李曉麗，周斌雄，張 怡，姚炎明，何 勇*

1. 浙江大學生物系統(tǒng)工程與食品科學學院，浙江 杭州 310058 2. 浙江大學農學院茶學系，浙江 杭州 310058 3. 浙江大學港口、海岸及近海工程研究所，浙江 杭州 310058

基于共聚焦顯微拉曼光譜的毛竹細胞結構和成分研究

李曉麗1，周斌雄1，張 怡2，姚炎明3，何 勇1*

1. 浙江大學生物系統(tǒng)工程與食品科學學院，浙江 杭州 310058 2. 浙江大學農學院茶學系，浙江 杭州 310058 3. 浙江大學港口、海岸及近海工程研究所，浙江 杭州 310058

采用共聚焦顯微拉曼光譜對毛竹薄壁細胞、薄壁纖維過渡細胞和纖維細胞進行研究。通過構建偏最小二乘(PLS)定量區(qū)分模型來對這三種細胞中的差異進行分析，結果表明，該區(qū)分模型的建模和交互驗證決定系數(R2)分別為0.810和0.800，均方根誤差(RMSE)分別為0.323和0.332。根據這一模型的回歸系數，發(fā)現三種細胞的區(qū)別主要體現在1 095，1 319和1 636 cm-1三個波數，這三個波數分別為纖維素、半纖維素和木質素的指紋特征峰。以這三個波數為自變量建立多元線性回歸(MLR)模型，該回歸模型的建模和交互驗證決定系數(R2)分別為0.644和0.643，均方根誤差(RMSE)分別為0.442和0.443，表明三種細胞在這三個波數處存在明顯的差異。對小波變換基線消除后的拉曼光譜信號進行化學成像分析，結果顯示，纖維素微纖維與纖維軸成一個很大的角度，這一結構有利于提高細胞的彈性模量和硬度。半纖維素和纖維素微纖維通過氫鍵相連，并在范德華力的作用下緊密地結合在一起，因此在拉曼化學成像中可以看到半纖維素和纖維素有相似的分布規(guī)律。三種細胞的細胞角和胞間層都高度的木質化，從細胞壁外層到內層木質化程度逐漸降低，表明細胞壁的木質化從細胞角和胞間層開始，且木質化程度并不完全。

毛竹； 纖維細胞； 薄壁細胞； 共聚焦顯微拉曼光譜； 小波變換

引 言

中國是世界上竹類資源最多，分布最廣的國家之一。隨著木材資源的匱乏，竹材成為造紙、紡織和板材的重要原材料。為了更好、更有效地利用竹材，需要對毛竹的結構和成分進行更深入的研究[1]。

竹子是單子葉植物，能夠快速地伸長，卻缺少維管束形成層，不存在二次增厚過程，這造成了竹稈的細長和中空[2]。和木材相比，竹材的強度更高、韌性更好、硬度更大，這些特性主要是由分散在傳輸單元周圍纖維帽中的纖維決定的。

Zou[3]對毛竹纖維進行研究，發(fā)現纖維由直徑在21～198 nm之間的鵝卵石般的纖維素顆粒構成，這使毛竹變得柔軟、不易碎。Wang[4]運用拉曼成像技術和納米壓痕技術對毛竹維管束區(qū)域進行了研究，發(fā)現毛竹纖維的纖維素纖維絲幾乎都是軸向的，這增大了纖維彈性模量的臨界閾值，有助于提高細長毛竹莖部的抗彎性。然而，還沒有學者通過毛竹內部細胞的差異，來對毛竹纖維的成分和結構進行研究。

共聚焦顯微拉曼光譜技術是拉曼光譜分析技術與顯微分析技術的有機結合，能對細胞結構進行原位、無損的檢測，避免了傳統(tǒng)化學檢測方法對組織結構的破壞[5]?；诶庾V的化學成像技術，能夠在原始狀態(tài)下，直接顯示細胞中的化學信息[6]。目前，這一方法被廣泛地運用于植物細胞的成分和結構的研究中[7]。

利用拉曼光譜技術結合偏最小二乘法，對毛竹薄壁細胞(PAC)、薄壁纖維過渡細胞(TC)和纖維細胞(FC)進行定量區(qū)分，來探究這三種組織在成分和結構上的差異； 并通過回歸系數分析，探索造成這三種細胞差異的主要成分。然后運用小波變換方法去除拉曼光譜中熒光背景的干擾，并基于小波重構信號進行化學成像分析。

