劉 琪，劉立業(yè)，劉金帥，李秀霞

(佳木斯大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江佳木斯 154007)

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烏克蘭龍葵毛狀根誘導(dǎo)條件優(yōu)化

劉 琪，劉立業(yè)，劉金帥，李秀霞*

(佳木斯大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江佳木斯 154007)

摘要[目的]利用3種發(fā)根農(nóng)桿菌A4、C58C1、A1476誘導(dǎo)烏克蘭龍葵產(chǎn)生毛狀根，探究烏克蘭龍葵毛狀根誘導(dǎo)的最佳條件。[方法]利用植物組織培養(yǎng)技術(shù)，研究不同外植體、菌株、侵染時間、預(yù)培養(yǎng)天數(shù)、菌液濃度和共培養(yǎng)天數(shù)等對烏克蘭龍葵毛狀根誘導(dǎo)率的影響。[結(jié)果]葉片為最佳外植體材料；3種菌株均能誘導(dǎo)出毛狀根，但A4誘導(dǎo)率最高；最佳菌液濃度為OD600=0.6；最佳侵染時間為5 min；預(yù)培養(yǎng)和共培養(yǎng)均為2 d時誘導(dǎo)率最高。 [結(jié)論]烏克蘭龍葵毛狀根誘導(dǎo)條件的優(yōu)化，為其他植物毛狀根誘導(dǎo)提供參考，同時為進(jìn)一步利用植物毛狀根生產(chǎn)藥用成分提供試驗基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞毛狀根誘導(dǎo)；龍葵；發(fā)根農(nóng)桿菌；條件優(yōu)化

龍葵(SolanumnigrumL.)為茄科茄屬一年生草本植物[1]，廣泛分布于世界溫帶和熱帶地區(qū)，在我國也遍布各地[2]。研究表明，龍葵有修復(fù)細(xì)胞正常的生理活動，抑制細(xì)胞突變，抑制腫瘤細(xì)胞的生長及增殖，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移和增強(qiáng)機(jī)體免疫的功能[3-4]。全草含茄堿(Solanine)、茄解堿(Solsonine)、澳洲茄堿(Solaonine)、澳洲茄邊堿(Solsmargine)等多種生物堿[5]。現(xiàn)代藥學(xué)研究表明，龍葵生物堿具有抗腫瘤、抗菌、抗炎、散瘀消腫、清熱解毒等藥理作用[6]。

發(fā)根農(nóng)桿菌(Agrobacteriumrhizogenes)屬根瘤菌科(Rhizobiaceae)農(nóng)桿菌屬(Agrobacterium)的一類具有侵染性的革蘭氏陰性土壤桿菌。目前，有關(guān)毛狀根的應(yīng)用絕大部分集中在應(yīng)用毛狀根系的離體培養(yǎng)來生產(chǎn)藥用植物的有效成分，如生物堿類( 蘿芙木生物堿)、萜類、甙類、試類( 人參皂試、絞股藍(lán)皂試等)等化合物[7]。在自然狀態(tài)下，發(fā)根農(nóng)桿菌通過傷口侵染植物，Ri質(zhì)粒上的一段DNA分子(T-DNA)在宿主細(xì)胞中整合表達(dá)，使植物產(chǎn)生毛狀根[8]。迄今，利用發(fā)根農(nóng)桿菌對茄科植物如澳洲茄(Solanumaviculare)和(紫脈)少花龍葵(S.photeinocarpum)的遺傳轉(zhuǎn)化所產(chǎn)生的毛狀根來產(chǎn)生澳洲茄胺或龍葵生物堿和總皂甙已有報道[9-10]，另外發(fā)現(xiàn)三葉鬼針草毛狀根可作為潛在修復(fù)污染水體中重金屬的新材料[11]。對于龍葵毛狀根的誘導(dǎo)條件鮮有報道，筆者以烏克蘭龍葵為試驗材料，利用發(fā)根農(nóng)桿菌侵染烏克蘭龍葵外植體獲得毛狀根，在此基礎(chǔ)上，研究6種不同因素對烏克蘭龍葵毛狀根誘導(dǎo)率的影響，初步優(yōu)化了烏克蘭龍葵毛狀根的誘導(dǎo)條件，為龍葵毛狀根的誘導(dǎo)提供參考。

