調(diào)[33]。 在腎衰竭患者透析前后，血漿miR-30a的水平與血清肌酐及尿素氮有顯著的相關性，提示其可以作為腎衰竭患者評價透析效果的潛在臨床指標[33]。

小結:miR-30在腎臟中具有較高的表達量,時序性表達可促進腎臟的發(fā)育。在成熟腎臟中，miR-30與足細胞正常的結構和功能維持密切相關。損傷因素可通過下調(diào)足細胞miR-30的水平從而導致足細胞骨架的損傷與細胞凋亡。同時，miR-30也參與了小管-間質(zhì)損傷的過程。臨床研究也提示，miR-30可作為腎臟損傷相關的分子標志物，并與激素的療效相關。

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(本文編輯 青 松 加 則 律 舟)

MicroRNA-30 and kidney injury

LANG Yue，LIU Zhihong

National Clinical Research Center of Kidney diseases,Jinling Hospital,Nanjing University School of Medicine,Nanjing 210016,China

MicroRNA(miR) is a kind of endogenous single strand RNA, which post-transcriptionally regulates gene expression in eukaryocyte. MiR-30 family consists of 5 members, miR-30a through miR-30e. Previous studies revealed that miR-30 played an important role in kidney development as well as renal injury. Mechanism study demonstrated that they could protect podocyte by reducing apoptosis and cytoskeleton damage via inhibiting p53,Notch1 and calcium/calcineurin pathways. Meanwhile, miR-30e ameliorated interstitial fibrosis through regulating mitochondrial function in tubular epithelial cells. Clinical studies also suggested that urine miR-30a-5p could serve as a biomarker of adult FSGS and primary nephrotic syndrome in children, which was correlated with activity of disease and therapeutic effect of glucocorticoids.

microRNA-30 renal development podocyte injury interstitial fibrosis biomarker

10.3969/cndt.j.issn.1006-298X.2016.06.011

國家重點研發(fā)計劃項目(2016YFC0904100)，江蘇省創(chuàng)新能力建設專項(BM2015004)

南京軍區(qū)南京總醫(yī)院腎臟科 國家腎臟疾病臨床醫(yī)學研究中心 全軍腎臟病研究所(南京，210016)

2016-09-03