1 實驗部分

1.1 植物材料和標準品

毛竹試材采自浙江省麗水市景寧畬族自治縣毛垟村，地處東經119°23′，北緯27°43′，海拔325 m； 屬亞熱帶季風氣候，溫暖濕潤、雨量充沛、四季分明。取1年生毛竹1株，截取基部起第二個竹節(jié)，風干，自竹節(jié)頂部向下1/3處向下取1 cm，并將其去除竹青和竹黃，將竹中部分用旋轉切片機沿橫向切成10 μm的小薄片，置于載玻片上，滴上一滴清水，再蓋上蓋玻片，供拉曼光譜采集使用。

阿魏酸(Ferulic acid)，別名 反式-4-羥基-3-甲氧基肉桂酸，購于sigma公司，產品編號128708。對香豆酸(p-Coumaric acid)，別名反式對羥基肉桂酸，購于sigma公司，產品編號C9008。

1.2 拉曼光譜采集

采用雷尼紹共聚焦顯微拉曼光譜儀(in Via-Reflex 532/ XYZ)進行拉曼光譜采集。將制好的毛竹切片固定在顯微拉曼光譜儀物鏡下方載物臺上，激光束通過20X的物鏡聚焦到樣本的表面。運用“WIRE”軟件進行參數設置，設置曝光時間2 s，激光強度是50 mV，累計次數2次，拉曼光譜采集范圍為229.6～2 803.6 cm-1，整個實驗過程都在恒溫(約25 ℃)條件下進行。

運用“WiRE”軟件進行圖像采集區(qū)域設定。用矩形來選擇掃描區(qū)域，設定掃描步長為1.5 μm，以獲得高分辨率的拉曼光譜成像。圖1(a)是5X物鏡下的毛竹維管束組織，包括了用于光譜采集的三種細胞區(qū)域，其中黑色方框內為PAC，紅色方框內為TC，藍色方框內為FC。圖1(b)是20X物鏡下的PAC的掃描區(qū)域，包含51×24矩形區(qū)域的1 224個點； 圖1(c)是20X物鏡下的TC的掃描區(qū)域，包含51×20矩形區(qū)域的1020個點； 圖1(d)是20X物鏡下的是FC的掃描區(qū)域，包含25×19矩形區(qū)域的475個點。

Fig.1 (a) Vasculer bundle of moso bamboo including parenchyma cell (PAC), transition tissue between parenchyma cell and fiber cell (TC) and fibre cell (FC); (b) Enlarged view of PAC; (c) Enlarged view of TC; (d) Enlarged view of FC

1.3 數據處理

利用Unscrambler化學計量學軟件包對三種細胞共2 719個樣本的拉曼光譜曲線進行定量區(qū)分，PAC，TC和FC的類別屬性分別設定為1，2和3，用偏最小二乘回歸模型(PLS)和交互驗證方式建立定量區(qū)分模型[8]。篩出特征波數為自變量，以三種細胞的類別屬性為因變量，建立多元線性回歸模型(MLR)[9]。PLS和MLR的模型性能主要通過決定系數和均方根誤差來評價，決定系數越高，均方根誤差越低，表明模型的性能越好。

2 結果與討論

2.1 背景信號的消除和拉曼光譜的分析

本實驗中背景信號主要是由載玻片和蓋玻片引起的，圖2中背景信號即是不包括樣本的載玻片和蓋玻片的拉曼響應特性，樣本信號是以薄壁細胞為例的1 224個樣本的平均拉曼光譜譜線。從圖2(a)背景信號和樣本信號的對比中可以看到，樣本信號主要在波數800～1 750 cm-1范圍有明顯的峰值，將其放大后如圖2(b)所示。從圖2(b)中可以看到，樣本信號和背景信號在波數1 456～1 477和1 513～1 544 cm-1范圍存在波峰重合，這些波峰會影響定量區(qū)分模型的區(qū)分結果，需要通過去除含有相同峰值的區(qū)域來消除背景信號的干擾[4]，因此將這些波段剔除后再進行定量分析。

Fig.2 Raman spectra of sample and background in full-range (a) and enlarged (b) graph