1材料與方法

1.1試驗材料烏克蘭龍葵實生苗于佳木斯大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院植物組織培養(yǎng)室培養(yǎng)；發(fā)根農(nóng)桿菌菌株A4、C58C1、A1476由佳木斯大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院植物學(xué)研究所提供。

1.2培養(yǎng)基 菌株活化培養(yǎng)基：YEB培養(yǎng)基，pH 7.0；預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基：MS，pH 5.8；共培養(yǎng)培養(yǎng)基：MS +乙酰丁香酮(AS，200 mg/L)；除菌培養(yǎng)基：MS+頭孢噻肟鈉(400 mg/L)+羧芐青霉素(100 mg/L)，pH 5.8；毛狀根繼代培養(yǎng)基：MS，pH 5.8。

1.3試驗方法

1.3.1外植體的獲得。烏克蘭龍葵種子經(jīng)常規(guī)滅菌后，種植于滅菌蛭石中，定期澆營養(yǎng)液，待其成苗后，取其幼葉、嫩莖、葉柄作為外植體。

1.3.2菌株的活化。將發(fā)根農(nóng)桿菌A4、C58C1和A1476分別置于YEB液體培養(yǎng)基中，在28 ℃、160 r/min的搖床下振蕩培養(yǎng)24 h左右，測定OD600，用于侵染外植體。

1.3.3外植體的轉(zhuǎn)化。在烏克蘭龍葵苗上取其幼葉、嫩莖、葉柄作為外植體，經(jīng)常規(guī)滅菌后剪成邊長5～10 mm的方塊，接種于MS培養(yǎng)基，預(yù)培養(yǎng)2 d后將外植體浸入活化好的農(nóng)桿菌液中，5 min后取出，用無菌濾紙吸去表面多余菌液。將侵染好的外植體放回原MS培養(yǎng)基，共培養(yǎng)2 d后移植除菌培養(yǎng)基上進(jìn)行除菌，每隔5 d轉(zhuǎn)接一次，經(jīng)多次除菌操作培養(yǎng)直至培養(yǎng)基上無農(nóng)桿菌菌落時轉(zhuǎn)至MS培養(yǎng)基進(jìn)行繼代培養(yǎng)。

1.3.4不同試驗條件梯度設(shè)置。外植體選用幼葉、嫩莖、葉柄；3種不同種類發(fā)根農(nóng)桿菌為A4、C58C1、A1476；菌液濃度OD600設(shè)置為0.3、0.6、0.9；侵染時間設(shè)置為5、10、15 min；預(yù)培養(yǎng)時間設(shè)置為0、1、2、3、4 d；共培養(yǎng)時間設(shè)置為0、1、2、3、4 d。

1.3.5毛狀根的PCR檢測。取烏克蘭龍葵無菌毛狀根200 g，利用微量CATB法提取毛狀根DNA，純化后作為PCR的擴(kuò)增模板，以農(nóng)桿菌質(zhì)粒為陽性對照，同時以非轉(zhuǎn)化烏克蘭龍葵根的DNA為陰性對照。參考王麗等[13]發(fā)表的rolB引物：P1 5′-GCTCTTGCAGTGGCTAGATTT-3′，P2 5′-GAAGGTGCAAGCTACCTCTC-3′；rolC引物：P1 5′-CTCCTGACATCAAACTCGTC-3′，P2 5′-TGCTTCGAGTTATGGGTACA-3′。PCR反應(yīng)體系50 uL。擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。 擴(kuò)增產(chǎn)物使用0.9%的瓊脂糖凝膠電泳和EtBr 染色，在紫外成像系統(tǒng)下觀察DNA條帶并進(jìn)行拍照保存。

2結(jié)果與分析

2.1不同外植體對烏克蘭龍葵毛狀根誘導(dǎo)率的影響由表1可知，葉片的毛狀根誘導(dǎo)率最高，達(dá)46.7%；莖段次之，為23.3%；葉柄最低，為6.7%。觀察發(fā)現(xiàn)，被侵染的外植體在侵染7 d左右有少量白色多毛的根從被侵染的外植體長出，葉片誘導(dǎo)的毛狀根粗壯，密集；莖段和葉柄誘導(dǎo)的毛狀根稀疏，較細(xì)，且生根較晚(圖1)。最早生根天數(shù)無明顯差異。這表明烏克蘭龍葵不同外植體對毛狀根的誘導(dǎo)存在一定的影響。

