黃厚剛，史　斌，稅春玲△

(1.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬永川醫(yī)院麻醉科，重慶 402160； 2.四川省革命傷殘軍人醫(yī)院麻醉科，成都　610501)

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藻酸雙酯鈉對(duì)脂多糖所致小鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的保護(hù)作用研究*

黃厚剛1，史斌2，稅春玲1△

(1.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬永川醫(yī)院麻醉科，重慶 402160； 2.四川省革命傷殘軍人醫(yī)院麻醉科，成都610501)

[摘要]目的研究藻酸雙酯鈉(PSS)對(duì)脂多糖(LPS)所致的小鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞(PMVEC)損傷的保護(hù)作用。方法體外培養(yǎng)PMVEC，隨機(jī)將細(xì)胞分為空白對(duì)照組(C組)、LPS刺激組(L組)、PSS+LPS組(LP組)。采用MTT法檢測(cè)PSS對(duì)LPS刺激PMVEC的細(xì)胞活力的影響，虎紅染色法測(cè)定中性粒細(xì)胞(PMN)對(duì)PMVEC黏附數(shù)量的影響，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)法檢測(cè)3組培養(yǎng)上清液中腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和細(xì)胞間黏附分子-1(ICAM-1)的濃度。結(jié)果PSS能抑制LPS所致的PMVEC細(xì)胞活力下降(P=0.001)；與C組比較，L組的PMVEC與PMN的黏附數(shù)量明顯增加(P=0.000)，TNF-α和ICAM-1的表達(dá)顯著增加(P=0.000)；與L組比較，PSS預(yù)處理1 h能顯著降低LPS所致的PMVEC與PMN的黏附(P=0.000)，LP組的TNF-α和ICAM-1表達(dá)顯著降低(P<0.05)。結(jié)論P(yáng)SS能抑制LPS對(duì)PMVEC的損傷及PMVEC與PMN的黏附，其作用機(jī)制可能與降低ICAM-1和TNF-α的表達(dá)有關(guān)。

[關(guān)鍵詞]急性肺損傷；藻酸雙酯鈉；腫瘤壞死因子-α；細(xì)胞間黏附分子-1

急性肺損傷 (acute lung iniury，ALI)是一組因肺泡毛細(xì)血管膜彌漫性損傷導(dǎo)致肺水腫和肺微不張，以呼吸窘迫和頑固性低氧血癥為主要臨床表現(xiàn)的綜合征，進(jìn)一步可發(fā)展為急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)，在臨床非常常見且十分兇險(xiǎn)。由于其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，治療效果不佳，其病死率仍然居高不下，平均病死率高達(dá)50% 以上[1]。近年來(lái)許多研究顯示，肺血管內(nèi)皮細(xì)胞在ALI/ARDS病理、生理過(guò)程中既是主要的受損靶細(xì)胞，亦是活躍的炎癥和效應(yīng)細(xì)胞，在ALI/ARDS中發(fā)揮重要作用[2]，其損傷及活化是ALI/ARDS發(fā)生、發(fā)展的重要病理基礎(chǔ)和關(guān)鍵環(huán)節(jié)，因而改善內(nèi)皮細(xì)胞損傷及調(diào)控其不當(dāng)活化對(duì)ALI/ARDS的治療和預(yù)后具有重要意義。

國(guó)內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)的抗凝藥肝素具有抑制中性粒細(xì)胞(PMN)對(duì)毛細(xì)血管內(nèi)皮的黏附、減少炎癥介質(zhì)及細(xì)胞因子的產(chǎn)生、阻止內(nèi)皮細(xì)胞活化及氧自由基和脂質(zhì)過(guò)氧化物的生成而發(fā)揮對(duì)抗氧自由基的損傷等作用，從而應(yīng)用于ALI的治療[3-5]。藻酸雙酯鈉(polysaccharide sulfate,PSS)是我國(guó)最早從海藻中提取的一種類肝素物質(zhì)，被證明具有調(diào)血脂、抗凝血、改善血流動(dòng)力學(xué)及改善微循環(huán)等作用，過(guò)去臨床上主要被應(yīng)用于缺血性心腦血管病的治療[6-7]。本實(shí)驗(yàn)采用小鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞(pulmonary microvascular endothelial cell，PMVEC)為研究對(duì)象，用細(xì)菌脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)刺激PMVEC建立炎性反應(yīng)模型，以研究PSS對(duì)LPS誘導(dǎo)PMVEC損傷的保護(hù)作用及可能的機(jī)制。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1藥物與試劑PSS純?cè)戏蹌┯汕鄭u正大海爾制藥公司饋贈(zèng)；LPS購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；內(nèi)皮細(xì)胞及培養(yǎng)液購(gòu)自武漢原生原代生物醫(yī)藥科技有限公司；虎紅和臺(tái)盼藍(lán)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；兔抗小鼠ICAM-1單克隆抗體購(gòu)自武漢博士德生物工程公司；TNF-α酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)試劑盒購(gòu)自美國(guó)R&D公司。

