張文進,劉月平,李云濤,吳雅軒,耿翠芝△

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乳腺癌17號染色體異倍體對HER-2表達的影響及臨床病理學意義

張文進1,劉月平2,李云濤1,吳雅軒1,耿翠芝1△

[摘要]目的探討乳腺癌17染色體異倍體(多體、單體)對人表皮生長因子受體-2(HER-2)表達的影響及其臨床病理學意義。方法收集2013年1～12月，同時采用免疫組化(IHC)和熒光原位雜交(FISH)技術檢測HER-2表達狀態(tài)的乳腺浸潤癌病例，共352例。根據(jù)17號染色體多體、單體及HER-2的表達情況分組，對各組患者的臨床病理特征進行比較分析。結果17號染色體多體、單體與HER-2蛋白表達無相關性(P>0.05)；17號染色體多體與HER-2基因擴增呈負相關(r=-0.162，P=0.001);17號染色體單體與HER-2基因擴增呈正相關(r=0.282，P=0.000)。17號染色體多體組與HER-2陰性組比較，組織學分級，脈管瘤栓差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。17號染色體多體組與HER-2陽性組比較，組織學分級，脈管瘤栓，Ki-67表達，ER、PR陽性表達差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。17號染色體單體組與HER-2陰性組比較，PR陽性表達差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。17號染色體單體組與HER-2陽性組比較，腫瘤大小差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。17號染色體多體組與17號染色體單體組比較，脈管瘤栓，PR陽性表達差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結論17號染色體多體、單體與HER-2的蛋白表達無相關性，而與HER-2基因擴增有相關性。17號染色體多體組具有獨特的臨床病理特點，可能提示乳腺癌的預后。

[關鍵詞]乳腺腫瘤；人表皮生長因子受體-2；17號染色體多體；17號染色體單體

人表皮生長因子受體-2(HER-2)基因是與乳腺癌相關的重要癌基因。研究表明，30%的浸潤性乳腺癌具有HER-2基因的擴增或過表達，HER-2的擴增或過表達與乳腺癌預后不良相關[1]。因此準確判斷HER-2的狀態(tài)對乳腺癌的治療及判斷預后有重要意義。異倍體的出現(xiàn)是否影響HER-2的狀態(tài)及乳腺癌的臨床病理特性，目前有截然不同的結論[2-3]。本研究應用免疫組化(IHC)和熒光原位雜交(FISH)技術檢測HER-2狀態(tài)，結合其他臨床病理參數(shù)，分析17號染色體異倍體(多體、單體)在乳腺癌中的臨床病理學意義。

1材料與方法

1.1材料收集2013年1～12月本院乳腺中心就診的352例原發(fā)性乳腺浸潤癌患者的臨床病理資料，所有乳腺癌組織標本均同時行IHC和FISH檢測HER-2的表達?；颊呔鶠榕?，年齡22～83歲，中位年齡51歲。均行手術治療(改良根治術，保乳術，切除+前哨淋巴結活檢術)，術前未行化療、放療及內(nèi)分泌治療，術后病理證實為乳腺浸潤癌。其中浸潤性導管癌289例，浸潤性小葉癌14例，浸潤性導管-小葉混合性癌19例，黏液腺癌3例，髓樣癌2例，其他類型(乳頭狀癌、內(nèi)分泌癌、篩狀癌等)25例。

1.2主要試劑酸性亞硫酸鈉為美國Simga產(chǎn)品，蛋白酶K為美國羅氏產(chǎn)品，GLP HER-2/CSP17探針購于北京金菩嘉公司。鼠抗人單克隆抗體、IHC試劑購于福州邁新生物公司。所有標記均設陽性對照并用PBS緩沖液代替一抗做陰性對照。