表1不同外植體對烏克蘭龍葵毛狀根誘導(dǎo)率的影響

Table 1Effects of explants on the induction rate of hairy roots of UkraineS.nigrum

外植體類型Explantstype最早生根天數(shù)Earliestrootingdays∥d供試外植體數(shù)Numberoftestedexplants∥個生根外植體數(shù)Numberofrootingexplants∥個誘導(dǎo)率Inductionrate∥%葉片Leaf6301446.7莖段Stem830723.3葉柄Petiole83026.7

注：a.葉片；b.葉柄；c.莖段。Note: a. Leaf；b. Petiole；c. Stem induction. 圖1　不同外植體誘導(dǎo)毛狀根情況Fig.1　Situation of hairy roots of Ukraine S. nigrum induced by different explants

2.2不同發(fā)根農(nóng)桿菌對烏克蘭龍葵毛狀根誘導(dǎo)率的影響由表2可知，3種發(fā)根農(nóng)桿菌均能誘導(dǎo)出毛狀根，誘導(dǎo)率差異不大，但 A4菌株毛狀根的誘導(dǎo)率略高于其他2種菌株。A4的誘導(dǎo)率為53.3%；C58C1和A1476的誘導(dǎo)率分別為46.7%和43.3%。最早生根天數(shù)無明顯差異。觀察發(fā)現(xiàn)，A4菌株誘導(dǎo)的毛狀根較其他2種菌株誘導(dǎo)的毛狀根粗壯，密集(圖2)。這表明不同發(fā)根農(nóng)桿菌對烏克蘭龍葵毛狀根的誘導(dǎo)存在一定的影響。

表2不同發(fā)根農(nóng)桿菌對烏克蘭龍葵毛狀根誘導(dǎo)率的影響

Table 2Effects of agrobacterium rhizogenes on the induction rate of hairy roots of UkraineS.nigrum

農(nóng)桿菌類型Agrobacteriumtype最早生根天數(shù)Earliestrootingdays∥d供試外植體數(shù)Numberoftestedexplants∥個生根外植體數(shù)Numberofrootingexplants∥個誘導(dǎo)率Inductionrate∥%A46301653.3C58C16301446.7A14767301343.3

2.3不同侵染時間對烏克蘭龍葵毛狀根誘導(dǎo)率的影響由表3可知，侵染時間5 min時葉片的毛狀根誘導(dǎo)率最高，為53.3%；侵染10和15 min的葉片毛狀根誘導(dǎo)率分別為23.3%和10.0%，與侵染5 min的毛狀根誘導(dǎo)率有顯著差異，最早生根天數(shù)差異不大。這表明不同侵染時間對烏克蘭龍葵毛狀根的誘導(dǎo)存在較大影響。

表3不同侵染時間對烏克蘭龍葵毛狀根誘導(dǎo)率的影響

Table 3Effects of infection time on the induction rate of hairy roots of UkraineS.nigrum

侵染時間Infectiontimemin最早生根天數(shù)Earliestrootingdays∥d供試外植體數(shù)Numberoftestedexplants∥個生根外植體數(shù)Numberofrootingexplants∥個誘導(dǎo)率Inductionrate∥%57301653.310730723.315630310.0

2.4不同預(yù)培養(yǎng)時間對烏克蘭龍葵毛狀根誘導(dǎo)率的影響由表4可知，預(yù)培養(yǎng)2 d時葉片誘導(dǎo)率最高，為50.0%；不進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)的葉片誘導(dǎo)率最低，為33.3%；預(yù)培養(yǎng)3、4 d后葉片誘導(dǎo)率逐漸下降，分別為40.0%和36.7%。觀察發(fā)現(xiàn)，預(yù)培養(yǎng)3 d后的葉片慢慢變黃，生命活力減弱，且最早生根天數(shù)無明顯差異。這表明預(yù)培養(yǎng)時間過長過短均不利于馬克蘭龍葵毛狀根的誘導(dǎo)。

注：a.A4；b.C58C1；c.A1476。Note: a.A4；b.C58C1；c.A1476. 圖2　不同發(fā)根農(nóng)桿菌誘導(dǎo)毛狀根情況Fig.2　Situation of hairy roots of Ukraine S. nigrum induced by agrobacterium rhizogenes

Table 4Effects of precultivation days on the induction rate of hairy roots of UkraineS.nigrum

