張昌明 梁少姍 成水芹 王 霞 曾彩虹 鄭春霞 劉志紅

·論 著·

尿液microRNA-196a與腎臟疾病患者遠期預后的關系

張昌明*梁少姍*成水芹 王 霞 曾彩虹 鄭春霞 劉志紅

目的：探討尿液microRNA-196a(miR-196a)能否作為預測局灶節(jié)段性腎小球硬化(FSGS)遠期預后的生物標志物。 方法：收集FSGS患者和正常對照的尿液和血漿標本，分析尿液和血漿miR-196a水平與FSGS活動性的關系。入選231例經腎活檢確診的FSGS，qRT-PCR方法檢測尿液miR-196a水平，評估尿液miR-196a對FSGS預后的預測價值。 結果：尿液miR-196a水平在活動性FSGS患者組顯著高于腎臟疾病完全緩解組和正常對照組(P<0.001)，血漿miR-196a水平在三組之間無明顯差異，表明尿液miR-196a是一種主要來源于腎臟的生物標志物。231例隨訪患者中，43例進展為終末期腎病(ESRD)。發(fā)生ESRD的患者尿液miR-196a水平顯著高于未發(fā)生ESRD的患者(P=0.025)。尿液miR-196a水平與蛋白尿和估算的腎小球濾過率(eGFR)相關，與腎間質纖維化評分存在相關性。隨著尿液miR-196a水平增加，患者發(fā)生ESRD的風險增加。校正年齡、性別、蛋白尿、eGFR后尿液miR-196a升高仍是患者進展至ESRD的獨立危險因素。 結論：尿液miR-196a是FSGS患者發(fā)生ESRD的獨立危險因素，可能成為預測FSGS遠期預后的新型生物標志物。

局灶節(jié)段性腎小球硬化 尿液microRNA-196a 遠期預后

慢性腎臟病(CKD)已成為全球性的公共衛(wèi)生問題，發(fā)病率逐年增加[1-3]，其終末期腎病(ESRD)、心血管疾病(CVD)和死亡風險增加[4]。腎間質纖維化是CKD發(fā)展至ERSD的共同通路，與CKD進展及預后密切相關[5-8]。腎間質纖維化的評估需要腎穿刺活檢才能完成，動態(tài)觀察腎間質纖維化變化則需要重復腎活檢。但腎活檢有一定的創(chuàng)傷性，重復活檢患者難以接受，因此需要積極尋找無創(chuàng)的生物標志物來評估腎間質纖維化，幫助判斷CKD預后。

microRNA(miR)是一組由19～24個堿基組成的小分子非編碼RNA，通過與靶基因3’-非翻譯區(qū)結合從而抑制靶基因翻譯或使靶基因降解，參與多種病理生理過程[9]。miR-196a在腎臟表達非常豐富[10-11]，占小鼠各組織器官miR-196a表達總量的74.4%[11]。單側輸尿管梗阻(UUO)小鼠模型中miR-196a表達顯著下降，外源性補充miR-196a可通過抑制轉化生長因子β/Smad(TGF-β-Smad)信號通路而阻止腎間質纖維化，表明miR-196a在腎間質纖維化發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用[11]。我們既往研究也發(fā)現尿液miR-196a在活動性局灶節(jié)段性腎小球硬化(FSGS)患者較正常對照顯著升高，可用于判斷FSGS疾病活動性[12]?；谝陨涎芯勘尘?，我們推測尿液miR-196a水平與FSGS患者腎間質纖維化及遠期預后相關。因此本文旨在探討尿液miR-196a能否作為預測FSGS預后的生物標志物。

對象和方法

病例選擇 入選標準：年齡16～65歲，性別不限，經腎活檢明確診斷為特發(fā)性FSGS?；顒有訤SGS定義為尿蛋白定量>3.5 g/24h，且血清白蛋白(Alb)<30 g/L；腎臟病完全緩解定義為尿蛋白定量<0.4 g/24h，Alb≥35 g/L，血清肌酐(SCr)≤109.6 μmol/L。排除有明確繼發(fā)因素(感染、藥物、代謝、腫瘤等)、有明確腎臟病家族史的患者。同時選取年齡、性別匹配的正常志愿者作為正常對照。