1.3方法

1.3.1組織標本處理手術切除后的組織標本立即用10%的中性緩沖甲醛液固定，根據(jù)組織大小固定時間為6～48 h。石蠟包埋后的標本制成厚度為4～5 μm的切片保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2IHC法檢測HER-2蛋白表達4 μm厚的石蠟包埋組織切片經(jīng)常規(guī)二甲苯脫蠟和梯度乙醇脫水，放入檸檬酸溶液緩沖液(10 mmol/L，pH6.1)置微波爐內(nèi)(95 ℃，15 min)行抗原修復。采用SP染色法將切片孵育鼠抗人HER-2一抗置4 ℃冰箱過夜，生物素標記二抗室溫孵育30 min，PBS緩沖液沖洗后滴加辣根酶標記的鏈酶卵白素孵育30 min，DAB-H2O2顯色劑顯色，蘇木素復染并用中性樹膠封片后觀察結果。同時設立陰性對照、陽性對照保證質(zhì)控。結果判讀依據(jù)2013年美國臨床腫瘤學會/美國病理醫(yī)師學院(ASCO/CAP)聯(lián)合發(fā)布的乳腺癌HER-2檢測指南[4]所定的HER-2評分標準，HER-2陽性表達顯示棕黃色均勻細顆粒位于細胞膜，根據(jù)陽性細胞比例和著色程度分為4級(只評價腫瘤浸潤區(qū)，細胞質(zhì)的染色被認為是非特異染色，原位癌區(qū)未被評價)。0：無染色或小于10%的腫瘤細胞有細胞膜染色；+：超過10%的腫瘤呈微弱或不完整的細胞膜著色；++：超過10%的腫瘤細胞呈現(xiàn)弱至中度的完整細胞膜著色或小于30%的腫瘤細胞呈現(xiàn)強的完整的胞膜著色；+++：超過30%的浸潤性癌細胞胞膜成全周的強著色。

1.3.3FISH檢測HER-2基因擴增將4 μm厚的甲醛固定石蠟包埋切片根據(jù)標準的預處理程序進行處理，切片經(jīng)二甲苯脫蠟后依次浸入100%、80%、70%乙醇各脫水10 min，50 ℃下用30%[W/V]酸性亞硫酸鈉處理組織切片20～30 min，2×SSC溶液中漂洗5 min。將組織切片浸泡在蛋白酶K工作液(200 μg/mL)中，37 ℃孵育20～30 min，將玻片置于73 ℃～78 ℃的變性液中浸泡5 min，依次置于70%、80%和100%乙醇中梯度脫水，置于45 ℃～50 ℃烤片機上預熱3～5 min后與探針雜交，將10 μL探針混合物滴于玻片雜交區(qū)域，立即加蓋蓋玻片封片，置于濕盒中。運用GLPHER-2(17q11.2-q12)/CSP17探針(北京金菩嘉科技有限公司)標記HER-2和17號染色體中心粒。42 ℃保溫箱雜交過夜后，滴加15 μL 4,6-二脒-2-苯基吲哚(DAPI)復染劑，暗處放置10～20 min后，熒光顯微鏡(BX51，日本Olympus公司，×1 000倍)下觀察雜交區(qū)基因擴增情況。對照試驗：已知HER-2基因表達為陽性的乳腺癌標本作為陽性對照；以同一切片中正常乳腺組織作自身對照。結果判讀：試劑盒中有兩種DNA探針，一種是標記為綠色熒光的17號染色體著絲粒(CSP17)；另一種是標記為紅色熒光的HER-2基因(HER-2/neu)，而細胞核由DAPI染成藍色。選擇腫瘤細胞區(qū)隨機統(tǒng)計30個細胞核的紅色和綠色信號，每張切片選取不同的2個區(qū)域，每個區(qū)域隨機選擇3次并計算平均值，分別計算Ratio值(Ratio=30個細胞核中紅色信號總數(shù)/30個細胞核中綠色信號總數(shù))。依據(jù)2013年ASCO/CAP聯(lián)合發(fā)布的乳腺癌HER-2檢測指南[4],信號連接成簇視為基因擴增；信號呈點狀Ratio≥2或HER-2基因拷貝數(shù)大于或等于6為陽性結果，提示樣本中HER-2基因擴增；Ratio<2為陰性結果；Ratio<2且HER-2基因拷貝數(shù)大于或等于4和小于6可以選擇增加計數(shù)細胞至100個，或重做FISH檢測，并根據(jù)以上標準來判斷最終結果。本研究將每個細胞CEP17的信號數(shù)大于或等于3視為多倍體(PS17)。每個細胞CEP≤1.25屬于17號染色體單體。