1.1.2儀器酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio-Rad公司)，倒置相差顯微鏡(日本Olympus公司)；Thermo Forma 3110二氧化碳培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo Scientific 公司)。

1.2方法

1.2.1MTT法檢測(cè)PMVEC的細(xì)胞活力將小鼠PMVEC接種至96孔板，每孔100 μL,采用專用培養(yǎng)液在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。實(shí)驗(yàn)分3組：空白對(duì)照組(C組)、LPS組(L組)與LPS+PSS組(LP組)。C組和L組分別加入100 μL培養(yǎng)液，LP組加入含100 μg/mL PSS的培養(yǎng)液，于培養(yǎng)箱中孵育1 h后取出培養(yǎng)板，L組和LP組加入100 μL含有1 μg/mL LPS的ECM，C組加入100 μL ECM。每組各設(shè)10個(gè)復(fù)孔。繼續(xù)孵育24 h后將培養(yǎng)液吸出，向每孔內(nèi)加入20 μL 0.5% MTT溶液及100 μL培養(yǎng)液，37 ℃孵育4 h后吸掉培養(yǎng)液，每孔中加入DMSO溶液150 μL，振蕩10 min以完全溶解結(jié)晶。最后使用酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔的490 nm吸光度值。

1.2.2PMVEC與PMN黏附實(shí)驗(yàn)各組細(xì)胞孵育24 h后吸除每孔培養(yǎng)液，立即加入PMN 200 μL，培養(yǎng)1 h后吸去上清液，用PBS清洗2遍，然后在每孔中加入100 μL 0.25%虎紅染色，室溫靜置10 min后吸除虎紅液，再用PBS清洗2遍，加入200 μL 1∶1的95%乙醇-PBS以脫色，室溫靜置1 h，最后用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔550 nm波長(zhǎng)處的吸光度值。

1.2.3PMVEC培養(yǎng)上清液中TNF-α的測(cè)定采用雙抗體夾心ELISA，按試劑盒說(shuō)明書操作步驟測(cè)定PMVEC培養(yǎng)上清液中TNF-α的含量。

1.2.4免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測(cè)細(xì)胞間黏附分子-1(ICAM-1)細(xì)胞爬片，PBS洗滌蓋玻片3×5 min，加3% H2O2室溫孵育10 min，PBS洗滌3×5 min，加山羊血清封閉，室溫靜置20 min，吸干后滴加一抗 50 μL(1∶200)，4 ℃孵育過(guò)夜，PBS充分洗滌3×5 min，然后加二抗于室溫靜置20 min，PBS充分洗滌3次，每次各5 min。使用DAB顯色，蘇木精復(fù)染，最后于乙醇脫水二甲苯透明，使用中性樹膠封片。采用 Image Proplus 5.1軟件拍照并進(jìn)行半定量分析，用蛋白陽(yáng)性表達(dá)面積(area)和積分光密度值(IOD值)兩個(gè)指標(biāo)進(jìn)行比較。

2結(jié)果

2.1PSS對(duì)LPS誘導(dǎo)PMVEC增殖的影響與C組比較，L組PMVEC經(jīng)LPS刺激24 h后，細(xì)胞活力明顯下降(P=0.000)。LP組經(jīng)過(guò)PSS預(yù)處理，與L組比較PMVEC活力升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.001)，見表1。

2.2PSS對(duì)PMVEC與PMN黏附作用的影響L組中PMVEC與PMN的黏附數(shù)量較C組顯著增加(P=0.000)，而LP組PMVEC與PMN的黏附數(shù)量較L組顯著減少(P=0.000)，見表2。