臨床及實驗室指標 收集所有入組患者年齡、性別、血壓、24h尿蛋白定量、Alb、SCr、總膽固醇、估算的腎小球濾過率(eGFR)采用CKD-EPI公式計算[13]。

腎臟組織病理改變評分 所有腎活檢標本均進行光鏡(包括HE、PAS、PASM-Masson及Masson三色)、免疫熒光、電鏡檢查。評估腎間質纖維化時采用Masson三色染色切片，借助數字化圖像掃描系統(tǒng)(Aperio ScanScope system)掃描全片，采用Aperio Imagescope軟件分析腎間質纖維化的百分比。腎間質纖維化百分比=皮質區(qū)Masson綠染面積/皮質區(qū)總面積(去除腎小球面積)×100%。所有標本均由不知曉臨床結果的病理醫(yī)生進行評分。

觀察終點 ESRD復合終點包括eGFR<15 ml/(min·1.73m2)或開始腎臟替代治療或腎移植或3年eGFR下降≥40%[14]。

RNA提取及miR-196a檢測 所有尿液上清、血漿標本均來自國家腎臟疾病臨床醫(yī)學研究中心生物標本庫。每例取300 μl尿液上清、100 μl血漿，采用Trizol LS根據廠商提供的標準操作流程提取總RNA。miR-196a水平采用qRT-PCR方法檢測[12,15]。10 μl逆轉錄體系包括：5×逆轉錄緩沖液(Takara)2 μl，AMV逆轉錄酶(Takara)0.5 μl，dNTPs(Takara，10 mmol/L)1 μl，莖環(huán)逆轉錄引物(Applied Biosystems)1 μl，RNA 2 μl，DEPC水3.5 μl。反應條件為：16℃，30 min，42℃，30 min，85℃，5 min。所得到的cDNA于-20℃保存?zhèn)溆谩?0 μl定量PCR體系包括：10×PCR緩沖液(Takara)2 μl，dNTPs(Takara，10 mmol/L)0.4 μl，MgCl2(Takara，25 mmol/L)1.2 μl，Taq酶(Takara)0.3 μl，TaqMan探針(Applied Biosystems)0.33 μl，水14.77 μl，cDNA 1 μl。反應條件為：95℃，5 min，然后95℃，15s，60℃，1 min進行40個循環(huán)。所有的PCR反應均行3復孔。

統(tǒng)計學分析 利用SPSS 18.0或R軟件包對相關數據進行統(tǒng)計學分析。計量資料以均數±標準差表示，組間比較采用t檢驗或One-way Anova檢驗；計數資料用百分率表示，組間比較采用卡方檢驗。受試者工作特征(ROC)曲線分析尿液和血漿miR-196a區(qū)分FSGS疾病活動性的能力。Pearson或Spearman相關分析尿液miR-196a與臨床及病理指標間的相關性。Kaplan-Meier曲線分析尿液miR-196a水平與腎臟結局之間的關系。單因素和多因素COX回歸分析影響腎臟預后的相關風險因素。赤池信息量準則(AIC)及一致性指數(C-index)評估各模型的預測精度。miR-196a水平先進行l(wèi)og10轉化后再行上述統(tǒng)計學分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

尿液和血漿miR-196a與FSGS疾病活動性的關系 首先選取正常對照、活動性FSGS和腎臟疾病完全緩解患者各20例(初測階段)，檢測尿液miR-196a水平。結果顯示活動性FSGS患者尿液miR-196a水平顯著高于正常對照和腎臟疾病完全緩解患者(圖1A)。然后選取正常對照、活動性FSGS和腎臟疾病完全緩解患者各80例對上述結果進行驗證(驗證階段)，仍然發(fā)現，與正常對照和腎臟疾病完全緩解患者相比，活動性FSGS患者尿液miR-196a水平顯著升高(圖1B)。ROC曲線分析顯示尿液miR-196a可以很好的區(qū)分活動性FSGS患者和正常對照(圖1C)及腎臟疾病完全緩解患者(圖1D)。與此同時檢測血漿miR-196a水平，結果顯示不論是初測階段，還是驗證階段血漿miR-196a水平在三組間均無明顯變化(圖1E、F)。血漿miR-196a不能區(qū)分活動性FSGS患者和正常對照(圖1G)及腎臟疾病完全緩解患者(圖1H)。