1.4統(tǒng)計學處理采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學處理，結果比較用χ2檢驗及Kappa一致性檢驗，參數(shù)間相關性采用Spearman相關分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2結果

2.117號染色體多體、單體對HER-2狀態(tài)的影響本組352例患者中，IHC+7例(2.0%)(圖1A),IHC++305例(86.6%)(圖1B、1C),IHC+++40例(11.4%)(圖1D)。FISH陽性97例(27.6%)(圖2A)，F(xiàn)ISH陰性255例(72.4%)(圖2B)。存在17號染色體多體者49例(13.9%)，其中單純17號染色多體46例(圖3A)，伴HER-2基因擴增者3例。17號染色體單體12例(3.4%)為單體(圖3B)，均伴HER-2基因擴增。17號染色體多體、單體都分布在IHC++、IHC+++組。17號染色體多體與HER-2蛋白表達無相關性(r=-0.074，P=0.137)。17號染色體單體與HER-2蛋白表達無相關性(r=0.078，P=0.136)。17號染色體多體在FISH陰性組比例為18%，明顯高于FISH陽性組的3.1%，17號染色多體與HER-2基因擴增呈負相關(r=-0.162，P=0.001)。17號染色體單體在FISH陽性組比例為12.4%，明顯高于FISH陰性組(0%)，17號染色單體與HER-2基因擴增呈正相關(r=0.282，P=0.000)，見表1。

表1　17號染色體多體、單體、二倍體患者的HER-2狀態(tài)分布情況[n(%)]

*：不存在異倍體情況的患者。

2.217號染色體多體組與HER-2陰性及HER-2陽性組臨床病理特征關系本研究中17號染色體多體患者46例(排除伴HER-2擴增的3例)，不存在異倍體的患者291例，其中HER-2陰性209例，HER-2陽性82例。17號染色體多體組組織學分級Ⅲ級者占39.1%，明顯高于HER-2陰性組的21.1%，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=5.279，P=0.022)；17號染色體多體組有脈管瘤栓者為69.6%，明顯高于明顯高于HER-2陰性組的34.9%，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=18.674，P=0.000)。17號染色體多體組組織學分級Ⅲ級者占39.1%，明顯低于HER-2陽性組的52.5%，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=5.845，P=0.016)；17號染色體多體組Ki-67>40%者占13.1%,明顯低于HER-2陽性組的34.2%，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=9.797，P=0.007)；17號染色體多體組ER、PR陽性率為91.3%、82.6%，明顯高于HER-2陽性組的72.0%和57.3%，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=6.631，P=0.010；χ2=8.450，P=0.004)；但是17號染色體多體組有脈管瘤栓者為69.6%,明顯高于HER-2陽性組的45.1%，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=7.086，P=0.008)，見表2。

A:IHC+;B:IHC++/FISH-;C:IHC++/FISH +;D:IHC+++。

圖1病理切片

A：FISH陽性；B：FISH陰性。

圖2HER-2熒光原位雜交圖像

A：多體；B：單體。

圖317號染色體圖像

表2　17號染色體多體、HER-2陰性和HER-2陽性各組相關臨床病理參數(shù)的比較[n(%)]

續(xù)表2　17號染色體多體、HER-2陰性和HER-2陽性各組相關臨床病理參數(shù)的比較[n(%)]

a：17號染色體多體組與HER-2陰性組比較；b：17號染色體多體組與HER-2陽性組比較；*：僅導管癌有組織學分級。

2.317號染色體單體組和HER-2陰性及HER-2陽性組臨床病理特征的關系本研究中存在17號染色體單體患者12例，均伴HER-2基因擴增。17號染色體單體組的PR陽性率為50.0%，明顯低于HER-2陰性組的81.3%，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=6.874，P=0.009)。17號染色體單體組腫瘤直徑大于2 cm的占16.7%，明顯小于HER-2陽性組的56.1%，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=6.513，P=0.011)，見表3。