預(yù)培養(yǎng)天數(shù)Precultivationdaysd最早生根天數(shù)Earliestrootingdays∥d供試外植體數(shù)Numberoftestedexplants∥個生根外植體數(shù)Numberofrootingexplants∥個誘導(dǎo)率Inductionrate∥%06301033.317301446.726301550.036301240.047301136.7

2.5不同菌液濃度對烏克蘭龍葵毛狀根誘導(dǎo)率的影響由表5可知，菌液濃度OD600為0.6時，葉片誘導(dǎo)率最高，為56.7%；OD600為0.3和0.9時，誘導(dǎo)率分別為33.3%和13.3%。由此可知，菌液濃度過低或過高均影響誘導(dǎo)率，且高濃度誘導(dǎo)率較低。這表明菌液濃度對烏克蘭龍葵毛狀根的誘導(dǎo)存在一定的影響。

表5不同菌液濃度對烏克蘭龍葵毛狀根誘導(dǎo)率的影響

Table 5Effects of bacterial concentration on the induction rate of hairy roots of UkraineS.nigrum

菌液濃度BacterialconcentrationOD600最早生根天數(shù)Earliestrootingdays∥d供試外植體數(shù)Numberoftestedexplants∥個生根外植體數(shù)Numberofrootingexplants∥個誘導(dǎo)率Inductionrate∥%0.37301033.30.66301756.70.9630413.3

2.6不同共培養(yǎng)時間對烏克蘭龍葵毛狀根誘導(dǎo)率的影響由表6可知，共培養(yǎng)2 d時葉片的誘導(dǎo)率最高，為53.3%；葉片的誘導(dǎo)率隨著共培養(yǎng)時間的延長呈先增后減的趨勢。共培養(yǎng)4 d的葉片逐漸開始變黃，失去活力而死亡，最早生根天數(shù)無明顯差異。這表明共培養(yǎng)天數(shù)對烏克蘭龍葵毛狀根的誘導(dǎo)存在一定的影響。

2.7烏克蘭龍葵毛狀根的PCR檢測結(jié)果由圖3可知，利用發(fā)根農(nóng)桿菌誘導(dǎo)的毛狀根均擴(kuò)增出特異性條帶，而未轉(zhuǎn)化的烏克蘭龍葵根則未擴(kuò)增出條帶，表明發(fā)根農(nóng)桿菌的Ri質(zhì)粒DNA已整合入烏克蘭龍葵的毛狀根基因組中。

表6不同共培養(yǎng)時間對烏克蘭龍葵毛狀根誘導(dǎo)率的影響

Table 6Effects of cocultivation days on the induction rate of hairy roots of UkraineS.nigrum

共培養(yǎng)天數(shù)Cocultivationdays∥d最早生根天數(shù)Earliestrootingdays∥d供試外植體數(shù)Numberoftestedexplants∥個生根外植體數(shù)Numberofrootingexplants∥個誘導(dǎo)率Inductionrate∥%0630723.31730826.727301653.33630930.04730620.0

3結(jié)論與討論

合適的外植體是影響試驗結(jié)果的一個重要因素。當(dāng)細(xì)胞處于分裂期時才能與外源DNA整合[14]，由于幼嫩葉片處于旺盛的分裂期，所以該試驗選用烏克蘭龍葵葉片作為外植體，保證了發(fā)根農(nóng)桿菌與可被侵染細(xì)胞的接觸，增加了生根的幾率。

注：1、5、9為未轉(zhuǎn)化的烏克蘭龍葵根的陰性對照；2、3、4、6、7和8為轉(zhuǎn)化的烏克蘭龍葵毛狀根；10為Ri質(zhì)粒陽性對照。M為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)。Note: M. DNA Marker；1，5，9 were negative control of untransformed hairy roots of Ukraine S. nigrum；2，3，4，6，7 and 8 were transformed hairy roots of Ukraine S. nigrum；10 was positive control of Ri plasmid. 圖3　烏克蘭龍葵毛狀根PCR擴(kuò)增圖譜Fig.3　PCR amplification hairy roots of Ukraine S. nigrum

該試驗中3種發(fā)根農(nóng)桿菌A4、C58C1、A1476均能誘導(dǎo)烏克蘭龍葵外植體產(chǎn)生毛狀根，而非農(nóng)桿菌侵染的外植體則不能產(chǎn)生毛狀根，這可能是由于龍葵為雙子葉植物，對農(nóng)桿菌較為敏感，更容易與其發(fā)生作用，所以普通發(fā)根農(nóng)桿菌即可誘導(dǎo)出龍葵毛狀根。