從圖2(b)中可以發(fā)現，樣本在波數1 179，1 608和1 636 cm-1處有非常明顯的拉曼峰。Heitner[10]指出毛竹木質素的拉曼峰值主要位于波數1 604和1 630 cm-1處，主要是由自由的和酯化了的酚醛樹脂引起的。實驗中分別對阿魏酸和對香豆酸的標準品進行拉曼光譜采集，將采集到的光譜以最大值為參照進行歸一化處理，處理后的結果如圖3所示。從圖3中可以看到，PAC和阿魏酸以及對香豆酸在1 179，1 608和1 636 cm-1三個波數附近都有明顯的峰值，這與Cyril的結果一致，表明樣本中1 179，1 608和1 636 cm-1三個波數屬于包含酚酸的木質素彎曲振動。同時，樣本在波數1 095和1 319 cm-1處也有明顯的拉曼峰。Edwards[11]研究發(fā)現1 095 cm-1是屬于纖維素中C—O—C的彎曲振動。Himmelsbach[12]對買自Megazyme的木葡聚糖和阿拉伯聚糖標準品進行了拉曼光譜掃描，發(fā)現木葡聚糖分子和阿拉伯聚糖分子在1 319 cm-1處有明顯的拉曼峰，這一波數屬于半纖維素中OH/CH和CH/CH2的彎曲振動。因此，樣本中1 095和1 319 cm-1兩個波數分別屬于纖維素和半纖維素的彎曲振動。

Fig.3 Normalized raman spectra: (a) ferulic acid, (b)p-Coumaric acid, (c) parenchyma cell (PAC)

2.2 偏最小二乘定量區(qū)分和多元線性回歸模型

為了獲取PAC，TC和FC的差異，對三種細胞進行定量區(qū)分，對三種細胞的樣本在波數800～1 455，1 478～1 512和1 545～1 750 cm-1范圍內的拉曼光譜進行偏最小二乘回歸分析。分析結果表明，三種細胞區(qū)分模型的建模和交互驗證決定系數(R2)分別為0.810和0.800，均方根誤差(RMSE)分別為0.323和0.332，其中建模和交互驗證的散點分布圖如圖4所示。

Fig.4 Calibration and validation results of the PLS

為了進一步分析對于區(qū)分起重要作用的波數，對該回歸模型的回歸系數進行分析，模型的回歸系數越大，表明這一回歸系數對應的拉曼峰值對于區(qū)分越重要[13-14]。因此，通過對回歸系數的分析，可以得到對于區(qū)分PAC，TC和FC的重要拉曼峰值，同時由于拉曼具有指紋特征響應性，所以根據這些峰值可以得到影響這三種細胞差異的主要化學成分。圖5顯示了PLS模型的回歸曲線，從中可以看到在波數1 095，1 319和1 636 cm-1處有很高的系數，表明三種細胞在這三處拉曼峰值有明顯的差異。為了進一步評估這三個波數對于區(qū)分模型的作用，以波數1 095，1 319和1 636 cm-1為自變量建立MLR模型，其建模和交互驗證的散點分布如圖6所示?；貧w模型的建模和交互驗證決定系數(R2)分別為0.644和0.643，均方根誤差(RMSE)分別為0.442和0.443，表明這三種細胞在波數1 095，1 319和1 636 cm-1處存在明顯的差異。

Fig.5 Regression coefficient of the PLS

Fig.6 Calibration and validation results of the MLR

2.3 小波變換

拉曼光譜中存在明顯的熒光和噪聲干擾，而小波變換能夠有效地去除這些干擾，目前已被用于拉曼光譜的處理。運用Matlab 小波分析工具箱，采用db1小波基函數分別對三種細胞共2 719個拉曼譜線進行離散小波變換(DWT)和離散小波系數重構(IDWT)。以PAC樣本為例的小波分解和重構結果如圖7所示。圖7(a)顯示小波處理前的光譜信號，從中可以看到明顯的熒光信號。圖7(b), (c), (d)分別表示一、二和三水平的高頻信號，圖7(e)表示三水平低頻信號(a3)。通過圖7(b), (c), (d), (e)的對比可以看到，d3在保留了PAC光譜中的重要峰值信息的同時排除了熒光信號的干擾。對d3進行小波系數重構得到D3，結果如圖7(f)所示。

2.4 毛竹成分的拉曼光譜成像分析

通過PLS模型和MLR模型，已經得到了區(qū)分三種細胞的特征波數。為了分析這三個特征波數對應的化學成分在組織中的空間分布情況，對PAC，TC和FC分別在波數1 095，1 319和1 636 cm-1處進行積分成像。將三水平分解重構后(D3)的光譜數據用于拉曼化學成像，成像結果如圖8所示。

Fig.7 DWT and IDWT of parenchyma cell (PAC)

從圖8中光學顯微鏡圖和拉曼化學成像圖的對比中可以看出，拉曼化學成像能夠將模糊的顯微圖像[特別是圖8(i)]清晰化，并能清晰地顯示細胞中化學成分的分布。從圖8(b)，(f)，(j)中細胞的胞腔內可以看到纖維素的存在，這主要是因為纖維素微纖維與纖維軸形成了一個很大的角度，這一結構極大地提高了細胞的彈性模量和硬度[4]。圖8(c)，(g)，(k)顯示半纖維素在細胞中的分布，這一分布與圖8(b)，(f)，(j)中纖維素的分布相似，這主要是因為半纖維素和纖維素微纖維通過氫鍵相連，并在范德華力的作用下緊密地結合在一起。從圖8(d)，(h)，(i)中可以看到木質素在細胞中的分布，其中細胞的細胞角(CC)和胞間層(CML)呈現高度的木質化，而且從細胞壁外層到內層木質化程度逐漸降低，這表明細胞壁的木質化從細胞角和胞間層開始，且木質化程度并不完全。