2.3PSS對(duì)LPS誘導(dǎo)PMVEC分泌TNF-α的影響ELISA結(jié)果顯示：與C組比較，LPS刺激PMVEC 24 h后，TNF-α分泌水平顯著提高(P=0.000)。與LPS組比較，PSS預(yù)處理PMVEC TNF-α分泌顯著降低(P=0.000)，見表3。

表1　PSS對(duì)LPS誘導(dǎo)PMVEC增殖的影響(n=10)

a：P<0.05，與C組比較；b：P<0.05，與L組比較；-：此項(xiàng)無(wú)數(shù)據(jù)。

表2　PSS對(duì)LPS誘導(dǎo)PMVEC與中性粒細(xì)胞黏附作用的影響

a：P<0.05，與C組比較；b：P<0.05，與L組比較。

圖1　各組PMVEC中 ICAM-1免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)結(jié)果

2.4PSS對(duì)LPS誘導(dǎo)PMVEC表達(dá)ICAM-1的影響光鏡下觀察C組PMVEC細(xì)胞質(zhì)中可見少量ICAM-1表達(dá)(圖1)。半定量分析結(jié)果顯示，L組ICAM-1 陽(yáng)性表達(dá)面積和IOD較C組均顯著增加(P=0.000)。而PSS預(yù)處理組的ICAM-1 陽(yáng)性表達(dá)面積和IOD均顯著低于L組(P=0.05、0.025)，見表3。

表3　PSS對(duì)LPS誘導(dǎo)PMVEC表達(dá)TNF-α和ICAM-1的影響

a：P<0.05，與C組比較；b：P<0.05，與L組比較。

3討論

近期研究發(fā)現(xiàn)肺血管內(nèi)皮細(xì)胞在ALI的發(fā)病機(jī)制中擔(dān)當(dāng)著重要角色。肺血管內(nèi)皮細(xì)胞在LPS等的作用下，分泌和釋放多種炎癥介質(zhì)及細(xì)胞因子，打破機(jī)體促炎和抗炎過(guò)程的平衡，引起PMN激活黏附聚集等過(guò)度炎性反應(yīng)，同時(shí)亦誘發(fā)凝血與抗凝系統(tǒng)平衡紊亂，導(dǎo)致肺微循環(huán)障礙及肺動(dòng)脈高壓，從而患者出現(xiàn)以進(jìn)行性低氧血癥和呼吸窘迫為主要表現(xiàn)的臨床癥狀[8-9]。國(guó)內(nèi)外研究報(bào)道傳統(tǒng)的抗凝藥肝素具有改善低氧血癥和減輕炎性反應(yīng)的效應(yīng)從而可用于治療ALI。此外還有報(bào)道，甘糖酯作為PSS的換代產(chǎn)品可通過(guò)增強(qiáng)尿激酶活性、激活纖溶系統(tǒng)，而表現(xiàn)出良好的抗血栓作用，且對(duì)氧化低密度脂蛋白所引發(fā)的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷亦具有修復(fù)和保護(hù)作用[10-11]。因此，筆者推測(cè)PSS具有保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞、抑制PMN與內(nèi)皮細(xì)胞黏附的功能。

本研究采用100 μg/mL濃度PSS預(yù)處理PMVEC，在1 μg/mL的LPS刺激下，PMVEC的活力明顯的減低，而PSS能部分的抑制LPS導(dǎo)致的PMVEC損傷，說(shuō)明PSS具有保護(hù)PMVEC的作用。有文獻(xiàn)報(bào)道適當(dāng)濃度的PSS能促進(jìn)體外培養(yǎng)的人類臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)[12]，與本研究結(jié)果類似。肺血管內(nèi)皮細(xì)胞是各種肺損傷因素攻擊的靶細(xì)胞，其損傷后導(dǎo)致肺血管內(nèi)皮細(xì)胞屏障功能下降，毛細(xì)血管通透性增加，從而出現(xiàn)肺水腫，呼吸困難。因此，PSS對(duì)PMVEC發(fā)揮出的保護(hù)作用提示其對(duì)ALI的治療潛力。