圖1 尿液與血漿miR-196a與疾病活動性的關系miR-196a:microRNA-196a;FSGS：局灶節(jié)段性腎小球硬化；NC：正常對照；FSGS-A：活動性FSGS患者； FSGS-CR：腎臟疾病完全緩解患者;A～D：尿液miR-196a與疾病活動性的關系；A：初測階段FSGS-A患者尿液miR-196a水平顯著高于NC和FSGS-CR患者；B：驗證階段FSGS-A患者尿液miR-196a水平顯著高于NC和FSGS-CR患者；C：尿液miR-196a能較好的區(qū)分FSGS-A患者和NC；D： 尿液miR-196a能較好的區(qū)分FSGS-A患者和FSGS-CR患者；E～H：血漿miR-196a與疾病活動性的關系；E：初測階段FSGS-A患者血漿miR-196a水平與NC和FSGS-CR患者相當；F：驗證階段FSGS-A患者血漿miR-196a水平與NC和FSGS-CR患者相當；G：血漿miR-196a不能區(qū)分FSGS-A患者和NC；H：血漿miR-196a不能區(qū)分FSGS-A患者和FSGS-CR患者

尿液miR-196a與臨床指標的相關性 231例有長期隨訪數據的FSGS患者，平均年齡為(30.72±13.11)歲，男性比例為68.4%，平均eGFR為(93.54±38.36) ml/(min·1.73m2)，平均隨訪時間為(56.3±23.5)月，有43例患者進展至ESRD。與未進展至ESRD的患者相比，進展至ESRD的患者基線eGFR水平較低(P=0.007)、尿蛋白水平升高(P=0.016)、SCr水平升高(P=0.010)、尿液miR-196a水平升高(P=0.025)(表1)。年齡、性別、高血壓、Alb、總膽固醇水平在兩組間無明顯差異。相關分析結果顯示，尿液miR-196a水平與eGFR、24h尿蛋白定量、Alb、總膽固醇顯著相關，與年齡、性別、高血壓無相關性(表2)。

尿液miR-196a與腎間質纖維化的關系 為了探討尿液miR-196a水平與腎間質纖維化的相關性，我們使用數字化圖像掃描系統(tǒng)計算了每例患者的腎間質纖維化百分比。Pearson相關分析結果顯示，尿液miR-196a水平與腎間質纖維化百分比顯著正相關(圖2)，與腎小球節(jié)段硬化、腎小球球性硬化無相關性(r=-0.099和0.069，P=0.135和0.299)。

表1 231例隨訪研究患者的基線臨床和病理資料

eGFR：估算的腎小球濾過率;ESRD:終末期腎?。籱iRNA-196a:microRNA-196a

表2 尿液miRNA-196a與臨床指標相關性

eGFR：估算的腎小球濾過率；miRNA-196a:microRNA-196a

圖2 尿液microRNA-196a水平與腎間質纖維化正相關

尿液miR-196a對FSGS患者腎臟遠期預后的預測 以正常對照組尿液miR-196a水平的95%分位數上限(2.67)為參考值，將FSGS患者分為兩組：尿液miR-196a水平升高組(尿液miR-196a>2.67)和尿液miR-196a水平正常組(尿液miR-196a<2.67)。尿液miR-196a水平升高組，5年和10年累積腎存活率分別為77.5%和73.0%。尿液miR-196a水平正常組，5年和10年累積腎存活率分別為90.0%和89.2%。Kaplan-Meier生存曲線顯示，尿液miR-196a水平升高組患者ESRD累積發(fā)生率增加(圖3)。

圖3 Kaplan-Meier曲線分析不同尿液microRNA-196a水平的腎存活率

單因素COX回歸分析顯示，尿液miR-196a水平升高組較尿液miR-196a水平正常組ESRD發(fā)生風險增加，HR=2.43(95%CI 1.27～4.66；P=0.008)。校正年齡、性別、尿蛋白、eGFR等影響因素后，尿液miR-196a水平升高仍然是ESRD發(fā)生風險增加的獨立危險因素(表3)。