3 結 論

采用共聚焦顯微拉曼光譜技術研究了毛竹PAC，TC和FC的差別，研究表明拉曼光譜能夠對毛竹的細胞成分和結構進行無損檢測，并良好地區(qū)分這三種細胞。毛竹三種細胞的差異主要體現在波數1 095，1 319和1 636 cm-1處的拉曼峰值，對應的物質為纖維素、半纖維素和木質素。以這三個拉曼峰值進行拉曼光譜成像，發(fā)現毛竹維素微纖維與纖維軸構成一個很大的角度，這極大地提高了細胞的彈性模量和硬度。本工作將PLS和MLR的統(tǒng)計學方法和拉曼化學成像技術結合起來，有效地分析出三種毛竹細胞在化學成分和結構上的差異。

Fig.8 Optical microscope images of PAC (a), TNC (e) and TKC (i)； Raman chemical images of cells: (b), (f) and (j), intensity of pectin band of 1 095 cm-1; (c), (g) and (k), intensity of the Hemicellulose band of 1 319 cm-1; (d), (h) and (l), intensity of the Lignin band of 1 636 cm-1

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[2] Wang X, Keplinger T, Gierlinger N, et al. Annals of Botany, 2014, 114(8): 1627.

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[14] Wu D, Nie P, He Y, et al. Food and Bioprocess Technology, 2012, 5(4): 1402.

*Corresponding author

Revealing the Cell Structure and Formation of Bamboo with Confocal Raman Microscopy

LI Xiao-li1, ZHOU Bin-xiong1, ZHANG Yi2, YAO Yan-ming3, HE Yong1*

1. College of Biosystems Engineering and Food Science，Zhejiang University，Hangzhou 310058，China 2. Department of Tea Science, Zhejiang University, Hangzhou 310058, China 3. Institute of Harbor Coastal and Nearshore Engineering，Zhejiang University，Hangzhou 310058，China

Parenchyma cell (PAC), transition tissue between parenchyma cell and fiber cell (TC) and fibre cell (FC) of bamboo were studied by confocal Raman microscopy in this paper. Partial least squares regression was applied to establish a quantitative differentiation model for the three types of cells. The result showed that the determination coefficients (R2) of calibration and validation were respectively 0.810 and 0.800, and the root mean square error (RMSE) were respectively 0.323 and 0.332. What’s more, three raman bands of 1 095, 1 319 and 1 636 cm-1, verified to the characteristic peaks of pectin, hemicellulose and lignin, were found to be the important bands for the differentiation. Subsequently, these three raman bands were used to establish a multiple linear regression (MLR) model, and the determination coefficients(R2) of calibration and validation of the model were respectively 0.644 and 0.643, and the root mean square error (RMSE) were respectively 0.442 and 0.443. This result showed that there existed obvious difference among the three types of cells in these three raman bands. Finally, the raman spectral signal processed by wavelet transform to eliminate baseline were used to chemical imaging analysis. These results showed a rather large microfibril angle between cellulose fibrils and fibre axis, which contributed to higher modulus and hardness of cells. Hemicellulose and cellulose have similar distribution in the raman chemical image, due to the connection of hemicellulose and cellulose microfiber through hydrogen bond and the closely combination under the action of van der Waals force. The cell corners (CC) and compound middle lamella (CML) were heavily lignified, and a gradual decrease of lignification from the outer layer to the inner layer of the three cells indicate that lignification was first occurred at the CC and CML, and the lignification was not fully completed.

Bamboo； Fibre cell; Parenchyma cell; Confocal Raman microscopy; Wavelet Transform

Nov. 19, 2014; accepted Mar. 24, 2015)

2014-11-19，

2015-03-24

2014年度浙江省公益性技術應用研究計劃項目(2014C32091)，國家自然科學基金項目(61201073，31471417)資助

李曉麗，女，1982年生, 浙江大學生物系統(tǒng)工程與食品科學學院副教授 e-mail: xiaolili@zju.edu.cn *通訊聯(lián)系人 e-mail: yhe@zju.edu.cn

O657.3

A

10.3964/j.issn.1000-0593(2016)02-0413-06