正常情況下，PMN和PMVEC不黏附或很少黏附[13]。當(dāng)細(xì)菌進(jìn)入體內(nèi)釋放LPS等內(nèi)毒素性物質(zhì)會(huì)激活機(jī)體炎癥細(xì)胞釋放PG、LT及TXA2等致炎因子，從而促進(jìn)PMN趨化和黏附聚集增多[14]。檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞與中性粒細(xì)胞黏附的方法目前主要有直接計(jì)數(shù)法[15]和虎紅染色法[16]。本實(shí)驗(yàn)采用的虎紅染色法具有省時(shí)、方便、重復(fù)性好的優(yōu)勢(shì)。實(shí)結(jié)果顯示LPS刺激可顯著增加PMN對(duì)PMVEC的趨化和黏附數(shù)量，而PSS處理能顯著抑制這一過(guò)程，推測(cè)其可能存在以下機(jī)制：(1)PSS具有保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞作用，促進(jìn)其損傷修復(fù)，從而降低LPS對(duì)PMVEC的炎癥激活效應(yīng)；(2)PSS系一種酸性黏多糖類陰離子聚電解質(zhì)，其分子本身帶有負(fù)電荷，故能增加PMVEC表面負(fù)電荷及細(xì)胞間靜電排斥力，從而阻礙其黏附[6]；(3)PSS可能減少炎癥因子和黏附分子的表達(dá)而發(fā)揮直接抗炎作用。本研究亦進(jìn)一步對(duì)此進(jìn)行了驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)PSS確可抑制LPS誘導(dǎo)的肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞ICAM-1和TNF-α表達(dá)。

總之，本研究證實(shí)PSS能抑制LPS對(duì)PMVEC的損傷，并能抑制LPS誘導(dǎo)的PMVEC與PMN之間的黏附，其作用機(jī)制可能與降低ICAM-1和TNF-α的表達(dá)有關(guān)，這些發(fā)現(xiàn)提示PSS應(yīng)用于治療ALI的潛力。但本研究?jī)H為體外試驗(yàn)，PSS對(duì)ALI的確切療效還有待在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步驗(yàn)證評(píng)價(jià)。

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Protective effects of polysaccharide sulfate on LPS-induced mice pulmonary microvascular endothelial cell injury*

Huang Hougang1,Shi Bing2，Shui Chunling1△

(1.Department of Anesthesiology,Affiliated Yongchuan Hospital of Chongqing Medical University, Chongqing 402160,China;2.Department of Anesthesiology,Sichuan Provincial Hospital for Disabled Revolutionary Servicemen,Chengdu,Sichuan 610501,China)

[Abstract]ObjectiveTo investigate the effects of polysaccharide sulfate (PSS) on lipopolysaccharide(LPS)-induced mice pulmonary microvascular endothelial cell(PMVEC) injury in vitro.MethodsPMVEC were divided into the blank control group (C),LPS stimulation group (L) and PSS+LPS group (LP).The effect of PSS on the viability of LPS-induced PMVEC was observed by MTT assay.The influence of polymorphonuclear(PMN) on the PMVEC adhesion number was measured by the rose Bengal staining.The concentrations of TNF-α and ICAM-1 in culture supernatant of PMVEC were detected by ELISA assay.ResultsPSS could inhibit the decrease of PMVEC viability caused by LPS(P=0.001),compared with the group C,the adhesion number of PMVEC and PMN in the group L was significantly increased(P=0.000),the expression of TNF-α and ICAM-1 was significantly increased(P=0.000);compared with the group L,PSS pretreatment for 1 h could significantly decrease the LPS caused adhesion of PMVEC and PMN(P=0.000),the expression of TNF-α and ICAM in the group LP was significantly decreased (P<0.05).ConclusionPSS can inhibit LPS-induced PMVEC injury and adhesion of PMVEC and PMN,its mechanism may be related with the decrease of ICAM-1 and TNF-α expression.

[Key words]acute lung injury；polysaccharide sulfate；tumor necrosis factor-α；intercellular adhesion molecular-1

doi:論著·基礎(chǔ)研究10.3969/j.issn.1671-8348.2016.09.005

* 基金項(xiàng)目：重慶醫(yī)科大學(xué)附屬永川醫(yī)院青年課題(YJQN201002)。

作者簡(jiǎn)介：黃厚剛(1974-)，碩士，主治醫(yī)師，主要從事急性肺損傷研究?！魍ㄓ嵶髡?，E-mail：scling@163.com。

[中圖分類號(hào)]R543

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

[文章編號(hào)]1671-8348(2016)09-1167-03

(收稿日期：2015-09-10修回日期：2015-12-06)