表3 尿液miR-196a預測ESRD的單因素及多因素COX回歸分析

HR95%CIP值單因素COX模型尿液miR-196a(log10轉化)1.611.01～2.570.045尿液miR-196a分組2.431.27～4.660.008多因素COX模型*尿液miR-196a(log10轉化)1.590.96～2.640.074尿液miR-196a分組2.111.09～4.070.027

miR-196a：microRNA-196a; ESRD:終末期腎??；eGFR：估算的腎小球濾過率；*：對年齡、性別、eGFR和蛋白尿進行校正

以eGFR和蛋白尿為預測因子(校正年齡、性別)，構建FSGS預后的基礎預測模型(模型1，M1)，再以eGFR、蛋白尿和尿液miR-196a分組為預測因子(校正年齡、性別)，構建FSGS預后的新模型(模型2，M2)。計算兩個模型的AIC和C-index值，結果顯示：與M1相比，加入尿液miR-196a分組的模型M2的AIC從433降至429，C-index從0.65提高到0.68(P=0.021)，表明加入尿液miR-196a分組后的新模型對FSGS預后的預測精度優(yōu)于基礎預測模型。

討 論

本研究發(fā)現，尿液miR-196a是一種腎臟來源的生物標志物，其表達水平與腎間質纖維化程度相關，可以幫助預測FSGS遠期預后，拓寬了體液miRNAs檢測在腎臟疾病領域的潛在應用價值。

本研究通過分析尿液miR-196a水平與FSGS患者遠期預后的關系，發(fā)現FSGS患者尿液miR-196a水平與腎間質纖維化、基線eGFR和蛋白尿相關，尿液miR-196a水平升高的患者ESRD累積發(fā)生率增加，校正年齡、性別、eGFR和蛋白尿等影響因素后尿液miR-196a升高仍是ESRD發(fā)生風險增加的獨立危險因素，為臨床醫(yī)師判斷患者的遠期預后提供了一種新的、無創(chuàng)的生物標志物。這組患者經腎活檢明確診斷、隨訪時間長(未進展至ESRD的患者至少隨訪3年)、臨床資料完整，能較好的保證研究結果的可靠性。

尿液miR-196a可能源于血液中miR-196a的超負荷或者損傷的腎臟組織。為了探尋這一問題，我們同時檢測了FSGS患者與正常對照尿液和血漿miR-196a水平，發(fā)現活動性FSGS患者尿液miR-196a較完全緩解患者和正常對照顯著升高，與疾病活動性相關。但是，無論是活動性FSGS患者，還是腎臟病完全緩解患者，血漿miR-196a水平較正常對照均無升高，血漿miR-196a水平與FSGS疾病活動性沒有相關性。這一結果表明尿液miR-196a水平的升高并非由于血液中miR-196a的超負荷，而很可能源自于損傷的腎臟。

miR-196a在細胞生物合成、代謝調控過程中發(fā)揮重要作用。如研究發(fā)現miR-196a可通過調控細胞外基質成分I型膠原的表達參與硬皮病的發(fā)生[16-17]，Kashiyama 等[18]發(fā)現miR-196a可同時調控細胞外基質成分Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原的表達參與瘢痕疙瘩的形成。細胞外基質也是腎組織的重要組成成分，miR-196a也可通過對腎臟基質的調節(jié)而參與腎臟疾病如腎臟纖維化的發(fā)生發(fā)展，如Meng等[11]發(fā)現正常腎臟中miR-196a表達豐富，占各臟器miR-196a總量的74.4%。UUO誘導的纖維化小鼠模型中miR-196a表達下調，通過上調靶基因TGF-β受體2(TGF-βR2)表達，激活TGF-β-Smad信號通路，促進Ⅰ型膠原分泌，從而參與腎臟纖維化的發(fā)生發(fā)展。本研究發(fā)現，尿液miR-196a和腎間質纖維化顯著正相關，表明尿液miR-196a可能反映了腎小管間質的病理生理變化，為其預測FSGS預后提供了分子基礎。有研究認為腎小球硬化是影響FSGS預后的危險因素之一[19]，但本文發(fā)現尿液miR-196a與腎小球硬化并無相關性。盡管腎小球中miR-196a表達也很豐富[11]，但是腎小球損傷情況下miR-196a變化情況及miR-196a在腎小球損傷中的作用尚無相關研究，FSGS患者尿液miR-196a的變化與腎小球特別是足細胞中miR-196a水平的變化是否有關還需進一步研究。FSGS患者腎小球和腎小管間質中miR-196a表達水平、其與腎臟纖維化和FSGS遠期預后的相關性等問題亦有待進一步研究。