2.417號染色體多體組與單體組臨床病理參數(shù)比較17號染色體多體組有脈管瘤栓的占69.6%，明顯高于17號染色體單體組的25.0%，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=7.899，P=0.005)。17號染色體多體組的PR陽性率為82.6%，明顯高于17號染色體單體組的50.0%，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=5.527，P=0.019)，見表4。

表3　17號染色體單體、HER-2陰性和HER-2陽性各組相關臨床病理參數(shù)的比較[n(%)]

a：17號染色體單體組與HER-2陰性組比較；b：17號染色體單體組與HER-2陽性組比較；*：僅導管癌有組織學分級。

表4　17號染色體多體與單體相關臨床病理參數(shù)的比較

續(xù)表4　17號染色體多體與單體相關臨床病理參數(shù)的比較

*：僅導管癌有組織學分級。

3討論

乳腺癌HER-2基因的狀態(tài)，不僅是靶向治療的指征，還有助于判斷乳腺癌患者的預后，指導化療和內(nèi)分泌治療方案的選擇。HER-2基因檢測時常出現(xiàn)17號染色體異倍體現(xiàn)象，這種遺傳學改變是否與HER-2的表達及乳腺癌的不良預后有關，尚沒有一致意見。研究顯示，13%～46%的浸潤性乳腺癌患者癌細胞的17號染色體為非整倍體[5-6]。本研究中17號染色體異倍體的比例為17.3%，其中17號染色體多體49例，占13.9%，17號染色體單體為12例，占3.4%。Varshney等[7]發(fā)現(xiàn)17號染色體多體的比例隨HER-2蛋白表達水平的增加而增加。而Wang等[8]認為這種遺傳學改變可能與蛋白表達無關。本研究發(fā)現(xiàn)17號染色體多體、單體都分布在IHC++、IHC+++組，17號染色體多體、單體與HER-2蛋白表達無相關性。本研究還發(fā)現(xiàn)17號染色體多體在FISH陰性組比例明顯高于FISH陽性組，17號染色多體與基因擴增呈負相關。17號染色體單體主要分布在FISH陽性組，17號染色單體與基因擴增呈正相關。進一步證明17號染色體多體可能是IHC++或IHC+++，但是FISH無擴增或低擴增的原因,17號染色體單體是IHC++,但是FISH存在擴增的原因[9-10]。

Vanden等[2]發(fā)現(xiàn)單純17號染色體多體組和HER-2陽性組相比，具有更低的腫瘤分級，更高的ER、PR陽性率，其臨床病理特征和HER-2陰性患者相似。李堅等[11]認為單純17號染色體多體患者的臨床病理特征和HER-2陰性患者基本相似，和HER-2陽性患者相比具有更低的激素受體陰性率及低Ki-67表達。本研究中17號染色體多體組與HER-2陽性組相比具有更低的腫瘤分級、更低的Ki-67表達，更高的ER、PR陽性率和高脈管瘤栓率。17號染色體多體組與HER-2陰性組相比有更高的脈管瘤栓率和組織學分級。17號染色體多體組與17號染色體單體組比較，具有更高的脈管瘤栓率及高PR陽性率。說明17號染色體多體組的臨床病理特征既不同于HER-2陽性組，又與HER-2陰性組有差別，具有獨特的生物學行為。較多脈管瘤栓的出現(xiàn)，意味著17號染色體多體組患者腫瘤細胞對血管、淋巴管的侵襲能力增強，早期發(fā)生全身的微轉(zhuǎn)移可能性大，更容易出現(xiàn)內(nèi)臟轉(zhuǎn)移和腦轉(zhuǎn)移[12]。