該試驗結(jié)果表明，不同菌液濃度對毛狀根的誘導(dǎo)也存在影響。當(dāng)菌液濃度OD600為0.6時誘導(dǎo)率最高，濃度過低或過高誘導(dǎo)率反而下降。這可能是由于菌液濃度過低，菌液中的菌體數(shù)量較少，轉(zhuǎn)化的概率降低；菌液濃度過高，菌體活力下降，侵染能力降低。同時菌液過多會附著在外植體上，加速葉片老化，不易生根。

共培培養(yǎng)時間同樣是影響毛狀根誘導(dǎo)的一個因素。共培養(yǎng)時間較短不利于農(nóng)桿菌基因的轉(zhuǎn)化，共培養(yǎng)時間過長導(dǎo)致外植體營養(yǎng)的過度缺乏，細(xì)胞活力降低，影響毛狀根的生根率。適宜的共培養(yǎng)時間為2 d。

該試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，除菌培養(yǎng)基對毛狀根的生長有很大影響。在共培養(yǎng)過程中，農(nóng)桿菌會大量增殖，如不進(jìn)行除菌會影響毛狀根的正常生長，導(dǎo)致葉片褐化或死亡。但侵染后存活的葉片，均能長出毛狀根。在農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物基因轉(zhuǎn)化中，共培養(yǎng)后需要利用抑菌性抗生素除去殘留的農(nóng)桿菌[15]。培養(yǎng)基的除菌用抗生素是目前常用的除菌方法，抗生素濃度過低除菌效果較差，濃度過高也會影響外植體的生長進(jìn)而影響生根[16-17]。該試驗結(jié)果表明，當(dāng)共培養(yǎng)時間為2 d時，誘導(dǎo)效果較好，除菌MS培養(yǎng)基中加入頭孢噻肟鈉(400 mg/L)和羧芐青霉素(100 mg/L)，保證了毛狀根的正常生長。

毛狀根培養(yǎng)系統(tǒng)克服了植物生長緩慢、有效成分積累不足的缺陷，具有不依賴外源植物激素，次生代謝物質(zhì)合成能力較強(qiáng)，同時生產(chǎn)能力穩(wěn)定等優(yōu)點[18-19]。烏克蘭龍葵毛狀根誘導(dǎo)條件優(yōu)化，有利于研究龍葵次生代謝產(chǎn)物，同時也為毛狀根誘導(dǎo)提供了試驗基礎(chǔ)，利于天然藥物的開發(fā)利用，但毛狀根的擴(kuò)大培養(yǎng)還有待于進(jìn)一步研究。

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Optimization of Induction Condition of Hairy Roots of UkraineSolanumnigrumL.

LIU Qi, LIU Li-ye, LIU Jin-shuai, LI Xiu-xia*

(College of Life Sciences, Jiamusi University, Jiamusi, Heilongjiang 154007)

Abstract[Objective] To induce the hairy roots of Ukraine Solanum nigrum L. by the three agrobacterium rhizogenes A4, C58C1 and A1476, and to discuss the optimal condition of hairy roots induction of Ukraine S. nigrum. [Method] Using the plant tissue culture technology, we researched the effects of explants, strain, infection time, precultivation days, bacterium concentration and cocultivation days on the induction rate of hairy roots of Ukraine S. nigrum. [Result] Leaf was the best explants material；the three kinds of strains could all induce hairy root, but the highest was A4. The best bacterium concentration was OD600=0.6；the best time to infect was 5 min. Precultivation and cocultivation for 2 d could obtain the maximum induction rate.[Conclusion] Optimizing the induction conditions of hairy root provides technical references for the hairy root induction of other plants, and offers experiment basis for the medicinal component production by hairy roots.

Key wordsHairy roots induction；Solanum nigrum L.；Agrobacterium rhizogenes；Condition optimization

基金項目佳木斯大學(xué)大學(xué)生科技創(chuàng)新重點項目(XSYZ2014-001)。

作者簡介劉琪(1994-)，男，黑龍江大慶人，本科生，專業(yè)：生物科學(xué)。*通訊作者，博士，教授，從事植物資源學(xué)與生物技術(shù)等研究。

收稿日期2016-02-08

中圖分類號S 567.21

文獻(xiàn)標(biāo)識碼A

文章編號0517-6611(2016)08-128-04