大量研究均證實腎間質纖維化與CKD患者預后不良相關[6-8]，提示尿液miR-196a可能可以預測多種CKD患者的遠期預后。我們既往的研究也發(fā)現除了FSGS，在膜性腎病(MN)和糖尿病腎病(DN)患者尿液中亦可檢測到miR-196a的升高[12]，表明miR-196a并不是一種疾病特異的標志物，而是一種損傷相關的標志物，尿液miR-196a能否預測MN和DN的遠期預后是我們即將開展的工作。此外研究表明 TGF-β和盤狀結構域受體2(DDR2)可以抑制成纖維細胞中miR-196a的表達[16,17]，寒冷刺激或β腎上腺素可誘導白色脂肪組織前體細胞中miR-196a的表達[20]，但是腎組織及尿液miR-196a表達調控的機制尚無相關研究，進一步闡明調控miR-196a表達的機制可以為腎臟疾病的治療提供新靶點，從而改善患者遠期預后。

綜上所述，尿液miR-196a和FSGS患者腎間質纖維化顯著相關，且是ESRD發(fā)生的獨立危險因素，可能成為預測FSGS遠期預后的新型生物標志物。

(致謝：本研究使用的血漿和尿液標本來自于國家腎臟疾病臨床醫(yī)學研究中心生物樣本庫)

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(本文編輯 莫 非)

Urinary microRNA-196a as a predictor of long-term outcome in patients with kidney disease

ZHANG Changming*,LIANG Shaoshan*,CHENG Shuiqin,WANG Xia,ZENG Caihong,ZHENG Chunxia,LIU Zhihong

National Clinical Research Center of Kidney Diseases,Jinling Hospital,Nanjing University School of Medicine,Nanjing 210016,China

*ZHANG Changming and LIANG Shaoshan are considered to be first authors

LIU Zhihong(E-mail:liuzhihong@nju.edu.cn)

Objective： To investigate the association between urinary microRNA-196a (miR-196a) and long-term outcome in patients with focal segmental glomerulosclerosis(FSGS). Methodology：Urinary and plasma miR-196a were tested in patients with active FSGS(FSGS-A), FSGS in complete remission(FSGS-CR) and normal controls(NC). 231 FSGS patients were then enrolled at the time of renal biopsy and urinary miR-196a levels were measured by qRT-PCR. The relationship between urinary miR-196a and long-term outcome of FSGS was analyzed. Results：Urinary miR-196a levels were significantly increased in FSGS-A patients as compared with FSGS-CR patients and NCs(P<0.001). However, plasma miR-196a levels showed no difference among the three groups, suggesting that the change of urinary miR-196a was mainly kidney derived. Of the 231 patients, 43 patients developed end-stage renal disease(ESRD) during the follow-up period. Urinary miR-196a levels were significantly higher in patients who progressed to ESRD than those not progressed to ESRD(P=0.025). Urinary miR-196a was associated with proteinuria, eGFR, and interstitial fibrosis. Patients with higher urinary miR-196a levels had a higher cumulative incidence of ESRD. Risk persisted after adjusting for age, sex, proteinuria, and eGFR. Conclusion：Urinary miR-196a is an independent risk factor of ESRD, facilitating early identification of those who will subsequently develop ESRD.

focal segmental glomerulosclerosis urinary miR-196a long-term renal survival

10.3969/cndt.j.issn.1006-298X.2016.06.001

國家重點研發(fā)計劃項目(2016YFC0904100)，國家科技支撐計劃課題(2015BAI12B05)，第一批國家臨床重點?？祈椖?2014ZDZK001)，江蘇省創(chuàng)新能力建設專項(BM2015004)，國家自然科學基金(81570644),南京軍區(qū)南京總醫(yī)院院管課題(2014003)

南京軍區(qū)南京總醫(yī)院腎臟科 國家腎臟疾病臨床醫(yī)學研究中心 全軍腎臟病研究所(南京，210016),*張昌明和梁少姍為共同第一作者

劉志紅(E-mail:liuzhihong@nju.edu.cn)

2016-10-27

? 2016年版權歸《腎臟病與透析腎移植雜志》編輯部所有