17號染色單體在乳腺癌中出現(xiàn)的較少，本研究中17號染色體單體占3.4%，且HER-2基因的FISH檢測均為陽性，與蔣會勇等[13]的報道一致。Risio等[14]認為17號染色單體的患者與整倍體FISH陽性患者的預后明顯不同且對靶向治療不敏感。本研究中17號染色體單體患者腫瘤直徑較HER-2陽性患者小；17號染色體單體患者比HER-2陰性患者PR陽性率低。但由于樣本量偏小，以上數(shù)據(jù)尚不能確切說明17號染色體單體患者與其他類型乳腺癌在臨床病理特征上存在明顯差異，但是否影響腫瘤發(fā)展還需要進一步的研究。

綜上所述，筆者認為17號染色體多體、單體是影響HER-2基因FISH檢測結果的重要因素。17號染色體異倍體導致乳腺癌臨床病理特征出現(xiàn)一些差異，尤其是17號染色體多體組與其他組乳腺癌差異更明顯，可能與乳腺癌治療和預后有重要關系。

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(河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院：1.外一科；2.病理科，石家莊 050035)

Impact of chromosome 17 heteroploid of breast cancer on HER-2 expression and its clinicopathologic significance

Zhang Wenjin1,Liu Yueping2,Li Yuntao1,Wu Yaxuan1,Geng Cuizhi1△

(1.First Department of Surgery;2.Department of Pathology,Fourth Hospital,Hebei Medical University,Shijiazhuang,Hebei 050035,China)

[Abstract]ObjectiveTo investigate the impact of chromosome 17 heteroploid (polysomy,haploid) of breast cancer on the expression of human epidermal growth factor receptor 2(HER-2) and its clinicopathologic significance.MethodsA total of 352 cases of invasive breast cancer were collected from January to December 2013.The expression of HER-2 was detected by simultaneously using the fluorescent insituhybridization(FISH) and mimunohistochemistry.The cases were divided into the groups according to the chromosome 17 polysomy,haploid and the expression of HER-2.The clinicopathological features were analyzed and compared among groups.ResultsThe chromosome 17 polysomy and haploid had no correlation with HER-2 protein expression(P>0.05);chromosome 17 polysomy was negatively correlated with HER-2 gene amplification(r=-0.162，P=0.001);chromosome 17 haploid was positively correlated with HER-2 gene amplification(r=0.282，P=0.000).Compared with the HER-2- negative group，the chromosome 17 polysomy group had a statistically significant difference in histological grade and vascular tumor thrombus (P<0.05).Compared with the HER-2-positive group,the chromosome 17 polysomy group had a statistically significant difference in histological grade,vascular tumor thrombus,Ki-67 expression,ER positive expression and PR positive expression (P<0.05).Compared with the HER-2- negative group,the chromosome 17 haploid group had a statistically significant difference in PR positive expression (P<0.05).The tumor diameter in the chromosome 17 haploid group had a statistically significant difference compared with the HER-2-positive group(P<0.05).Compared with the chromosome 17 haploid group,the chromosome 17 polysomy group had a statistically significant difference in vascular tumor thrombus and PR positive expression(P<0.05).ConclusionThe chromosome 17 polysomy and haploid have no correlation with the HER-2 protein expression,but associated with HER-2 gene amplification.The chromosome 17 polysomy group has unique clinicopathological features,which may indicate the prognosis in the patients with breast cancer.

[Key words]breast neoplasms;HER-2;chromosome 17 polysomy;chromosome 17 haploid

doi:論著·臨床研究10.3969/j.issn.1671-8348.2016.09.023

作者簡介：張文進(1971-),碩士，主治醫(yī)師,主要從事乳腺腫瘤方向研究?！魍ㄓ嵶髡撸珽-mail:gengcuizhi@hotmail.com。

[中圖分類號]R737.9

[文獻標識碼]A

[文章編號]1671-8348(2016)09-1228-05

(收稿日期：2015-09-22修回日期：2015-12-14)